Presentamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida para capturar imágenes, analizar y cuantificar la cinética de crecimiento del hongo filamentoso A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Este protocolo se puede utilizar junto con la microscopía de fluorescencia.
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Artículo de método
Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto
En este artículo
Resumen
Resumen
Está bien establecido que el crecimiento de colonias de hongos filamentosos, en su mayoría dependiente de cambios en la tasa de crecimiento apical de hifas/micelios, se estima macroscópicamente en medios solidificados comparando el tamaño de la colonia. Sin embargo, medir cuantitativamente la tasa de crecimiento de cepas o cepas de hongos genéticamente diferentes bajo diferentes condiciones ambientales / de crecimiento (pH, temperatura, fuentes de carbono y nitrógeno, antibióticos, etc.) es un desafío. Por lo tanto, la búsqueda de enfoques complementarios para cuantificar la cinética del crecimiento se vuelve obligatoria para comprender mejor el crecimiento de células fúngicas. Además, es bien sabido que los hongos filamentosos, incluido Aspergillus spp., tienen distintos modos de crecimiento y diferenciación en condiciones subaésperas en medios sólidos o cultivos sumergidos. Aquí, detallamos un método microscópico cuantitativo para analizar la cinética de crecimiento del hongo modelo Aspergillus nidulans,utilizando imágenes en vivo tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Capturamos imágenes, analizamos y cuantificamos las tasas de crecimiento de diferentes cepas de hongos de una manera reproducible y confiable utilizando un software libre de código abierto para bio-imágenes (por ejemplo, Fiji), de una manera que no requiere ninguna experiencia previa en análisis de imágenes por parte del usuario.
Introducción
Los hongos filamentosos son de gran importancia socioeconómica y ecológica, siendo tanto cruciales como herramientas industriales/agrícolas para la producción de enzimas y antibióticos1,2 y como patógenos de plantas de cultivo3,insectos plaga4 y humanos3. Además, los hongos filamentosos como Aspergillus nidulans son ampliamente utilizados como organismos modelo para la investigación fundamental, como los estudios en genética, biología celular y evolutiva, así como para el estudio de la extensión hifal5<....
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Protocolo
1. Preparación del inóculo
NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo un gabinete de flujo laminar.
- Extraer la cepa fúngica de interés, de una cepa de glicerol (-80 °C) utilizando un bucle de inoculación estéril, en placas de medios mínimos (MM) complementadas con los requisitos nutricionales apropiados relevantes para la cepa examinada [MM: 10,0 g/L de glucosa, 20 ml/L de solución salina (solución salina: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L cloroformo) y 1 mL/L oligoelementos (oligoelementos: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L....
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Resultados
Siguiendo este protocolo, capturamos y analizamos diversas imágenes correspondientes a diferentes etapas de crecimiento/desarrollo del hongo filamentoso A. nidulans. Los datos presentados en este estudio se procesaron y analizaron utilizando el software de Fiji. Las mediciones se guardaron como archivos csv, se analizaron estadísticamente y se prepararon como gráficos utilizando software estadístico comercial y / o lenguaje de programación Python utilizando bibliotecas de software como pandas, numpy, statsmodels.......
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Discusión
El monitoreo del crecimiento y fenotipo de células fúngicas por microscopía de lapso de tiempo es un enfoque poderoso para evaluar el comportamiento celular en tiempo real y determinar cuantitativa y precisamente si un tratamiento farmacológico en particular y / o intervención genética da como resultado un crecimiento celular detectable o diferencias fenotípicas a lo largo del tiempo.
En este estudio, se describió una metodología confiable de imágenes de células vivas para medir y analizar cua.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por el proyecto "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) que se implementa en el marco de la Acción "Refuerzo de la Infraestructura de Investigación e Innovación", financiado por el Programa Operativo "Competitividad, Emprendimiento e Innovación" (NSRF 2014-2020) y cofinanciado por Grecia y la UE.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| µ-Diapositiva 8 Pocillo | Ibidi | 80826 | Diapositivas de imagen |
| Ácido 4-aminobenzoico | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotipo: zhAΔ::p yrGAf; ngnAΔ::p yrGAf; pyroA4 pantoB100 / Referencias:Colección de laboratorio, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotina | Merck | B4639 | |
| Cloroformo | Merck | 67-66-3 | |
| Sulfato de cobre (II) pentahidratado | Merck | C8027 | |
| Glucosa | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | Software | Software estadístico | |
| ImageJ | NIH | Software de procesamiento y análisis de imágenes | |
| Bucle de inoculación | Merck | I8263-500EA | |
| Fosfato de hierro (III) | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Software de microscopio | |
| Sulfato de magnesio heptahidratado | Merck | 63138 | |
| Sulfato de manganeso (II) monohidratado | Merck | M7899 | |
| Microscopio Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamida (Niacinamida) | Supelco | 47865-U | |
| Peptona | Millipore | 68971 | |
| Placas de Petri para cultivo microbiológico | KISKER | G090 | |
| Cloruro de potasio | Merck | P4504 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Merck | P5655 | |
| Clorhidrato de piridoxina | Merck | P6280 | |
| Quali - Tubos de microcentrífuga, 1,7 mL, libres de DNasa-, RNasa y pirógenos, estériles | KISKER | G052-S | |
| Quali - Tubos de microcentrífuga, 2,0 mL, estériles | KISKER | G053-S | |
| Quali - Puntas estándar, biseladas, 100-1000 y micro; L | KISKER | VL004G | |
| Quali - Puntas estándar, biseladas, 1-200 y micro; L | KISKER | VL700G | |
| Quali Puntas de Microvolumen, sin DNasa-, RNasa, 0,1-10 y micro; L/claro | KISKER | GC. CONSEJOS. B | |
| Riboflavina (B2) | Supelco | 47861 | |
| Hojas de bisturí Nº 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Cloruro de sodio | Merck | S7653 | |
| Hidróxido de sodio | Merck | S8045 | |
| Tetraborato de sodio decahidratado | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP y H1-mRFP) | Genotipo: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / Referencias:Colección de laboratorio, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotipo: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4; pyrG89 / Referencias: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Extracto de Levadura | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
Referencias
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I.
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Reimpresiones y permisos
