Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto

Los hongos filamentosos son de gran importancia socioeconómica y ecológica, siendo tanto cruciales como herramientas industriales/agrícolas para la producción de enzimas y antibióticos^1,2 y como patógenos de plantas de cultivo^3,insectos plaga⁴ y humanos^3. Además, los hongos filamentosos como Aspergillus nidulans son ampliamente utilizados como organismos modelo para la investigación fundamental, como los estudios en genética, biología celular y evolutiva, así como para el estudio de la extensión hifal⁵. Los hongos filamentosos son organismos altamente polarizados que se alargan a través del suministro continuo de lípidos/proteínas de membrana y la síntesis de novo de la pared celular en la punta extensible⁶. Un papel central en el crecimiento de la punta hifal y el mantenimiento de la polaridad es una estructura especializada llamada 'Spitzenkorper' (SPK), una estructura altamente ordenada que consiste principalmente en componentes citoesqueléticos y la distribución polarizada de los^6,7,8de Golgi.

Los estímulos/señales ambientales, como la interfaz agua-aire, la luz, la concentración de CO₂ y el estado nutricional son responsables de las decisiones de desarrollo tomadas por estos mohos⁹. En cultivos sumergidos (líquidos) se reprime la diferenciación de A. nidulans y se produce el crecimiento por elongación de la punta hifal⁶. Durante el crecimiento vegetativo, las esporas asexuales (conidios) germinan por extensión apical, formando una red indiferenciada de células hifales interconectadas, el micelio, que pueden continuar creciendo indefinidamente mientras los nutrientes y el espacio estén disponibles. Por otro lado, en las puntas hifales de medios sólidos alargadas y después de un período definido de crecimiento vegetativo (competencia del desarrollo), se inicia la reproducción asexual y los tallos de conidióforos aéreos se extienden desde las células especializadas del pie del micelio⁶. Estos dan lugar a estructuras multicelulares de desarrollo especializadas llamadas conidióforos, que producen largas cadenas de conidios haploides¹⁰ que pueden reiniciar el crecimiento en condiciones ambientales favorables.

Un método ampliamente utilizado para medir el crecimiento de hongos filamentosos es inocular esporas en agar nutriente contenido en una placa de Petri y medir macroscópicamente el diámetro de la colonia unos días después¹¹. El diámetro/área de la colonia, más dependiente de los cambios en la tasa de crecimiento micelial y menos de la densidad del conidióforo^12,se utiliza entonces como valor de crecimiento. Aunque, medir el tamaño de la población fúngica (colonia) que crece en superficies sólidas es bastante adecuado, de ninguna manera es la medida más precisa del crecimiento. En comparación con los promedios a nivel poblacional (promedios del tamaño de las colonias de hongos), las mediciones de una sola célula pueden capturar la heterogeneidad de una población celular y permitir la identificación de nuevas subpoblaciones de células, estados^13,dinámicas, vías, así como los mecanismos biológicos por los cuales las células responden a los cambios endógenos y ambientales^14,15. El monitoreo del crecimiento y fenotipo de células fúngicas por microscopía de lapso de tiempo es posiblemente el enfoque cuantitativo de observación de células individuales más ampliamente empleado.

A continuación, detallamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida (como contraste de fase, contraste de interferencia diferencial (DIC) y microscopía polarizada) para capturar imágenes, que independientemente del uso combinado de microscopía de fluorescencia se puede emplear para analizar y cuantificar el crecimiento polar de cepas de A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos.

1. Preparación del inóculo

NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo un gabinete de flujo laminar.

