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Artículo de método

Modificación química del residuo de triptófano en un dominio recombinante de Ca2+-ATPasa N para el estudio del triptófano-ANS FRET

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DOI:

10.3791/62770

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9 de octubre de 2021

 , 
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

En este artículo

Resumen

ANS se une al dominio N recombinante Ca2+-ATPasa. Los espectros de fluorescencia muestran un patrón similar a FRET sobre la excitación a una longitud de onda de 295 nm. La modificación química del Trp mediada por NBS apaga la fluorescencia del dominio N, lo que conduce a la ausencia de transferencia de energía (FRET) entre el residuo de Trp y el ANS.

Resumen

El retículo sarcolásmico Ca2+-ATPasa (SERCA) es una ATPasa de tipo P que se ha cristalizado en diversas conformaciones. No obstante, se puede obtener información funcional detallada a partir de dominios recombinantes aislados. El dominio de unión a nucleótidos recombinantes (dominio N) diseñado (Trp552Leu y Tyr587Trp) muestra un enfriamiento de fluorescencia al unirse al ligando. Un fluoróforo extrínseco, a saber, sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS), se une al sitio de unión a nucleótidos a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas con residuos de Arg, His, Ala, Leu y Phe. La unión al SNA se evidencia por el aumento de la intensidad de la fluorescencia cuando se excita a una longitud de onda (λ) de 370 nm. Sin embargo, cuando se excita a λ de 295 nm, el aumento en la intensidad de la fluorescencia parece estar acoplado al enfriamiento de la fluorescencia intrínseca del dominio N. Los espectros de fluorescencia muestran un patrón de transferencia de energía de resonancia de Föster (FRET), lo que sugiere la presencia de un par Trp-ANS FRET, que parece estar soportado por la corta distancia (~ 20 Å) entre Tyr587Trp y ANS. Este estudio describe un análisis del par Trp-ANS FRET por modificación química Trp (y enfriamiento por fluorescencia) que está mediado por N-bromosuccinimida (NBS). En el dominio N modificado químicamente, la fluorescencia del SN aumenta cuando se excita a una λ de 295 nm, similar a cuando se excita a una λ de 370 nm. Por lo tanto, la modificación química mediada por NBS del residuo de Trp se puede utilizar para sondear la ausencia de FRET entre Trp y ANS. En ausencia de fluorescencia de Trp, no se debe observar un aumento en la fluorescencia de ANS. La modificación química de los residuos de Trp en proteínas por NBS puede ser útil para examinar FRET entre residuos de Trp que están cerca del SNA unido. Este ensayo probablemente también será útil cuando se usen otros fluoróforos.

Introducción

La transferencia de energía por resonancia de Föster (FRET) se ha convertido en una técnica estándar para determinar la distancia entre las estructuras moleculares después de la unión o interacción en los estudios de estructura y función deproteínas 1,2,3,4. En las ATPasas de tipo P, FRET se ha utilizado para investigar la estructura y función del retículo sarco-endoplásmico Ca2+-ATPasa (SERCA)2,5,6,7,8,por ejemplo, las fluctuaciones estructurales durante el ciclo catalítico se han analizado en toda la proteína mediante FRET7.

Los donantes de FRET son diversos, y van desde pequeñas moléculas fluorescentes (extrínsecas) hasta proteínas fluorescentes9,10. Los residuos de triptófano (Trp) (debido a su fluorescencia) son útiles para identificar cambios estructurales en las secuencias de aminoácidos proteicos11,12. La intensidad de fluorescencia de Trp depende sustancialmente de la polaridad de su entorno circundante13,14. La unión a ligando suele generar reordenamientos estructurales en proteínas/enzimas15,16. Si Trp está presente o cerca del sitio de unión a la proteína, las fluctuaciones estructurales afectan con frecuencia el grado de exposición de Trp a los medios acuosos13,14; por lo tanto, el cambio en la polaridad resulta en el enfriamiento de la intensidad de fluorescencia Trp13,14. Por lo tanto, la propiedad fluorescente de Trp es útil para realizar estudios de unión a ligandos para enzimas. Otros fenómenos físicos también pueden conducir a un enfriamiento de fluorescencia de Trp17,18,19,20, por ejemplo, FRET y cambios en la polaridad media. La transferencia de energía del estado excitado de Trp a un fluoróforo también tiene aplicaciones potenciales, por ejemplo, la determinación de afinidad de pequeños ligandos en proteínas21. De hecho, Trp se ha utilizado principalmente como donante de fluorescencia en estudios FRET en proteínas22,23,24,por ejemplo, en estudios FRET de terbio (Tb3+),un residuo de Trp se utiliza con frecuencia como antena para la transferencia de energía a Tb3+25,26,27. Trp muestra diversas ventajas sobre otros donantes de FRET debido a su carácter constitutivo inherente en la estructura de la proteína, lo que elimina la necesidad de procesos preparatorios que pueden afectar la función/estructura de la proteína estudiada24. Por lo tanto, la identificación de desintegraciones radiativas (transferencia de energía y cambios en la polaridad media que son inducidos por reordenamientos estructurales de proteínas) es importante para sacar conclusiones precisas con respecto a la unión a ligandos en estudios estructurales de proteínas13,14,19,28.

