Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped

Resumen

La detección de interacciones entre el patógeno bacteriano huésped basada en la adherencia fenotípica utilizando imágenes de etiquetado de fluorescencia de alto rendimiento junto con métodos de análisis estadístico automatizados permite una evaluación rápida de las posibles interacciones bacterianas con las células huésped.

Resumen

La identificación de patógenos bacterianos emergentes es fundamental para la salud y la seguridad humanas. La adherencia bacteriana a las células huésped es un paso esencial en las infecciones bacterianas y constituye un sello distintivo de amenaza potencial. Por lo tanto, el examen de la adherencia de las bacterias a las células huésped se puede utilizar como un componente de la evaluación de la amenaza bacteriana. Un método estándar para enumerar la adherencia bacteriana a las células huésped es co-incubar bacterias con células huésped, cosechar las bacterias adherentes, colocar las células cosechadas en medios sólidos y luego contar las unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. Alternativamente, la adherencia bacteriana a las células huésped se puede evaluar utilizando enfoques basados en microscopía de inmunofluorescencia. Sin embargo, las estrategias convencionales para implementar estos enfoques consumen mucho tiempo y son ineficientes. Aquí, se describe un método de imágenes basado en microscopía de fluorescencia automatizada recientemente desarrollado. Cuando se combina con el procesamiento de imágenes de alto rendimiento y el análisis estadístico, el método permite una cuantificación rápida de las bacterias que se adhieren a las células huésped. Se probaron dos especies bacterianas, Pseudomonas aeruginosa Gram-negativa y Listeria monocytogenes Gram-positiva y los controles negativos correspondientes, para demostrar el protocolo. Los resultados muestran que este enfoque enumera de forma rápida y precisa las bacterias adherentes y reduce significativamente las cargas de trabajo y los plazos experimentales.

Introducción

La adhesión bacteriana es un proceso por el cual las bacterias se adhieren a otras células o superficies. El establecimiento exitoso de la infección por patógenos bacterianos requiere adhesión a las células huésped, colonización de los tejidos y, en algunos casos, invasión de las células huésped^1,2,3. Las enfermedades infecciosas emergentes constituyen importantes amenazas para la salud pública, como lo demuestra la reciente pandemia de COVID-19^4,5,6. Es importante destacar que los patógenos nuevos o emergentes pueden no discernirse fácilmente utilizando enfoques basados en la genómica, especialmente en los casos en que el patógeno ha sido diseñado para evadir la detección o no contiene firmas genómicas que lo identifiquen como patógeno. Por lo tanto, la identificación de patógenos potenciales utilizando métodos que evalúan directamente las características distintivas de la patogenicidad, como la adherencia bacteriana a las células huésped, puede desempeñar un papel crítico en la identificación de patógenos.

La adherencia bacteriana a las células huésped se ha utilizado para evaluar los mecanismos de patogénesis bacteriana durante décadas^1,7. Las imágenes microscópicas^8,9 y la enumeración de la unidad formadora de colonias bacterianas (UFC)^10,11,12,13 por recubrimiento posterior a la infección son dos métodos de laboratorio bien desarrollados para probar la adherencia microbiana y / o la infección de las células huésped¹⁴. Teniendo en cuenta el tamaño de escala micrométrica de las células bacterianas, la enumeración de las células bacterianas adherentes generalmente requiere el uso de técnicas avanzadas de microscopía de alto aumento, así como enfoques de imágenes de alta resolución, incluida la microscopía electrónica, la microscopía de expansión (ExM)^15,16y las imágenes tridimensionales¹⁷ . Alternativamente, la enumeración de bacterias unidas o internalizadas dentro de las células huésped se puede realizar enchapando la serie de dilución de bacterias cosechadas en agar sólido y contando las UFC resultantes^10,12,13. Este método es laborioso e incluye muchos pasos manuales, lo que introduce dificultades para establecer un procedimiento estandarizado o automatizado requerido para los análisis de alto rendimiento^18,19. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos métodos para evaluar la conexión de la célula huésped abordaría las limitaciones actuales en el campo.