1. Extraer la cepa fúngica de interés, de una cepa de glicerol (-80 °C) utilizando un bucle de inoculación estéril, en placas de medios mínimos (MM) complementadas con los requisitos nutricionales apropiados relevantes para la cepa examinada [MM: 10,0 g/L de glucosa, 20 ml/L de solución salina (solución salina: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO₄·7H₂O, 76 g/L KH₂PO₄, 2,0 mL/L cloroformo) y 1 mL/L oligoelementos (oligoelementos: 40 mg/L Na₂B₄O₇· H₂O, 400 mg/L CuSO₄, 8 g/L ZnSO₄, 800 mg/L MnSO₄, 800 mg/L FePO₄), ajustar el pH a 6,8 con 1 M NaOH, añadir 1 % (p/v) de agar y los suplementos requeridos como se describe en¹⁶ y autoclave](Figura 1).
   NOTA: La solución de sal, la solución de oligoelementos y los suplementos se esterilizan en autoclave.
2. Incubar durante 2-3 días a 37 °C.
3. Use un palillo de dientes estéril (o un lazo de inoculación), transfiera un pequeño número de conidios, tocando suavemente una sola colonia, a placas de medios completos (CM) [CM: 10.0 g / L de glucosa, 2.0 g / L de peptona, 1.0 g / L de extracto de levadura, 1.0 g / L de casaminoácidos, 20 ml / L de solución salina, 1 ml / L de oligoelementos, 5 ml / L de solución de vitaminas (solución de vitaminas: 0,1 g/L de riboflavina, 0,1 g/L de nicotinamida, 0,01 g/L de ácido p-amino benzoico, 0,05 g/L de piridoxina HCl, 1,0 mg/L de biotina), ajuste el pH a 6,8 con 1 M de NaOH, agregue 1 % (p/v) de agar y los suplementos requeridos como se describe en¹⁶ y autoclave]. Autoclave y guarde la solución vitamínica en un frasco oscuro a 4 °C.
   NOTA: En caso de que el crecimiento de hongos sea demasiado denso para identificar y aislar colonias individuales, vuelva a rayar en una nueva placa de agar para obtener colonias individuales.
4. Incubar durante 3-4 días a 37 °C.
5. Obtener una suspensión conidial de aproximadamente 2 x 10⁶ células/ml rascando 1 cm de la superficie de una colonia fúngica conidiada cultivada en placas de agar CM, utilizando un palillo estéril (Figura S1).
   NOTA: Cuando sea necesario, cuente los conidios con un hemocitómetro.
6. Cosechar conidios de A. nidulans en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml con 1,0 ml de agua destilada en autoclave que contenga 0,05% (v/v) Tween 80 para reducir el número de grupos de conidios.
   NOTA: Los conidios pueden almacenarse hasta 2-3 semanas a 4 °C sin una pérdida relevante de viabilidad (A. Athanasopoulos y V. Sophianopoulou, datos no publicados). Sin embargo, se recomienda filtrar y/o lavar la suspensión conidial para eliminar las partes micelares y los nutrientes, con el fin de prevenir la hinchazón conidial.

2. Preparación para la obtención de imágenes de hongos filamentosos que crecen en medios de agar (sólidos)

NOTA: Se utiliza una versión modificada del método 'agar invertido^17,18.

1. Inicialmente, puntual 10 μL alícuotas de conidiales vigorosamente vórtices (aproximadamente 2 x 10⁴ células/ml) en varios puntos sobre placas de Petri (Ø9 cm) 15 mL de MM con 1% (p/v) de agar (Figura 2).
   NOTA: Utilizando la versión modificada del "método de agar invertido", es posible obtener imágenes de muestras de hongos durante muchas horas sin efectos nocivos aparentes en las hifas en crecimiento.
2. Incubar el cultivo experimental de acuerdo con la etapa de desarrollo que se pretende investigar.
3. Cortar un bloque de agar de ≈0,8 mm² que contiene la colonia con un bisturí estéril.
   NOTA: Las dimensiones del bloque de agar a cortar dependen de las dimensiones del equipo que se colocará después. En el presente trabajo, se utilizan 8 diapositivas μ (ver más abajo).
4. Invierta y coloque el bloque de agar en un pozo de un μ-slide o similar de 8 cámaras con cubierta adecuada para imágenes en vivo.
   NOTA: En caso de que se utilice la microscopía de luz transmitida en combinación con la microscopía de fluorescencia (etiquetado), el bloque de agar se puede invertir en una gota de medio líquido que contiene el tinte de tinción de células vivas, justo antes de la toma de imágenes.

3. Preparación para la obtención de imágenes de hongos filamentosos que crecen en medio líquido

1. Transferir 10 μL alícuotas de una suspensión conidial vigorosamente vórtice (aproximadamente 2 x 10⁴ células/ml) en los pozos de un portaobjetos de 8 pozos μ que contenga 200 μL de MM (líquido) con los suplementos apropiados (ver arriba).
2. Incubar durante el tiempo deseado a la temperatura deseada (Figura 3).
   NOTA: Si se utilizará microscopía de luz transmitida en combinación con microscopía de fluorescencia (etiquetado), los cultivos líquidos tienen la gran ventaja de que se pueden agregar colorantes fluorescentes en cualquier punto de tiempo deseado durante el experimento¹⁹.