En estudios estructurales de proteínas, un fluoróforo extrínseco, a saber, sulfonato de 8-anilino-1-naftaleno (ANS), se ha utilizado principalmente en experimentos relacionados con el plegamiento / despliegue de proteínas28,29. El SNA se une a proteínas/enzimas en estado nativo, generalmente en los sitios de unión de los sustratos31,32,33; un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia ANS (ΦF) (es decir, un aumento en la intensidad de fluorescencia) es inducido por excitar la proteína a λ = 370 nm cuando se producen interacciones adecuadas de ANS con Arg y sus residuos en bolsas hidrofóbicas34,35,36,37. En diversos estudios, se ha notificado la aparición de FRET (cuando se excita a λ dentro de 280-295 nm) entre los residuos de Trp (donantes) y ANS (aceptor), que se basa en lo siguiente: 1) superposición del espectro de emisión de fluorescencia de Trp y espectro de excitación de ANS, 2) identificación de una distancia adecuada entre uno o más residuos de Trp y ANS para la transferencia de energía, 3) alto rendimiento cuántico de ANS cuando se une en bolsas de proteínas, y 4) patrón FRET característico en los espectros de fluorescencia de la proteína en presencia de ANS3,17,27,37,38.

Recientemente, la unión de ligandos al dominio de unión a nucleótidos (dominio N) en SERCA y otras ATPasas de tipo P se han investigado utilizando dominios N recombinantesdiseñados 40,41,42,43,44,45,46. La ingeniería molecular del dominio SERCA N se ha utilizado para mover el único residuo de Trp (Trp552Leu) a una estructura más dinámica (Tyr587Trp) que está cerca del sitio de unión a nucleótidos, donde las variaciones de fluorescencia (enfriamiento) se pueden utilizar para monitorear los cambios estructurales en la unión del ligando34. Los resultados experimentales han demostrado que el SNA se une (como ATP) al sitio de unión a nucleótidos en el dominio SERCA N recombinante purificado34. Curiosamente, la fluorescencia ans aumenta al unirse al dominio N tras la excitación a una λ de 295 nm, mientras que la fluorescencia intrínseca del dominio N disminuye34,produciendo así un patrón FRET que sugiere la formación de un par Trp-ANS FRET.

Se ha propuesto el uso de NBS para determinar el contenido de residuos de Trp en proteínas47 mediante ensayo de absorbancia de proteínas modificadas. NBS modifica el grupo indol altamente absorbente de Trp al oxindole menos absorbente47,48. Esto resulta en la pérdida (enfriamiento) de la propiedad fluorescente Trp40. Por lo tanto, la modificación química mediada por NBS de los residuos de Trp se puede utilizar como un ensayo para definir el papel de Trp (como donante) cuando se hipotetiza FRET.

Este protocolo describe la modificación química del único residuo de Trp por NBS en el dominio N recombinante diseñado de SERCA como un modelo de proteína. Los resultados experimentales demuestran que la intensidad de la fluorescencia del SÁN sigue aumentando en el dominio N34modificado químicamente por NBS, que carece de fluorescencia intrínseca. Por lo tanto, el ensayo es útil para demostrar la ausencia de FRET entre el residuo de Trp y anS cuando se une al dominio N34,40,49. Por lo tanto, este ensayo (modificación química NBS de Trp) es útil para probar la presencia del par Trp-ANS FRET en las proteínas.