Aquí se describe uno de estos métodos que utiliza microscopía automatizada de alto rendimiento, combinada con procesamiento de imágenes de alto rendimiento y análisis estadístico. Para demostrar el enfoque, se realizaron experimentos con varios patógenos bacterianos, incluido Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista de humanos, animales y plantas^14,20, que con frecuencia se encuentra colonizando el tracto respiratorio de pacientes con funciones de defensa del huésped deterioradas. Este enfoque optimizó el proceso de imagen microscópica descrito en estudios previos^14,20. La detección por imágenes se simplificó mediante células huésped y bacterias marcadas con fluorescencia para rastrear rápidamente la proximidad de ellas, lo que redujo drásticamente la carga de trabajo de microscopía para obtener imágenes de alta resolución para distinguir bacterias. Además, el análisis estadístico automatizado de imágenes en el conteo de células huésped y bacterias reemplazó el experimento práctico de recubrimiento de UFC bacteriana para estimar la proporción de recuentos bacterianos adherentes por célula huésped. Para confirmar la compatibilidad de este método, también se han probado múltiples cepas bacterianas y tipos de células huésped, como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Klebsiella pneumoniae, así como células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), y los resultados respaldan la diversidad y efectividad del método.

Protocolo

1. Cultivo celular A549

1. Mantener la línea celular A549 en medio F-12K suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% e incubar a 37 °C, 5% CO_2.
2. Cambiar el medio cada 3-4 días y pasar al 85%-95% de confluencia.
3. Brevemente, enjuague las células con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4, a menos que se indique lo contrario) y trate con 1 ml de solución de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) al 0,25% de tripsina-0,53 mM (sumergiendo la capa celular) durante aproximadamente 2 min a 37 °C.
4. Agregue 6 ml adicionales de medio de crecimiento completo (medio F-12K + 10% FBS) para detener la actividad de la proteasa. Luego, coloque las células en un matraz de cultivo de tejido T-75 de poliestireno estéril a una relación de subcultivo de 1: 3-1: 8. El volumen final de cultivo es de 12 mL.
5. Sembra aproximadamente 1 x 10⁴ células A549 (concentración celular: ~1 x 10⁵ células/ml) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos un día antes de los ensayos de adherencia.