4. Captura imágenes

NOTA: La elección del microscopio depende del equipo disponible. En cualquier caso, la configuración del microscopio debe incluir una etapa invertida, una cámara ambiental o al menos una habitación con un control preciso de la temperatura del aire.

1. Precaliente la cámara del microscopio termostatizada a 37 °C (a menos que se indique lo contrario o como adecuada para las especies de hongos utilizadas) para estabilizar la temperatura antes de comenzar. Esta cámara permite la modulación de la temperatura de la óptica del microscopio y la etapa de la muestra durante los experimentos de lapso de tiempo. Tenga en cuenta que las aberraciones ópticas²⁰ se introducen cuando los aceites de inmersión normales (diseñados para su uso a 23 °C) se utilizan a 37 °C o más.
   NOTA: Con un presupuesto ajustado, las cámaras de incubación pueden estar hechas de cartón y material de embalaje aislante²¹ o mediante el uso de una impresora 3D²².
2. Encienda el microscopio, la potencia del escáner, la alimentación del láser y la computadora, y cargue el software de imágenes. Coloque el μ-slide (preparado previamente) en la etapa de microscopio y enfoque.
3. Encuentre campos de visión que contengan celdas aisladas / no superpuestas (o al menos no superpobladas), para facilitar las mediciones de crecimiento durante el análisis de imágenes. Capture al menos 50 células en crecimiento por muestra para permitir un análisis estadístico robusto.
4. Seleccione el enfoque de microscopía de luz transmitida que desee. Reducir el tiempo de exposición o la potencia del láser y el tiempo de permanencia de los píxeles y/o aumentar los diámetros estenopeicos, con el fin de minimizar el fotobleaching de las células fúngicas, como se describe en otra parte ^23,24.
5. Configure el microscopio para adquirir imágenes a intervalos de tiempo deseados e iniciar la adquisición de series de tiempo.
   NOTA: Para corregir la deriva focal a lo largo del tiempo (especialmente para experimentos largos), debido a la deriva térmica, los diversos tamaños de células y el movimiento celular, use una estrategia de enfoque automático si está disponible en su software de microscopio.

5. Análisis de imágenes

NOTA: En esta sección se describen los pasos clave del procesamiento de imágenes de microscopía de lapso de tiempo para medir la tasa de crecimiento de A. nidulans. La apertura, visualización y procesamiento de imágenes se logra con el software de código abierto ImageJ/Fiji²⁵.

1. Importar las imágenes a Fiji usando Plugins | | de bioformaformas Importador de bioformas desde el menú de Fiji con la configuración predeterminada (Figura 4A).
   NOTA: Compruebe si el Importador de Bioformaformas reconoce correctamente la calibración de la imagen. La dimensión de la imagen que se muestra en la ventana de imagen del campo de información superior debe ser igual a las dimensiones de la imagen original (Figura 4B). Presione Mayús + P para mostrar y cambiar las propiedades de la imagen en el software ImageJ/Fiji.
2. Cuando sea necesario, utilice el histograma que coincida^{con 26} para la corrección de la iluminación entre diferentes fotogramas(Imagen | Ajustar | | de corrección de lejía Coincidencia de histogramas) (Figura 4C).
3. Cuando sea necesario, utilice el algoritmo SIFT(Plugins | | de registro Alineación lineal de la pila con SIFT) para alinear o hacer coincidir pilas de imágenes (Figura 4D). Seleccionar "Traducción" en el menú de transformación esperado debería ser suficiente para corregir cualquier deriva x-y.
   NOTA: También se pueden usar otros complementos para alinear una pila de segmentos de imagen, como Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) o StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
4. Seleccione hifas que crezcan paralelas a las cubiertas, evitando las que están inclinadas. Asegúrese de seleccionar las hifas que se propagan por extensión polar y evite que las hifas presenten ramificaciones laterales y / o apicales.
5. Utilice MTrackJ (Plugins | MTrackJ) plugin para rastrear el crecimiento de puntas de hifal (Figura 4E)²⁷. Para agregar una pista, seleccione el botón Agregar en la barra de herramientas y coloque el primer punto en una punta hifal con el clic izquierdo del mouse. La serie temporal se moverá automáticamente al siguiente fotograma. Para completar el proceso de seguimiento, haga doble clic con el ratón en el punto final (o pulse la tecla Esc) (Figura 4F). Muévase a otro punto de interés (es decir, la punta hifal creciente) en el marco de tiempo inicial y reinicie el procedimiento midiendo la tasa de crecimiento de otra hifa.
   NOTA: Para instalar MTrackJ siga las instrucciones presentadas en https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
6. Haga clic en el botón Medir en el cuadro de diálogo MTrackJ(Figura 4G)para abrir la tabla de salida. Guardar mediciones de seguimiento (Archivo | Guardar como) en el formato de archivo deseado (por ejemplo, csv), analizarlos y trazarlos (Figura 4H).
   NOTA: Al seleccionar el botón Película, se produce una película que muestra la imagen y la progresión de la pista.

