Artículo de método

Funcionalización de vesículas extracelulares derivadas de plaquetas de implantes ti

DOI:

10.3791/62781

⸱

5 de agosto de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB), 4Department of Fundamental Biology and Health Sciences, University of the Balearic Islands

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un método para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) derivadas de los lisados plaquetarios (PL) y su uso para recubrir superficies de implantes de titanio (Ti). Describimos el método de recubrimiento de fundición por gota, el perfil de liberación de EV de las superficies y la biocompatibilidad in vitro de las superficies Ti recubiertas de EV.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las vesículas extracelulares (EV) son nanovesículas biológicas que desempeñan un papel clave en la comunicación celular. Su contenido incluye biomoléculas activas como proteínas y ácidos nucleicos, que presentan un gran potencial en medicina regenerativa. Más recientemente, los EV derivados del lisado plaquetario (PL) han demostrado una capacidad osteogénica comparable a pl. Además, los biomateriales se utilizan con frecuencia en ortopedia o restauración dental. Aquí, proporcionamos un método para funcionalizar las superficies de Ti con EV derivados de PL para mejorar sus propiedades osteogénicas.

Los EV se aíslan de PL mediante cromatografía de exclusión de tamaño, y luego las superficies de Ti se funcionalizan con PL-EV mediante fundición por gota. La funcionalización se demuestra mediante la liberación de EV y su biocompatibilidad mediante el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los EV son vesículas de membrana (30-200 nm) secretadas por cualquier célula y desempeñan un papel clave en la comunicación de célula a célula al entregar su carga. Contienen una variedad de biomoléculas activas que pueden incluir ácidos nucleicos, factores de crecimiento o lípidos bioactivos1. Por estas razones, los EV han sido evaluados por su uso potencial en terapias. En términos de ortopedia y regeneración ósea, se han probado evs de diferentes fuentes. Entre ellos, se ha demostrado que los EV derivados de plaquetas inducen un efecto de diferenciación sobre las células madre manteniendo un perfil citotóxico bajo2,3. Por lo tanto, se requiere más investigación para explorar la posibilidad de combinar evs con biomateriales para usarlos en la práctica clínica diaria.

Los biomateriales a base de titanio son ampliamente utilizados como andamios para intervenciones clínicas de curación ósea debido a sus propiedades mecánicas, alta biocompatibilidad y durabilidad a largo plazo4. Sin embargo, los implantes ti son un material bioinerte y, por lo tanto, presentan una escasa capacidad de unión con el tejido óseo circundante5. Por este motivo, se están estudiando modificaciones de titanio con el fin de mejorar su rendimiento consiguiendo un microambiente más funcional en su superficie4,6,7. En este sentido, los vehículos eléctricos pueden anclarse al titanio mediante interacciones químicas8 o físicas9,10. Los EV inmovilizados derivados de células madre o macrófagos potencian la bioactividad del Ti al favorecer la adhesión y proliferación celular induciendo así un efecto osteogénico8,9,10.

Este artículo se centrará en una estrategia de fundición por gota para recubrir superficies Ti con vehículos eléctricos derivados de PL en detalle. Además, evaluaremos el perfil de liberación de evs de la superficie recubierta a lo largo del tiempo y confirmaremos su biocompatibilidad celular in vitro.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El Lisado plaquetario (PL) se obtiene como se describió anteriormente de acuerdo con las directrices institucionales3 utilizando como material de partida capas de buffy frescas proporcionadas por el Biobanco IdISBa. Su uso para el proyecto actual fue aprobado por su Comité de Ética (IB 1995/12 BIO).