2. Crecimiento bacteriano y tinción

1. Realizar todo el trabajo bacteriano en un Gabinete de Bioseguridad, Laboratorio de Bioseguridad Nivel 2.
2. Inocular todos los cultivos bacterianos, incluyendo P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes y B. subtilis, etc., del caldo de glicerol congelado y cultivarlos en caldo de soja tríptico (TSB, 3 mL) en una incubadora de agitación a 37 °C durante la noche mantenida a 250 rpm.
3. Al día siguiente, use una dilución 1:100 del cultivo nocturno para inocular un subcultivo y cultivarlos en TSB (1 mL) durante 3 h hasta la fase exponencial, mida el OD a 600 nm (OD₆₀₀₎para confirmar. Asegúrese de que el OD₆₀₀ esté en el rango de 0.4-0.6.
4. Antes de realizar el ensayo de adherencia bacteriano-huésped, diluciones en serie de placas de suspensión bacteriana en placas de Agar TSB, incube durante la noche a 37 ° C y luego establezca las UFC bacterianas a partir del número de colonias. Para P. aeruginosa, un OD₆₀₀ de 1.0 corresponde a 2 x 10⁸ células bacterianas viables/mL, y para L. monocytogenes, un OD₆₀₀ de 1.0 corresponde a 9 x 10⁸ células bacterianas viables/mL.
5. Cosechar los cultivos bacterianos en fase exponencial por centrifugación a 13.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente (RT), luego lavarlos una vez usando 1x PBS (1 mL). Resuspend los gránulos bacterianos en 1 mL de 1x PBS y determinar las concentraciones midiendo OD₆₀₀ de suspensiones bacterianas. Por ejemplo, P. aeruginosa con OD₆₀₀ de 0,5 representa una concentración de 1 x 10⁸ células bacterianas/ml.
6. Tiñe la suspensión bacteriana usando un tinte fluorescente verde o rojo en RT durante 30 minutos con una rotación suave en la oscuridad. Para esto, agregue 2 μL del tinte de tinción concentrado de stock 500 veces en 1 ml de suspensión bacteriana para diluir el tinte 1 veces. Para lavar el tinte de tinción, centrífuga las bacterias teñidas a 13,000 x g durante 2 min y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de 1x PBS por tres veces.
   NOTA: Si en el experimento se utilizan bacterias marcadas con fluorescencia (GFP, RFP, mCherry-, etc.), omita este paso de tinción bacteriana. En este protocolo se utilizaron P. aeruginosa marcada con GFP- y L. monocytogenes teñidas con colorante fluorescente rojo.
7. Recoger las células bacterianas teñidas o bacterias marcadas con GFP mediante centrifugación a 13.000 x g durante 2 min. Resuspendir en medio fresco F-12K (1 ml) y medir el OD₆₀₀ de cada cultivo. Diluir posteriormente los cultivos a las concentraciones deseadas en función de la multiplicidad de la infección (MOI) y la concentración de células huésped. El volumen final utilizado en este experimento es de 500 μL.
   NOTA: Por ejemplo, si la concentración de células huésped contada utilizando la tinción de Trypan Blue es de 1 x^{10 5} células/ml, la concentración deseada de células bacterianas a un MOI de 100 será de 1 x 10⁷ células/ml. La concentración de P. aeruginosa a 0,5 OD₆₀₀ es de 1 x 10⁸/mL. Para obtener la concentración deseada, diluya el cultivo de P. aeruginosa 10 veces, agregue 50 μL de cultivo resuspendido a 450 μL de medio fresco F-12K.

3. Adherencia bacteriana y tinción de la célula huésped

1. Primero, lave las monocapas de células A549 sembradas tres veces con 1x PBS caliente. Para cada lavado, agregue 100 μL de 1x PBS a cada pozo, pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces, deseche 1x PBS o espere 10 s después de la adición y luego aspire para eliminar 1x PBS. Para determinar la cinética de la asociación bacteriana, superponga las células con 100 μL de concentraciones deseadas de suspensión bacteriana con diferentes MOI (0, 1, 10 y 100). Girar hacia abajo las bacterias a 200 x g durante 10 min e incubar las células A549 infectadas a 37 °C, 5% CO₂ durante 1 h adicional.
   NOTA: En este experimento, cada condición tuvo un triplicado técnico.
2. Elimine las bacterias no unidas lavando las monocapas cinco veces con PBS caliente 1x como se describió anteriormente. Agregue 100 μL de formaldehído al 4% (en 1x PBS) en cada pocillo de las placas de 96 pocillos para fijar las células. Deje que las placas se asienten sobre hielo durante 15 minutos y luego lave la solución de fijación con 1x PBS tres veces.
3. Para teñir los núcleos, agregue 50 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incube durante 10 min a RT. Después de la incubación, lave los pocillos tres veces con 1x PBS. Cubra las células A549 infectadas con 100 μL de 1x PBS para evitar el secado. Procese para el siguiente paso o guarde la placa a 4 °C durante un máximo de 2 días en la oscuridad.