Siguiendo este protocolo, capturamos y analizamos diversas imágenes correspondientes a diferentes etapas de crecimiento/desarrollo del hongo filamentoso A. nidulans. Los datos presentados en este estudio se procesaron y analizaron utilizando el software de Fiji. Las mediciones se guardaron como archivos csv, se analizaron estadísticamente y se prepararon como gráficos utilizando software estadístico comercial y / o lenguaje de programación Python utilizando bibliotecas de software como pandas, numpy, statsmodels, matplotlib y seaborn. Se pueden encontrar más detalles en las publicaciones originales citadas.

Para interpretar la respuesta de las poblaciones, es importante determinar la heterogeneidad de los parámetros clave dentro de las poblaciones e identificar eficientemente las subpoblaciones fisiológicamente distintas28. La Figura 5 muestra el crecimiento de la cepa mutante azhAΔ ngnAΔ, con deleciones en dos genes, cuyos productos están implicados en la desintoxicación y asimilación del fitoproducto tóxico L-azetidina-2- ácido carboxílico29,en comparación con la cepa WT. Midiendo su tasa de crecimiento en cultivos líquidos sumergidos, detectamos una tasa de crecimiento estadísticamente significativa menor del doble mutante en comparación con la cepa WT (t(715) = 20.61, p = <0,0001) (Figura 5A-B). Esta diferencia en el crecimiento no fue detectable midiendo solo el área de colonia de estas cepas(Figura 5C-D),enfatizando que el análisis microscópico de una sola célula es más efectivo para determinar pequeñas diferencias en las tasas de crecimiento que son difíciles de detectar con la observación macroscópica de la colonia.

Las imágenes en vivo a largo plazo de una sola célula son de gran valor en el esfuerzo por obtener información espacial y temporal de la dinámica de las proteínas celulares. La imagen de células vivas a largo plazo (Figura 6,Video 1) de germinación conidial co-expresando la proteína eisosomal del núcleo marcada con GFP PilA y la histona H1 de mRFP muestra que PilA30 forma estructuras estáticas con baja movilidad en la membrana plasmática fúngica31,32. Además, la Figura 7 muestra que los colorantes fluorescentes se pueden utilizar para la obtención de imágenes en vivo de cepas cultivadas en medio de agar, con el fin de estudiar la dinámica de orgánulos y estructuras celulares. Aquí, FM4-6433 se utilizó para visualizar la red mitocondrial y el sistema vacuolar en A. nidulans.