1. Aislamiento de evs de PL

  1. Extracción de cuerpos más grandes
    1. Descongele PL a temperatura ambiente.
    2. Centrífuga PL a 1.500 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el pellet ya que contiene restos celulares.
    3. Recoge el sobrenadante y realiza dos centrifugaciones consecutivas a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C.
      NOTA: El pellet corresponde a vehículos eléctricos más grandes, como microvesículas, y en este caso, se descarta.
    4. Filtre el sobrenadante primero a través de una membrana porosa de 0,8 μm y luego a través de una membrana porosa de 0,2 μm.
      NOTA: Estos pasos eliminan todos los vehículos eléctricos no deseados.
    5. Acumule el PL filtrado y guárdelo a -20 °C hasta su uso.
  2. Cromatografía de exclusión de tamaño
    1. Equilibre la columna acoplada al equipo de cromatografía al caudal deseado con PBS filtrado.
      NOTA: El caudal utilizado depende de las características de la columna; en este caso, se establece en 0,5 ml/min.
    2. Cargue el PL procesado (5 ml) con una jeringa al equipo.
    3. Inyecte el PL en la columna y comience a recolectar fracciones de 5 ml en tubos de 15 ml.
    4. Recoge las fracciones enriquecidas con EV y guárdalas a -80 °C hasta su uso.
      NOTA: Al realizar el experimento por primera vez, caracterizar todas las fracciones mediante cuantificación de proteínas e inmunodetección para determinar la enriquecida con EV3,11. En este experimento, se recoge la 9ª fracción.
    5. Lave la columna cromatográfica con 30 ml de solución de NaOH al 0,2% y guárdela en una solución de etanol al 20% una vez que alcance el equilibrio.

figure-protocol-1
Figura 1: Diagrama esquemático del aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de lisado plaquetario (PL). Pl se centrifuga primero a 1.500 x g, y luego a 10.000 x g para eliminar cuerpos más grandes. El sobrenadante se filtra a través de filtros de 0,8 y 0,2 μm. El PL procesado se carga en la columna, y los EV se separan por cromatografía de exclusión de tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Caracterización de los vehículos eléctricos

NOTA: La caracterización de los EV es necesaria para realizar estudios funcionales12. Previamente se ha reportado microscopía electrónica o caracterización de western blot13. Este informe se centrará en las técnicas de caracterización esenciales para la funcionalización de la superficie de Ti.

  1. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
    1. Diluya los EV (1:1000) en PBS filtrados de 0,2 μm.
      NOTA: Las muestras demasiado concentradas o demasiado diluidas estarán fuera del rango para la determinación de NTA, y se requerirá un ajuste.
    2. Cargue 1 ml de los EV diluidos con una jeringa en el equipo NTA e inyértelos en el equipo NTA.
    3. Siga el protocolo del fabricante para la determinación de la concentración de partículas y la distribución del tamaño.
  2. Concentración de proteínas
    1. Determine la concentración utilizando 1 μL de la solución de EV. Mida la absorbancia con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 280 nm.
      NOTA: Los EV deben presentar niveles bajos de proteínas en comparación con el número de partículas.
    2. Siga las instrucciones del fabricante para obtener la lectura de absorbancia utilizando el espectrofotómetro.

3. Funcionalización de la superficie de titanio

NOTA: En este método, se utilizan discos de titanio mecanizados, c.p. grado IV, 6,2 mm de diámetro y 2 mm de altura. Los discos pueden ser manipulados con pinzas Ti, pero es importante no rayar la superficie. Además, el lado mecanizado debe mirar hacia arriba durante todo el proceso.

