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Artículo de método

Una ventana permanente para investigar la metástasis del cáncer en el pulmón

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DOI:

10.3791/62761

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1 de julio de 2021

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1Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Integrated Imaging Program, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Cente, 5Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanentemente permanente para el tórax murino, que permite obtener imágenes intravitales de alta resolución del pulmón. La permanencia de la ventana la hace muy adecuada para el estudio de los procesos celulares dinámicos en el pulmón, especialmente aquellos que evolucionan lentamente, como la progresión metastásica de las células tumorales diseminadas.

Resumen

La metástasis, que representa ~ 90% de la mortalidad relacionada con el cáncer, implica la propagación sistémica de las células cancerosas desde tumores primarios a sitios secundarios como el hueso, el cerebro y el pulmón. Aunque ampliamente estudiados, los detalles mecanicistas de este proceso siguen siendo poco conocidos. Si bien las modalidades de imágenes comunes, incluida la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM), ofrecen diversos grados de visualización macroscópica, cada una carece de la resolución temporal y espacial necesaria para detectar la dinámica de las células tumorales individuales. Para abordar esto, se han descrito numerosas técnicas para la obtención de imágenes intravitales de sitios metastásicos comunes. De estos sitios, el pulmón ha demostrado ser especialmente difícil de acceder para las imágenes intravitales debido a su delicadeza y papel crítico en el mantenimiento de la vida. Aunque se han descrito previamente varios enfoques para la obtención de imágenes intravitales unicelulares del pulmón intacto, todos implican procedimientos altamente invasivos y terminales, lo que limita la duración máxima posible de la imagen a 6-12 h. Aquí se describe una técnica mejorada para la implantación permanente de una ventana óptica torácica mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL). Combinada con un enfoque adaptado a la microcartografía, la innovadora ventana óptica facilita la obtención de imágenes intravitales en serie del pulmón intacto a resolución de una sola célula en múltiples sesiones de imágenes y que abarcan varias semanas. Dada la duración sin precedentes durante el cual se pueden recopilar datos de imágenes, el WHRIL puede facilitar el descubrimiento acelerado de los mecanismos dinámicos subyacentes a la progresión metastásica y numerosos procesos biológicos adicionales dentro del pulmón.

Introducción

Responsable de ~ 90% de las muertes, la metástasis es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer1. Entre los principales sitios de metástasis clínicamente observados (hueso, hígado, pulmón, cerebro)2, el pulmón ha demostrado ser particularmente desafiante para las imágenes in vivo a través de microscopía intravital. Esto se debe a que el pulmón es un órgano delicado en movimiento perpetuo. El movimiento continuo de los pulmones, agravado aún más por el movimiento cardíaco intratorácico, representa una barrera sustancial para obtener imágenes precisas. Por lo tanto, debido a su relativa inaccesibilidad a las modalidades de imágenes ópticas intravitales de alta resolución, el crecimiento del cáncer dentro del pulmón a menudo se ha considerado un proceso oculto3.

En el entorno clínico, las tecnologías de imagen como la tomografía computarizada (TC), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética (IRM) permiten la visualización en lo profundo de órganos vitales intactos como el pulmón4. Sin embargo, si bien estas modalidades proporcionan excelentes vistas del órgano grueso (a menudo incluso revelando patología antes de la aparición de los síntomas clínicos), son de resolución inadecuada para detectar células tumorales diseminadas individuales a medida que avanzan a través de las primeras etapas de la metástasis. En consecuencia, en el momento en que las modalidades antes mencionadas proporcionan cualquier indicación de metástasis al pulmón, los focos metastásicos ya están bien establecidos y proliferan. Dado que el microambiente tumoral juega un papel fundamental en la progresión del cáncer y la formación de metástasis5,6, existe un gran interés en investigar los primeros pasos de la siembra metastásica in vivo. Este interés se alimenta aún más por la mayor apreciación de que las células cancerosas se diseminan incluso antes de que se detecte el tumor primario7,8 y la creciente evidencia de que sobreviven como células individuales y en un estado latente durante años o décadas antes de crecer en macrometástasis9.