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Protocolo

1. Determinación (in silico) de la interacción ANS y SERCA N-dominio

  1. Generar una estructura tridimensional (3D) de la proteína (serca N-domain) mediante modelado molecular utilizando el software de modelado de proteínas preferido50.
  2. Identificar los residuos de aminoácidos que forman el sitio de unión a nucleótidos utilizando el software de estructura molecular preferido51, y determinar la presencia de residuos de Arg y Lys35; estos son necesarios para la unión al SNA y para aumentar la intensidad de la fluorescencia (rendimiento cuántico).
  3. Realizar acoplamiento molecular (utilizando el software de acoplamiento preferido)52,53,54 para determinar las interacciones de ATP, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (que forma un enlace covalente con Lys515 que marca el sitio de unión a nucleótidos) y ANS con residuos de aminoácidos en el sitio de unión a nucleótidos(Figura 1).
  4. Calcule la distancia molecular (Å) entre el residuo de Trp y el SNAN unido utilizando la herramienta de medición en el software preferido.
  5. Realizar simulación de dinámica molecular del complejo ans-N-dominio para determinar la estabilidad de la interacción52,54. Luego, realice los experimentos in vitro cuando se haya confirmado la estabilidad del complejo.

2. Expresión y purificación del dominio N recombinante

  1. Sintetizar el gen que codifica para el dominioN 40.
  2. Diseñar y construir el plásmido que contiene el gen sintético que codifica para el dominio N40.
  3. Expresar y purificar por cromatografía de afinidad (Ni-NTA), el dominio N recombinante diseñado. Realizar un SDS-PAGE de la proteína purificada para determinar la pureza (Figura 2)40.
  4. Determinar la concentración de proteínas estudiando la absorbancia a λ de 280 nm con el coeficiente de extinción del dominio N (ε= 11.960 M-1·cm-1)40.

3. Monitorear la formación del complejo ans-N-domain basado en los cambios de intensidad de fluorescencia de ANS y N-domain.