  1. Lavado de discos Ti
    NOTA: El volumen de soluciones utilizadas para el lavado de Ti debe ser suficiente para cubrir los discos de Ti. Coloque los discos Ti en un vaso de precipitados de vidrio y vierta soluciones sobre ellos. Luego, retire la solución decantando.
    1. Lave los implantes Ti con agua desionizada (DI) y luego deseche el agua.
    2. Lave los implantes Ti con etanol al 70% y luego decante para eliminar la solución.
    3. Coloque los implantes en agua DI y sonice a 50 °C durante 5 min. Deseche el agua.
    4. Incubar los implantes de Ti en una solución de NaOH al 40% a 50 °C durante 10 min con agitación. Deseche la solución.
      PRECAUCIÓN: La solución de NaOH se calienta durante la preparación. La solución es corrosiva y debe usarse dentro de una campana extractora de humos.
    5. Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min, y luego retirar el agua.
    6. Realice varios lavados con agua DI (al menos 5) hasta que alcance un pH neutro. Compruebe el pH con indicadores de pH.
    7. Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min y retirar el agua.
    8. Incubar los implantes ti en una solución de HNO3 al 50% a 50 °C durante 10 min con agitación. Retire la solución.
      PRECAUCIÓN: HNO3 es una sustancia corrosiva y oxidante, y debe usarse dentro de una campana extractora de humos.
    9. Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min. Retire el agua.
    10. Realizar varios lavados con agua DI (al menos 5) hasta obtener pH neutro. Compruebe el pH con indicadores de pH.
    11. Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min. Retire el agua.
      NOTA: En este punto, el experimento se puede detener almacenando implantes ti en una solución de etanol al 70%.
  2. Pasivación ti
    NOTA: Los pasos de pasivación de Ti se realizan cubriendo completamente los discos Ti con las diferentes soluciones en el orden que se enumera a continuación. Los discos ti se colocan en un vaso de precipitados de vidrio y las soluciones se vierten suavemente sobre ellos. Los volúmenes utilizados en todas las etapas de lavado deben cubrir completamente los implantes y se eliminan mediante decantación.
    1. Incubar los implantes Ti en una solución de HNO3 al 30 % durante 30 min a temperatura ambiente bajo una agitación suave. Retire la solución.
    2. Realice varios lavados con agua DI (al menos 5) hasta que alcance un pH neutro. Compruebe el pH con indicadores de pH.
    3. Incubar los implantes ti durante la noche a temperatura ambiente en agua DI.
    4. Secar los implantes en condiciones de vacío a 40 °C durante 10 min.
  3. Lanzamiento de vehículos eléctricos
    NOTA: Para los estudios funcionales celulares, es importante trabajar en un gabinete de cultivo celular.
    1. Coloque los implantes Ti en una placa de 96 pocillos, con el lado mecanizado hacia arriba.
      NOTA: Si los implantes están volteados boca abajo, se puede usar una aguja para colocarlos hacia atrás.
    2. Descongele la solución de EV y mézclelos con agitación. Use un vórtice para pulsar durante 3 s.
    3. Deposite los vehículos eléctricos en la superficie ti. En este estudio, se colocan gotas de 40 μL de solución de EV sobre el Ti para inmovilizar un máximo de 4 x 1011 EV por implante de acuerdo con la concentración determinada por NTA.
    4. Coloque las placas que contienen el Ti en condiciones de vacío a 37 °C hasta que las gotas estén completamente secas (~2 h).
      NOTA: Ajuste el tiempo dependiendo del número de implantes y el agua presente en la cámara de vacío.

figure-protocol-2
Figura 2: Diagrama esquemático de pasivación ti y funcionalización de EV por drop casting. Los implantes de Ti se pasivan primero por incubación durante 30 min en una solución de HNO3 al 30 % a temperatura ambiente. Después de varios lavados con agua DI, el pH alcanza neutro. Luego, los implantes de Ti se incuban durante la noche a temperatura ambiente en agua DI. Después de eso, los implantes se secan en condiciones de vacío a 40 ° C. Para la inmovilización de EV, 40 μL de solución de EV se depositan en los implantes ti. A continuación, los implantes se incuban al vacío durante 2 h hasta que los EV se unen físicamente a la superficie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Caracterización de la superficie ti