Anteriormente, la obtención de imágenes del pulmón a resolución unicelular ha implicado necesariamente preparaciones ex vivo o explante10,11,12,13,limitando los análisis a puntos de tiempo únicos. Si bien estas preparaciones proporcionan información útil, no proporcionan ninguna idea de la dinámica de las células tumorales dentro del órgano conectado a un sistema circulatorio intacto.

Los recientes avances tecnológicos en imágenes han permitido la visualización intravital del pulmón intacto a resolución unicelular durante períodos de hasta 12 h14,15,16. Esto se logró en un modelo murino utilizando un protocolo que involucró ventilación mecánica, resección de la caja torácica e inmovilización pulmonar asistida por vacío. Sin embargo, a pesar de ofrecer las primeras imágenes de resolución celular única del pulmón fisiológicamente intacto, la técnica es altamente invasiva y terminal, lo que impide más sesiones de imágenes más allá del procedimiento índice. Esta limitación, por tanto, impide su aplicación al estudio de pasos metastásicos que tardan más de 12 h, como la latencia y el reinicio del crecimiento14,15,16. Además, los patrones de comportamiento celular observados utilizando este enfoque de imágenes deben interpretarse con cautela, dado que es probable que los diferenciales de presión inducidos por el vacío causen desviaciones en el flujo sanguíneo.

Para superar estas limitaciones, recientemente se desarrolló una Ventana mínimamente invasiva para imágenes de alta resolución del pulmón (WHRIL), que facilita la obtención de imágenes en serie durante un período prolongado de días a semanas, sin necesidad de ventilación mecánica17. La técnica consiste en la creación de una "caja torácica transparente" con una cavidad torácica sellada para la preservación de la función pulmonar normal. El procedimiento es bien tolerado, lo que permite que el ratón se recupere sin alteraciones significativas en la actividad y función basales. Para localizar de forma fiable exactamente la misma región pulmonar en cada sesión de imagen respectiva, se aplicó a esta ventana una técnica conocida como microcartografía18. A través de esta ventana, fue posible capturar imágenes de células a medida que llegan al lecho vascular del pulmón, cruzan el endotelio, se dividen celularmente y crecen en micrometástasis.

Aquí, el estudio presenta una descripción detallada de un protocolo quirúrgico mejorado para la implantación del WHRIL, que simplifica la cirugía al tiempo que aumenta su reproducibilidad y calidad. Si bien este protocolo fue diseñado para permitir la investigación de los procesos dinámicos subyacentes a la metástasis, la técnica puede aplicarse alternativamente a las investigaciones de numerosos procesos de biología y patología pulmonar.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se han realizado de acuerdo con las pautas y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluida la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina Albert Einstein.

1. Pasivación de ventanas

  1. Enjuague los marcos ópticos de las ventanas (Figura suplementaria 2) con una solución al 1% (p/v) de detergente enzimáticamente activo.
  2. Dentro de un frasco de vidrio, sumerja los marcos ópticos de las ventanas en una solución de hidróxido de sodio al 5% (p/v) durante 30 min a 70 °C.
  3. Retire y lave los marcos de las ventanas con agua desionizada.
  4. Dentro de un frasco de vidrio nuevo, sumerja los marcos ópticos de las ventanas en una solución de ácido cítrico al 7% (p/v) durante 10 min a 55 °C.
  5. Una vez más, retire y lave los marcos de las ventanas con agua desionizada.
  6. Repita el paso 1.2; luego, retire y lave los marcos de las ventanas con agua desionizada.