Figura 1: Representación esquemática del procedimiento de preparación del inóculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Representación esquemática del procedimiento seguido para obtener imágenes de hongos filamentosos que crecen en medio agar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Representación esquemática del procedimiento seguido para obtener imágenes de hongos filamentosos que crecen en medio líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Representación esquemática del procedimiento de análisis de imágenes. Pasos para procesar imágenes de microscopía de lapso de tiempo y medir la tasa de crecimiento de A. nidulans. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Comparación de las mediciones tradicionales de la población con las mediciones de una sola célula. (A) Imágenes representativas de microscopía confocal de cepas azhAΔ ngnAΔ de doble deleción y WT, cultivadas en cultivos líquidos sumergidos que contienen urea como única fuente de nitrógeno a 25 °C. Todas las cepas se incubaron durante un total de 18 h, a 25 °C y los fotogramas se capturaron a intervalos de 15 minutos. Se recopilaron imágenes de 2048 × 2048 píxeles con un tamaño de píxel de 115,02 x 115,02 nm utilizando un microscopio TCS SP8 MP (Leica, Alemania) equipado con el objetivo de inmersión en aceite HC Plan APO 63x, N.A. 1.40. (B) Las medidas de (A) se trazan en parcelas de caja y bigotes. La significación estadística se analizó mediante t-Test y se representa con asteriscos (***), indicando p < 0,001. (C) Crecimiento a 25 °C de WT y doble deformación de deleción en MM sólido. Las colonias fueron fotografiadas en diferentes intervalos de tiempo (18 h, 36 h y 72 h), calibradas espacialmente y medidas manualmente con una regla en el programa ImageJ. (D) Las medidas de la superficie de colonias presentadas en (C) se trazan como parcelas de caja y bigotes. Las diferencias del área de colonias no fueron estadísticamente significativas entre los diferentes puntos temporales del doble mutante en comparación con la cepa WT (18h: t(8) = 0,69, p = 0,50, 36h: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72h: t(6) = 0,39, p = 0,70 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imágenes de células vivas a largo plazo de proteínas de interés que co-expresan germinación conidial fusionadas con etiquetas fluorescentes codificadas genéticamente. (A) Proyecciones de máxima intensidad (MIP) de 4 rodajas generadas en el plano z, de una cepa que co-expresa PilA-GFP y H1-mRFP. Los conidios se detectaron en medio de agar y se incubaron durante aproximadamente 1 h a 30 °C para ayudar a la adhesión de las células al agar. El bloque de agar que contenía conidios se cortó, se colocó en pozos de un μ-slide y se incubó durante un total de 18 h, a 30 ° C. Los fotogramas se capturaron a intervalos de 25 minutos, utilizando un microscopio TCS SP8 MP (Leica, Alemania) equipado con el objetivo de inmersión en aceite HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 (con un tamaño de píxel de 92,26 x 92,26 nm). Las imágenes se obtuvieron excitando GFP a una longitud de onda de 488 nm y detectando fluorescencia en la banda espectral que va de 495 a 558 nm, y excitando mRFP a una longitud de onda de 561 nm y detectando fluorescencia en la banda espectral que va de 580 a 660 nm. (B) Las mediciones (velocidad de germinación y extensión de la punta hifal) de (A) se trazan como gráfico de líneas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Etiquetado FM4-64 de hifas que crecen en medio sólido. Los conidios de una cepa WT se cultivaron en placas de Petri MM de agar al 1% durante 16 h a 30 °C. Los gérmenes en crecimiento se incubaron durante 20 min con 10 μL de MM que contenían 10 μM FM4-64. Después de la incubación, se cortó un bloque de agar que contenía gérmenes teñidos, se colocó en 8 μ-slide seguido de una persecución de 47 minutos a 30 ° C. Los fotogramas se capturaron cada 7 minutos a 30 °C utilizando un microscopio TCS SP8 MP equipado con el objetivo de inmersión en aceite HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 (con un tamaño de píxel de 184,52 x 184,52 nm). Las imágenes se obtuvieron mediante fm4-64 excitante a una longitud de onda de 514 nm y detectando fluorescencia en la banda espectral que va de 596 a 682 nm. La señal de fluorescencia FM4-64 se muestra como imagen invertida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Primeras etapas de formación de conidióforos. (A) Los conidios de la cepa WT se cultivaron en medio de agar durante 136 h a 30 °C, se cortaron en rodajas y se colocaron en pozos de un μ-slide. Los fotogramas se capturaban cada 20 minutos. Se recopilaron imágenes de 2048 × 2048 píxeles con un tamaño de píxel de 245,2 x 245,2 nm utilizando un microscopio TCS SP8 MP (Leica, Alemania), equipado con el objetivo de inmersión en aceite HC Plan APO 63x, N.A. 1.40. Las imágenes muestran la formación de vesículas de conidióforos (flecha negra), así como la formación (flecha marrón) y la maduración de metulae (flecha azul). (B) Las mediciones (velocidad de germinación y extensión unipolar de la punta hifal) de (A) se trazan como gráfico de líneas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vídeo 1: Imágenes de células vivas a largo plazo de germinación conidial que co-expresan PilA-GFP y H1-mRFP. Haga clic aquí para descargar este video.

Vídeo 2: Primeras etapas de la formación de conidióforos en A. nidulans. Haga clic aquí para descargar este video.

Figura S1: Preparación de la suspensión conidial. Raspando con un palillo estéril una superficie de aproximadamente1 cm 2 de una placa conidiada, se obtiene una suspensión de aproximadamente 2 x10 6 conidios/ml. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.