  1. Preparar una solución de caldo ans en N,N-dimetilformamida.
    1. Pesar una pequeña cantidad (1-5 mg) de SNIA, y disolverlo en 1 ml del volumen final de N,N-dimetilformamida, por ejemplo, 3,2 mg (concentración final de 10,69 mM).
    2. Preparar una solución de caldo acuoso ans de 100 μM utilizando la solución ANS en N,N-dimetilformamida, por ejemplo, añadir 9,4 μL de la solución ANS de 10,69 mM a 990,6 μL de tampón de fosfato de 50 mM con pH 8,0 para obtener un volumen final de 1 mL.
    3. Mezcle las soluciones vórtice de 3 a 5 veces durante 15 s.
      Nota : en el siguiente experimento, utilice sólo la solución de almacenamiento acuoso ANS. Prepare recién la solución de caldo acuoso ANS antes de iniciar los experimentos.
  2. Preparar la solución de stock de NBS en N,N-dimetilformamida.
    1. Pesar una pequeña cantidad (1-5 mg) de NBS, y disolverlo en 1 mL de N, N-dimetilformamida, por ejemplo, 5,3 mg en 1 mL (concentración final de 29,78 mM).
    2. Preparar una solución de stock acuoso nbS de 1 mM utilizando la solución NBS en N,N-dimetilformamida, por ejemplo, añadir 3,36 μL de la solución NBS de 29,78 mM a 96,64 μL de tampón de fosfato de 50 mM con pH 8,0 para obtener un volumen final de 0,1 mL.
    3. Mezcle las soluciones vórtice de 3 a 5 veces durante 15 s.
      NOTA: Prepare recién la solución de stock acuoso NBS antes de comenzar los experimentos.
  3. Valore el dominio N con ANS y registre los espectros de fluorescencia por excitación a λ=295 nm a 25 °C.
    1. Obtener la línea de base del espectro de fluorescencia.
      1. Coloque 1 ml de tampón de fosfato de 50 mM con pH 8.0 en una cubeta de cuarzo de fluorescencia de 1 ml.
      2. Coloque la celda en la cámara celular termoestada (25 °C) del espectrofluorómetro y ajuste la excitación λ a 295 nm.
      3. Registre el espectro de fluorescencia (305 - 550 nm).
        NOTA: El espectro de fluorescencia del tampón de fosfato de 50 mM con pH 8.0, que sirve como muestra en blanco, se resta de todos los espectros de fluorescencia obtenidos.
    2. Obtener el espectro de fluorescencia intrínseca del dominio N.
      1. Coloque 900 μL de tampón de fosfato de 50 mM con pH 8.0 en una cubeta de cuarzo de fluorescencia.
      2. Añadir 100 μL de suspensión de dominio N (10 μM) para obtener una concentración final de dominio N de 1 μM en un volumen final de 1 ml.
      3. Homogeneizar suavemente con una micropipeta 20 veces para asegurar la homogeneidad de la solución.
        NOTA: La proteína debe ser recién purificada para obtener espectros de fluorescencia intrínseca de alta calidad, por ejemplo, el dominio N recombinante purificado solo se puede usar durante una semana después de la purificación.
      4. Coloque la celda en la cámara celular termoestada (25 °C) del espectrofluorómetro y ajuste la excitación λ a 295 nm.
      5. Registre el espectro de fluorescencia intrínseca del dominio N (305-550 nm).
    3. Añadir ANS, y obtener el espectro de fluorescencia por excitación a λ=295 nm.
      1. Añadir una alícuota de 2 μL de solución de caldo acuoso ans de 100 μM al dominio N suspendido (1 μM) para obtener una concentración final de SNA de 0,2 μM.
      2. Homogeneizar suavemente con una micropipeta 20 veces para asegurar la homogeneidad de la solución.
      3. Coloque la celda en la cámara celular termoesta (25 °C) del espectrofluorómetro y ajuste la excitación λ a 295 nm.
      4. Registre el espectro de fluorescencia (305-550 nm).
      5. Repita las adiciones ans y los espectros de fluorescencia registrando por encima de la relación molar 1:1 ANS:N-dominio.
      6. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando el software adecuado.
      7. Traza todos los espectros en un solo gráfico.
      8. Determine si los espectros forman un patrón similar a FRET. Los espectros de fluorescencia del dominio ANS-N forman un patrón similar a FRET(Figura 3A).

4. Titulación de fluorescencia intrínseca del dominio N por modificación química de Trp con NBS.

  1. Repita los pasos 3.3.1 y 3.3.2.
  2. Añadir una alícuota de 1 μL de solución de stock acuoso de 1 mM NBS al dominio N suspendido (1 μM) para obtener una concentración final de 1 μM de NBS.
  3. Homogeneice suavemente utilizando una micropipeta 20 veces para garantizar la homogeneidad de la solución.
  4. Coloque la celda en la cámara celular termoesta (25 °C) del espectrofluorómetro y ajuste la excitación λ a 295 nm.
  5. Registrar el espectro de fluorescencia (305-550 nm) (Figura 3B).
  6. Repita la adición de NBS y el registro de espectros de fluorescencia hasta que se observe un mínimo de enfriamiento de fluorescencia intrínseca del dominioN 40. En el dominio N, esto generalmente ocurre en una relación molar de 5-6 NBS / N-dominio40.
    NOTA: NBS apaga rápidamente (<5 s) la fluorescencia intrínseca del dominio N; se observa una disminución en la intensidad de la fluorescencia. Continúe inmediatamente al siguiente paso, ya que NBS también puede reaccionar con otros residuos de aminoácidos47.
  7. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando el software adecuado.
  8. Trazar todos los espectros en un solo gráfico (Figura 3B).

5. Valorar el dominio N modificado por NBS con ANS registrando espectros de fluorescencia a 25 °C.

  1. Realice el paso 3.3.3 utilizando el dominio N modificado nbs que se generó en el paso 4.
  2. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando el software adecuado.
  3. Trazar todos los espectros en un solo gráfico (Figura 3C).
  4. Los espectros de fluorescencia generados(Figura 3C)apoyan o refutan la ocurrencia de FRET, es decir, cuando se produce FRET, la fluorescencia ans no aumenta y viceversa.