2. Preparación para la cirugía

  1. Realice la cirugía en una campana o gabinete de flujo laminar. Para evitar la contaminación del campo operatorio, asegure áreas distintas y separadas para la preparación, la cirugía y la recuperación, respectivamente.
  2. Antes de la cirugía, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en un autoclave. Si se planean procedimientos posteriores, vuelva a esterilizar los instrumentos con un esterilizador de cuentas calientes. Para este procedimiento quirúrgico, se utiliza una técnica de solo puntas.
  3. Encienda el esterilizador de cuentas y cuentas quirúrgicas calentadas.
  4. Anestesiar al ratón con 5% de isoflurano en la cámara de anestesia.
  5. Para eliminar el vello, aplique generosamente crema depilatoria en el sitio de la incisión torácica superior izquierda. Después de no más de 20 s, limpie firmemente el cabello y la crema depilatoria con papel de seda humedecido. Repetir según sea necesario para eliminar todo el vello del sitio quirúrgico.
  6. Usando sutura de seda 2-0, ate un nudo en la base de un catéter de 22 G, dejando colas largas de 2 pulgadas (ver Figura 1A).

3. Cirugía de la ventana pulmonar

  1. Lávese las manos con jabón antiséptico.
  2. Antes de cada nueva cirugía, póngase guantes estériles nuevos.
  3. Para evitar el secado corneal y el daño a los ojos del ratón, aplique ungüento oftálmico en ambos ojos.
  4. Diluir 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina en 90 μL de PBS estéril, y luego inyectar por vía subcutánea para asegurar la analgesia preoperatoria.
  5. Intubar al ratón con el catéter de 22 G atado a sutura de seda15. Usando una bombilla de inflado, confirme la intubación exitosa observando el aumento bilateral del pecho al apretar la bombilla.
  6. Asegure el catéter de intubación atando la sutura de seda 2-0 alrededor del hocico del ratón (ver Figura 1B).
  7. Coloque el ratón en el soporte quirúrgico calentado y colóquelo en el decúbito lateral derecho para exponer el tórax izquierdo.
  8. Conecte el ventilador al catéter de intubación.
  9. Asegure una ventilación controlada y estable en el ventilador y luego reduzca el isofluorano al 3%. Al inicio del procedimiento y periódicamente durante toda la duración del procedimiento, evalúe la adecuación de la anestesia mediante la realización de una prueba de pellizco del dedo del pie.
  10. Usando cinta de papel, asegure craneal y caudalmente las extremidades delanteras y traseras, respectivamente, a la etapa quirúrgica calentada. Coloque otro trozo de cinta adhesiva a lo largo de la espalda del ratón para maximizar la exposición al campo quirúrgico (ver Figura 1C).
  11. Abra todos los instrumentos quirúrgicos debajo del capó para la preservación de la esterilidad.
  12. Esterilizar el sitio quirúrgico mediante una generosa aplicación de antiséptico a la piel del ratón.
  13. Usando fórceps, levante la piel y haga una incisión circular de ~ 10 mm, ~ 7 mm a la izquierda del esternón y ~ 7 mm superior al margen subcostal (Figura 1D).
  14. Identifique cuidadosamente cualquier buque importante. Si es necesaria la división de vasos, cauterizar en ambos extremos con la pluma de electrocauterización para mantener la hemostasia.
  15. Extirpar el tejido blando que recubre las costillas.
  16. Eleve la6ª o 7ª costilla usandofórceps. Usando una sola cuchilla de las tijeras de microdisección roma, el lado redondeado hacia el pulmón, perfore cuidadosamente el músculo intercostal entre las costillas6 y7 para ingresar al espacio intratorácico(Figura 1E).
  17. Descargue delicadamente el bote de aire comprimido en el defecto para colapsar el pulmón y separarlo de la pared torácica. Dispare el aire comprimido en ráfagas cortas para evitar lesiones pulmonares iatrogénicas.
  18. Coloque la punción de biopsia sobre la herramienta de corte (Figura suplementaria 1) y maniobre cuidadosamente la base de la herramienta de corte a través de la incisión intercostal (Figura 1F).
  19. Oriente la base de la herramienta de corte de tal manera que esté paralela a la pared torácica. Perforar un orificio circular de 5 mm a través de la caja torácica (Figura 1G).