4. Imágenes, procesamiento y análisis automatizados de fluorescencia

1. Para mantener la integridad de los datos, elija aleatoria y manualmente cinco ubicaciones de cada pozo para capturar las imágenes a un aumento de 20x. Capture las imágenes fluorescentes de células y bacterias A549 bajo canales DAPI y GFP, respectivamente. Utilice el canal PE-Cy5 para las bacterias teñidas por el tinte fluorescente rojo.
2. Para tener una mejor resolución, procese todas las imágenes para el aplanamiento y la deconvolución del fondo. Establezca los parámetros como 68 μm de diámetro de la bola rodante para suavizar y mida automáticamente la función de dispersión de puntos (PSF) de la deconvolución de la imagen en función del objetivo.
3. Para contar todas las células y bacterias calificadas, mida la intensidad de fluorescencia de las células huésped y las bacterias y establezca la intensidad de fluorescencia más débil de las células huésped y las bacterias como umbrales para el recuento de células. Cuente todas las bacterias próximas a una célula huésped dentro de una distancia de 15 μm como las bacterias adherentes ya que el diámetro de la célula A549 es de 10.59-14.93 μm²¹.
   NOTA: Una configuración predeterminada en el sistema de imágenes cuenta selectivamente las células huésped con diámetros que van desde 5-100 μm y bacterias que van desde 0.2-5 μm de tamaño (ancho y largo).
4. Sobre la base de los resultados del procesamiento manual de imágenes mencionados anteriormente, aplique los parámetros de suavizado de imágenes, deconvolución, tamaños de objetos, distancia e intensidades de fluorescencia al resto de las imágenes automatizadas. Después del análisis automatizado, considere las lecturas críticas, como los recuentos totales de células huésped, los tamaños y formas de las células, los recuentos bacterianos totales y el recuento bacteriano promedio por célula huésped, que fue el indicador más importante, para determinar la adherencia bacteriana.
5. Exportación de datos y análisis estadístico
   1. Exporte los resultados analizados de todas las imágenes a una hoja de cálculo (por ejemplo, formato 'xlsx'). El sistema automatizado genera dos conjuntos de resultados: 1) el recuento medio de bacterias adherentes de cada imagen; 2) los datos informativos de cada célula huésped individual, como el recuento bacteriano adherente en una sola célula, el tamaño del huésped y la intensidad de fluorescencia promedio de la célula huésped y las bacterias, a partir de la imagen correspondiente.
   2. Calcule el número medio y la desviación estándar de los recuentos bacterianos adherentes de todas las imágenes para representar el nivel de adherencia bacteriana en comparación con los controles negativos. En este método, E. coli y B. subtilis sirvieron como controles negativos en las pruebas de adherencia bacteriana Gram-negativa y Gram-positiva, respectivamente. Realice ANOVAs bidireccionales para probar la variación significativa entre los puntos de datos a través del tratamiento para tres experimentos independientes.

Resultados

Para desarrollar el ensayo de adherencia bacteriana basado en imágenes de fluorescencia, se utilizó la cepa PAO1 de P. aeruginosa y su contraparte de adherencia negativa E. coli para probar la efectividad del protocolo, ya que se había reportado la adherencia de estas bacterias a las células A549^14,20,22. En primer lugar, P. aeruginosa (PAO1) y E. coli marcada con GFP se coincubó con una línea...

Discusión

El protocolo describe un enfoque automatizado para enumerar la unión bacteriana a las células huésped. El enfoque descrito tiene varias ventajas atractivas sobre los métodos convencionales. En primer lugar, este enfoque permite la cuantificación precisa del número de células patógenas microbianas que están unidas a células huésped individuales. Es importante destacar que esta cuantificación se puede realizar sin la necesidad de una laboriosa recolección bacteriana, diluciones en serie, recubrimiento en medios sólidos y d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher	62248	Tinte de celda huésped
placa de 96 pocillos	Corning	3882	Pocillo de media área, fondo plano y claro
Celdas A549	ATCC	CCL 185	Línea celular de mamíferos
BactoView Live	Red Biotium	40101	Centrífuga de tinte staning
de	Eppendorf	5810R
Rastreador de división celular CFSE	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	Lector multimodo de imágenes celulares
E. coli			Stock de laboratorio
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC medio de cultivo celular
EHEC			Colecciones NIST
F-12k medio	ATCC	302004	A549 medio de cultivo celular
Suero fetal bovino	Corning	35-016-CV
HUVEC			Stock de laboratorio
L. monocytogenes			Colecciones
NIST OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows stock de laboratorio
P. aeruginosa & Delta; pilA			Dr. Lori Burrows stock de laboratorio
S. agalactiae			Colecciones NIST
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus & Delta; saeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			Colecciones NIST
Caldo de soja típico	Células de cultivo	MBPE-4040