Modificación química del residuo de triptófano en un dominio recombinante de Ca2+-ATPasa N para el estudio del triptófano-ANS FRET

Resumen

ANS se une al dominio N recombinante Ca²⁺-ATPasa. Los espectros de fluorescencia muestran un patrón similar a FRET sobre la excitación a una longitud de onda de 295 nm. La modificación química del Trp mediada por NBS apaga la fluorescencia del dominio N, lo que conduce a la ausencia de transferencia de energía (FRET) entre el residuo de Trp y el ANS.

Resumen

El retículo sarcolásmico Ca²⁺-ATPasa (SERCA) es una ATPasa de tipo P que se ha cristalizado en diversas conformaciones. No obstante, se puede obtener información funcional detallada a partir de dominios recombinantes aislados. El dominio de unión a nucleótidos recombinantes (dominio N) diseñado (Trp552Leu y Tyr587Trp) muestra un enfriamiento de fluorescencia al unirse al ligando. Un fluoróforo extrínseco, a saber, sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS), se une al sitio de unión a nucleótidos a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas con residuos de Arg, His, Ala, Leu y Phe. La unión al SNA se evidencia por el aumento de la intensidad de la fluorescencia cuando se excita a una longitud de onda (λ) de 370 nm. Sin embargo, cuando se excita a λ de 295 nm, el aumento en la intensidad de la fluorescencia parece estar acoplado al enfriamiento de la fluorescencia intrínseca del dominio N. Los espectros de fluorescencia muestran un patrón de transferencia de energía de resonancia de Föster (FRET), lo que sugiere la presencia de un par Trp-ANS FRET, que parece estar soportado por la corta distancia (~ 20 Å) entre Tyr587Trp y ANS. Este estudio describe un análisis del par Trp-ANS FRET por modificación química Trp (y enfriamiento por fluorescencia) que está mediado por N-bromosuccinimida (NBS). En el dominio N modificado químicamente, la fluorescencia del SN aumenta cuando se excita a una λ de 295 nm, similar a cuando se excita a una λ de 370 nm. Por lo tanto, la modificación química mediada por NBS del residuo de Trp se puede utilizar para sondear la ausencia de FRET entre Trp y ANS. En ausencia de fluorescencia de Trp, no se debe observar un aumento en la fluorescencia de ANS. La modificación química de los residuos de Trp en proteínas por NBS puede ser útil para examinar FRET entre residuos de Trp que están cerca del SNA unido. Este ensayo probablemente también será útil cuando se usen otros fluoróforos.

Introducción

La transferencia de energía por resonancia de Föster (FRET) se ha convertido en una técnica estándar para determinar la distancia entre las estructuras moleculares después de la unión o interacción en los estudios de estructura y función de^{proteínas 1,2,3,4}. En las ATPasas de tipo P, FRET se ha utilizado para investigar la estructura y función del retículo sarco-endoplásmico Ca²⁺-ATPasa (SERCA)^2,5,6,7,

Protocolo

1. Determinación (in silico) de la interacción ANS y SERCA N-dominio

1. Generar una estructura tridimensional (3D) de la proteína (serca N-domain) mediante modelado molecular utilizando el software de modelado de proteínas preferido⁵⁰.
2. Identificar los residuos de aminoácidos que forman el sitio de unión a nucleótidos utilizando el software de estructura molecular preferido⁵¹, y determinar la presencia de residuos de Arg y Lys³⁵; estos son necesarios para la unión al SNA y para aumentar la intensidad de la fluorescencia (rendimiento cuántico).
3. Realizar acoplamien....

Resultados

El acoplamiento molecular muestra la unión del SNA al sitio de unión a nucleótidos del dominio N a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas(Figura 1). La distancia molecular (20 Å) entre el residuo de Trp y el SNA (unido al sitio de unión a nucleótidos) apoya la aparición de FRET (Figura 1). El dominio N recombinante diseñado (diseñado) se obtuvo a alta pureza mediante cromatografía de afinidad(Figura 2)y fue adecuado .......

Discusión

Los espectros de fluorescencia del complejo de dominio ANS-N muestran un patrón similar a FRET cuando se excitan a una λ de 295 nm, mientras que la distancia molecular (20 Å) entre el residuo de Trp y ANS parece apoyar la aparición de FRET(Figura 1). La modificación química de Trp por NBS da como resultado un dominio N menos fluorescente(Figura 3B,Espectro f); por lo tanto, la transferencia de energía no es posible. Los espectros de fluorescencia ANS son similar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acrilamida	Bio-Rad	1610107	SDS-PAGE
Persulfato de amonio	Bio-Rad	1610700	SDS-PAGE
8-Ácido anilino-1-naftalenosulfónico	Sigma-Aldrich	A1028	Fluoróforo
Bis-acrilamida	Bio-Rad	1610125	SDS-PAGE
N-Bromosuccinimida	Sigma-Aldrich	B81255	Químico modificación
N,N-dimetilformamida	J.T. Baker	9213-12 Preparación de	la solución madre
Isotiocianato de fluoresceína	Sigma-Aldrich	F7250	Etiqueta de fluorescencia química
Cubeta de fluorescencia	Hellma	Z801291	Ensayo de fluorescencia
Espectrofluorómetro de fluorescencia	Shimadzu	RF 5301PC	Ensayo
HisTrap™ FF	GE Healtcare	11-0004-59	Purificación de proteínas
IPTG, libre de dioxano	American Bionalytical	AB00841-00010	Expresión de proteínas
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513-25G	Purificación de proteínas
LB media	Fisher Scientific	10000713	Cultivo celular
Pipetman L P10L	Gilson		FA10002M Fluorescencia ensayo
Pipetman L P100L	Gilson	FA10004M	Ensayo de fluorescencia
Pipetman L P200L	Gilson		FA10005M Ensayo de fluorescencia
Pipetman L P1000L	Gilson	FA10006M	Ensayo de fluorescencia
Pipetman L P5000L	Gilson	FA10007	Ensayo de fluorescencia
Precision plus std	Bio-Rad	1610374	SDS-PAGE
Dodecil sulfato de sodio	Bio-Rad	1610302	SDS-PAGE
Fosfato de sodio dibásico	J.T. Baker	3828-19 Preparación de	tampón
Fosfato de sodio monobásico	J.T. Baker	3818-01 Preparación de	tampón
Filtro de jeringa 0,2	mmm Millipore	GVWP04700	Filtración de solución
Temed	Bio-Rad	1610801	SDS-PÁGINA
Tris	Bio-Rad	1610719	SDS-PAGE

de fluorescencia