    NOTA: Asegúrese de que el tejido pulmonar expuesto sea rosado, sin signos de daño.
  20. Usando la sutura de seda 5-0, cree una puntada de cuerda de bolso ~ 1 mm desde el agujero, circunferencialmente, entrelazada con las costillas (Figura 1H).
  21. Coloque el marco de la ventana de tal manera que los bordes del defecto circular se alineen dentro de la ranura de la ventana (consulte la Figura 1I).
  22. Bloquee de forma segura la ventana implantada atando firmemente la sutura de seda 5-0.
  23. Cargue 100 μL de adhesivo de gel de cianoacrilato en la jeringa de 1 ml.
  24. Seque el pulmón aplicando un flujo suave y constante de aire comprimido durante ~ 10-20 s(Figura 1J).
  25. Usando pinzas para agarrar el marco de la ventana por su borde exterior, levante suavemente para garantizar la separación del pulmón de la superficie inferior del marco de la ventana.
  26. Dispensar una capa delgada de adhesivo de cianoacrilato a lo largo de la superficie inferior del marco óptico de la ventana(Figura 1K).
  27. Aumente la presión positiva al final de la espiración (PEEP) en el ventilador para inflar el pulmón.
  28. Sosteniendo durante 10-20 s, aplique una presión suave pero firme para fijar el marco de la ventana óptica al tejido pulmonar (Figura 1L).
  29. Dispense una gota de 5 mm del adhesivo de gel de cianoacrilato restante en una funda rectangular.
  30. Recoge la cubierta de 5 mm con pastillas de vacío. Sumerja la superficie inferior de la cubierta en el adhesivo y luego raspe el exceso de adhesivo tres veces contra el lado de la cubierta rectangular, de modo que solo quede una capa muy delgada(Figura 1M).
  31. Coloque cuidadosamente la cubierta para que quepa dentro del hueco en el centro del marco de la ventana óptica y se mantenga por encima del tejido pulmonar en ángulo. Sujete brevemente el ventilador para generar presión positiva, hiperinflando el pulmón. Usando un movimiento giratorio, oriente la cubierta paralela al tejido pulmonar para crear una aposición directa entre la superficie del pulmón y la superficie inferior de la cubierta. Mantenga una presión suave, permitiendo que el adhesivo de cianoacrilato se fije (~ 25 s).
  32. Utilice las pinzas para separar la cubierta de las pastillas de vacío (Figura 1N).
  33. Usando sutura de seda 5-0, vuelva a crear una puntada de cuerda de bolso, esta vez <1 mm circunferencialmente desde el borde de corte de la incisión de la piel. Coloque cualquier exceso de piel debajo del borde exterior del marco de la ventana antes de atarlo firmemente con nudos de bloqueo.
  34. Para asegurar un sellado hermético entre la cubierta y el marco de la ventana, dispense una pequeña cantidad de cianoacrilato líquido en la interfaz metal-vidrio (ver Figura 1O).
  35. Coloque una aguja estéril en una jeringa de insulina de 1 ml. Inserte la aguja debajo de la apófisis xifoidea, avanzando hacia el hombro izquierdo, entrando en la cavidad torácica a través del diafragma. Retire suavemente la jeringa para eliminar el aire residual de la cavidad torácica (consulte la Figura 1P).
  36. Retire la cinta del ratón.
  37. Apague el isoflurano.
  38. Continúe la ventilación con oxígeno al 100% hasta que el ratón parezca listo para despertar.
  39. Corte cuidadosamente la sutura de seda 2-0 alrededor del hocico del ratón y extuba al ratón.
  40. Transfiera el ratón a una jaula limpia y monitoree hasta que se recupere por completo. Eutanasiar al ratón si hay signos de dificultad para respirar.
  41. Proporcionar analgesia postoperatoria inyectando por vía subcutánea 10 μL (0,1 mg/kg) de buprenorfina diluida en 90 μL de solución tamponada con fosfato estéril (PBS).

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Resultados

Los pasos del procedimiento quirúrgico descritos en este protocolo se resumen e ilustran en la Figura 1. Brevemente, antes de la cirugía, los ratones son anestesiados y se elimina el vello sobre el tórax izquierdo. Los ratones son intubados y ventilados mecánicamente para permitir la supervivencia tras la ruptura de la cavidad torácica. Se extirpa el tejido blando que recubre las costillas y se crea un pequeño defecto circular, que abarca las costillas6 y7. El marco ópt...