6. Evidencia de unión del SNA al dominio N modificado químicamente por excitación a λ=370 nm.

  1. Realice el paso 3.3.3 utilizando el dominio N modificado NBS que se generó en el paso 4, pero cambiando la excitación λ a 370 nm.
  2. Reste el espectro en blanco de cada espectro utilizando el software adecuado.
  3. Trazar todos los espectros en un solo gráfico (Figura 3D).
  4. Confirme la unión del SNA al dominio N observando el aumento de la intensidad de la fluorescencia del SNA. La unión del SNA al dominio N muestra un aumento de fluorescencia cuando se excita a λ=370 nm (Figura 3D). Como control, se obtuvo el espectro de fluorescencia del SNA (solo) en tampón de fosfato de 50 mM con pH 8.0 excitante a λ de 295 y 370 nm(Figura 4,no se muestra en video).
    NOTA: La relación estequiométrica de NBS:Trp que se requiere para la modificación química depende del grado de enterramiento de los residuos de Trp en la proteína en estudio46,47,55,56. Por lo tanto, se recomienda determinar la relación molar NBS: proteína / (Trp), de antemano.

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Resultados

El acoplamiento molecular muestra la unión del SNA al sitio de unión a nucleótidos del dominio N a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas(Figura 1). La distancia molecular (20 Å) entre el residuo de Trp y el SNA (unido al sitio de unión a nucleótidos) apoya la aparición de FRET (Figura 1). El dominio N recombinante diseñado (diseñado) se obtuvo a alta pureza mediante cromatografía de afinidad(Figura 2)y fue adecuado ...

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Discusión

Los espectros de fluorescencia del complejo de dominio ANS-N muestran un patrón similar a FRET cuando se excitan a una λ de 295 nm, mientras que la distancia molecular (20 Å) entre el residuo de Trp y ANS parece apoyar la aparición de FRET(Figura 1). La modificación química de Trp por NBS da como resultado un dominio N menos fluorescente(Figura 3B,Espectro f); por lo tanto, la transferencia de energía no es posible. Los espectros de fluorescencia ANS son similar...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue parcialmente financiado por la subvención FAI-UASLP número C19-FAI-05-89.89 y la subvención conacyt número 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Los autores agradecen la asistencia técnica de Julián E. Mata-Morales en la edición de video.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcrilamidaBio-Rad1610107SDS-PAGE
Persulfato de amonioBio-Rad1610700SDS-PAGE
8-Ácido anilino-1-naftalenosulfónicoSigma-AldrichA1028Fluoróforo
Bis-acrilamidaBio-Rad1610125SDS-PAGE
N-BromosuccinimidaSigma-AldrichB81255Químico modificación
N,N-dimetilformamidaJ.T. Baker9213-12 Preparación dela solución madre
Isotiocianato de fluoresceínaSigma-AldrichF7250Etiqueta de fluorescencia química
Cubeta de fluorescenciaHellmaZ801291Ensayo de fluorescencia
Espectrofluorómetro de fluorescenciaShimadzuRF 5301PCEnsayo
HisTrap™ FFGE Healtcare11-0004-59Purificación de proteínas
IPTG, libre de dioxanoAmerican BionalyticalAB00841-00010Expresión de proteínas
ImidazolSigma-AldrichI5513-25GPurificación de proteínas
LB mediaFisher Scientific10000713Cultivo celular
Pipetman L P10LGilsonFA10002M Fluorescencia ensayo
Pipetman L P100LGilsonFA10004MEnsayo de fluorescencia
Pipetman L P200LGilsonFA10005M Ensayo de fluorescencia
Pipetman L P1000LGilsonFA10006MEnsayo de fluorescencia
Pipetman L P5000LGilsonFA10007Ensayo de fluorescencia
Precision plus stdBio-Rad1610374SDS-PAGE
Dodecil sulfato de sodioBio-Rad1610302SDS-PAGE
Fosfato de sodio dibásicoJ.T. Baker3828-19 Preparación detampón
Fosfato de sodio monobásicoJ.T. Baker3818-01 Preparación detampón
Filtro de jeringa 0,2mmm MilliporeGVWP04700Filtración de solución
TemedBio-Rad1610801SDS-PÁGINA
TrisBio-Rad1610719SDS-PAGE
de fluorescencia

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