Este manuscrito describe el método de blot-and-plunge para congelar manualmente especímenes biológicos para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula.
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Artículo de método
Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula
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Resumen
Resumen
La obtención de imágenes de especímenes biológicos con electrones para la determinación de la estructura de alta resolución mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) requiere una capa delgada de hielo vítreo que contenga las biomoléculas de interés. A pesar de los numerosos avances tecnológicos en los últimos años que han impulsado el crioEM de una sola partícula a la vanguardia de la biología estructural, los métodos por los cuales los especímenes se vitrifican para imágenes de alta resolución a menudo siguen siendo el paso limitante de velocidad. Aunque numerosos esfuerzos recientes han proporcionado medios para superar los obstáculos que se encuentran con frecuencia durante la vitrificación de muestras, incluido el desarrollo de nuevos soportes de muestra e instrumentación de vitrificación innovadora, el émbolo tradicional operado manualmente sigue siendo un elemento básico en la comunidad crioEM debido al bajo costo de compra y la facilidad de operación. Aquí, proporcionamos métodos detallados para el uso de un dispositivo estándar de blot-and-plunge operado manualmente estilo guillotina para la vitrificación de especímenes biológicos para imágenes de alta resolución mediante crioEM de una sola partícula. Además, también se describen los problemas más comunes y las recomendaciones de solución de problemas para cuando una preparación estándar no produce una muestra adecuada.
Introducción
La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) es una poderosa técnica estructural que se puede utilizar para resolver estructuras de especímenes biológicos dinámicos a una resolución casi atómica1,2,3,4. De hecho, los recientes avances en las tecnologías de detectores directos de electrones4,5,6,7,8,9,10, las mejoras en las fuentes de
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Protocolo
1. Prepare el entorno de inmersión manual
NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 5-30 minutos
- Ubique el émbolo manual en una cámara frigorífica de 4 °C donde se pueda ubicar un humidificador para mantener la habitación cerca del 100% de humedad relativa (HR) (Figura 1A).
PRECAUCIÓN: Consulte con las pautas de Salud y Seguridad Ambiental de la institución para la ubicación segura del émbolo manual y las operaciones recomendadas. - Antes de la preparación de la rejilla, encienda el humidificador en la cámara frigorífica para asegurarse de que la HR de la cámara frigorífica esté ≥ 95 %.
N....
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Resultados
La ejecución exitosa del protocolo de blot-and-plunge descrito aquí dará como resultado una capa delgada y uniforme de hielo vítreo que está libre de cualquier hielo hexagonal, contaminantes y grandes gradientes de hielo inutilizable que se pueden observar bajo el microscopio electrónico (Figura 3). El contacto inconsistente del papel secante con la superficie de la rejilla, la eliminación prematura del papel secante o el movimiento del papel secante durante el contacto con la rejilla pueden.......
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Discusión
La vitrificación de especímenes biológicos para la obtención de imágenes mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) sigue siendo un paso de importancia crítica para la determinación exitosa de la estructura. El método manual de borrado y inmersión descrito en este protocolo representa un método rentable, confiable y robusto para congelar rápidamente muestras biológicas en películas delgadas de hielo vítreo para imágenes crioEM. Utilizando los métodos descritos en el manuscrito, los investi.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio Herzik por pensar críticamente y proporcionar comentarios sobre este manuscrito y el contenido del video. M.A.H.Jr. cuenta con el apoyo de NIH R35 GM138206 y como Searle Scholar. H.P.M.N cuenta con el apoyo de la Beca de Capacitación en Biofísica Molecular (NIH T32 GM008326). También nos gustaría agradecer a Bill Anderson, Charles Bowman y al Dr. Gabriel Lander en el Instituto de Investigación Scripps por su ayuda para diseñar, ensamblar y probar el émbolo manual que se muestra en el video.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caja de almacenamiento de rejilla de 4 ranuras | Ted Pella | 160-40 | |
| Punta dispensadora de metal plano de calibre 14 | Amazon | B07M7YWWLT | |
| cubreobjetos de vidrio cuadrados de 22x22 mm | Sigma | C9802-1PAK | |
| Placa de Petri de vidrio de 60 mm para almacenar rejillas | Fisher | 08-747A | |
| Placa de Petri de vidrio de 100 mm para almacenar papel Whatman | Fisher | 08-747D | |
| Placa de Petri de vidrio de 150 mm para almacenar papel Whatman | Fisher | 08-747F | |
| Vaso de precipitados de 250 mL | Fisher | 02-555-25B | |
| Espuma de poliestireno azul dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Recipiente de etano de latón | Lasco | 17-4075 | |
| Pinzas de sujeción | Ted Pella | 38825 | |
| Toallitas para tareas delicadas | Fisher | 06-666 | |
| Regulador de doble etapa con válvula de control | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Base de rejilla de desagüe | UCSD | ||
| Tanque de propano | de etano UCSAIR | ||
| Lámpara de trabajo de brazo flexible | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Ciencias de la Microscopía Electrónica | Q325AR1.3 | |
| Humidificador | Objetivo 719438 | ||
| Higrómetro | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Bata de laboratorio | UCSD | ||
| Nitrógeno líquido dewar | Worthington | LD4 | |
| Guantes de nitrógeno líquido | Fisher | 19-059-925 | |
| Soporte de émbolo manual (soporte negro + pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plataforma de inmersión) | UCSD | ||
| nitrilo | VWR | 82026-424 | |
| Pipeta P20 | Eppendorf | 13-690-029 | |
| Tubos de PCR | Eppendorf | ||
| Puntas de pipeta | ibis scientific | 63300005 | |
| Lámpara de anillo | Amazon B07HMR4H8G | ||
| Gafas de seguridad | UCSD | ||
| Tijeras | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Destornillador | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Pinza para transferir caja de rejilla | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Papel secante Whatman | Fisher | 1001-090 |
Referencias
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of....
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Reimpresiones y permisos