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Discusión

En sitios de metástasis a distancia, como el pulmón, las imágenes ópticas de alta resolución proporcionan información sobre la dinámica elaborada de la metástasis de las células tumorales. Al permitir la visualización in vivo de células cancerosas individuales y sus interacciones con el tejido huésped, las imágenes intravitales de alta resolución han demostrado ser fundamentales para comprender los mecanismos subyacentes a la metástasis.

Aquí se describe un protocolo quirúrgico mejora...

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Divulgaciones

Los autores no revelan conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: CA216248, CA013330, Ruth L. Kirschstein T32 Training Grant CA200561 de Montefiore, METAvivor Early Career Award, el Centro de Biofotónica Gruss-Lipper y su Programa integrado de imágenes, y Jane A. y Myles P. Dempsey. Nos gustaría agradecer al Centro de Imágenes Analíticas (AIF) en la Facultad de Medicina Einstein por el apoyo de imágenes.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución al 1% (p/v) de detergente enzimáticoAlconox IncN/A  detergente aniónico concentrado con enzima proteasa para limpieza manual y ultrasónica
2 µ m microesferas fluorescentesInvitrogenF8827
cubreobjetos de 5 mmElectrónica Microscopy Sciences72296-05
Solución al 5% (p/v) de hidróxido de sodioSigma-AldrichS8045
Isoflurano al 5%Henry Schein, Inc29405
5-0 seda trenzada con aguja de corte RB-1Ethicon, Inc.774B
Solución al 7% (p/v) de ácido cítricoSigma-Aldrich251275
8 mm marco de ventana de acero inoxidableN/AN/AHecho a medida, Figura suplementaria 2
9 cm 2-0 corbata de sedaEthicon, Inc.LA55G
5 mm punzón de biopsia desechableIntegra  33-35-SH
Tijeras de microdisección romasRobozRS-5980
Portaherramientas de ventana de latónN/AN/AHecho a medida, Figura complementaria 3
BuprenorfinaHospira0409-2012-32
Pluma de cauterizaciónBraintree ScientificGEM 5917
Gluconato de clorhexidina  Becton, Dickinson and Company260100ChloraPrep Un solo bastoncillo de 1,75 mL
Bidón de aire comprimidoFalconDPSJB-12
Adhesivo de cianoacrilatoHenkel AdhesivesLOC1363589
Iluminador de fibra ópticaO.C. White CompanyFL3000
Esterilizador de perlasCellPoint ScientificGER  5287-120VGerminador 500
Pinzas GraefeRobozRS-5135
Lámpara de calor infrarrojaBraintree ScientificHL-1
Jeringas de insulinaBecton Dickinson329424
Vaporizador de isofluranoSurgiVetVCT302
Portaagujas Jacobson con cerraduraKalson SurgicalT1-140
Aplicadores de punta larga de algodónMedline Industries MDS202055
NairChurch & Dwight Co., Inc.
Neomicina/polimixina B/bacitracinaJohnson & Johnson501373005Pomada antibiótica
Ungüento oftálmicoDechra Productos Veterinarios17033-211-38
Cinta de papelFisher ScientificS68702
Ventilador murinoKent ScientificPS-02PhysioSuite
Cubierta de vidrio rectangularCorning2980-225
Soportede intubación para roedoresBraintree ScientificRIS 100
Bulbo de inflado pulmonar para animales pequeñosHarvard Apparatus72-9083
Herramienta de corte de acero inoxidableN/AN/AHecho a medida, Figura suplementaria 1
Sulfametoxazol y Trimetoprim antibiótico oralHi-Tech Pharmacal Co.50383-823-16
SurgiSuite Plataforma quirúrgica multifuncional para ratones, con calentamientoKent ScientificSURGI-M02Plataforma quirúrgica calefactada
Catéter traquealExelint International26746Catéter de 22 G
Sistema de recogida de vacío sonda de metalTed Pella, Inc.528-112
40002957

Referencias

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