  1. Estudio de lanzamiento
    1. Incubar la superficie de Ti con 200 μL de PBS filtrado a 37 °C.
      NOTA: PBS se filtra para evitar interferencias con la medición NTA.
    2. Reemplace el PBS en diferentes puntos de tiempo y guárdelo a -80 °C.
      NOTA: En este estudio, se analizaron los puntos de tiempo de 2, 6, 10 y 14 días.
    3. Analice el PBS almacenado para estudios de partículas por NTA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: La concentración de partículas en PBS en diferentes momentos es una representación del perfil de liberación de EV a lo largo del tiempo.
  2. Estudios de biocompatibilidad
    NOTA: Las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC) se obtienen del Biobanco IdISBa de conformidad con las directrices institucionales.
    1. Mantener hUC-MSC en DMEM bajo en glucosa suplementado con 20% FBS hasta su uso. Cambie el medio dos veces por semana.
    2. Para la siembra celular, lave las células en matraces con 5 ml de PBS dos veces.
    3. Tripsinize hUC-MSC añadiendo 1 ml de solución de tripsina. Asegúrese de que cubre completamente la monocapa de células. Retire la solución de tripsina y coloque el matraz de cultivo celular a 37 °C durante 2 min aproximadamente. Vea el desprendimiento celular bajo el microscopio. Las celdas separadas aparecerán de forma redonda y estarán en suspensión.
    4. Células resuspend en DMEM glucosa baja con EV 1% agotado FBS.
      NOTA: Prepare medios suplementados con 1% de FBS, y luego ultracentrífuga a 120,000 x g durante 18 h para eliminar FBS-EV. Es importante eliminar los EV para evitar interferencias con los EV plaquetarios.
    5. Determinar la concentración celular contando el número de células con una cámara de Neubauer14.
    6. Llevar hUC-MSC a una concentración de 50.000 células/ml.
    7. Sembra 200 μL de la solución celular sobre los implantes Ti.
    8. Después de 48 h, recolectar 50 μL de medios y realizar la determinación citotóxica utilizando el kit de actividad de lactato deshidrogenasa (LDH), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método presentado en este artículo permite obtener discos de titanio funcionalizados evs. Los vehículos eléctricos están físicamente unidos a la superficie, lo que permite una liberación sostenida en el tiempo. La cantidad de vehículos eléctricos liberados puede ser medida por NTA en los días 2, 6, 10 y 14. Las primeras mediciones, en el día 2, muestran que se liberan alrededor de 109 EV, seguidos de una liberación sostenida en el día 6 (~ 108 EV); día 10 (~107 EV) y día 14 (~107<...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar instrucciones claras para la funcionalización de los vehículos eléctricos en las superficies ti. El método presentado se basa en una estrategia de drop casting, que es un tipo de funcionalización de fisiorción. Existe una bibliografía deficiente con respecto a la funcionalización de los evs en las superficies de Ti, aunque hay pocos estudios que muestren diferentes ventajas al inmovilizar los EV en Ti10. De todos modos, algunas de las estrategias exp...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación ha sido financiada por el Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanciada por el Fondo Social Europeo del FSE y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), la Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), y el PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiados por el impuesto de turismo sostenible de las Islas Baleares.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,8 y micro; m filtro de jeringaSartorius16592K
1,5 mL Tubo de centrífugaSPL ciencias de la vida PLC60015
1 ml JeringaBD303174
de 96 pocillos placa de cultivoSPL ciencias de la vida PLC30096
Absolut etanolScharlauET0006005PSe utiliza para preparar etanol al 20 % con agua Milli-Q®
AKTA sistema purificadorGE Healthcare8149-30-0014
Allegra X-15R CentrífugaBeckman Coutler392934 SX4750A rotor oscilante
Centrífuga 5430R Eppendorf5428000210rotor F-45-48-11
Tubo cónico, fondo cónico, 50mlSPL ciencias de la vidaPLC50050
Kit de detección de citotoxicidad (LDH)Roche11644793001
Jeringas Desechables 10 mlBecton DickinsonBDH307736
DMEM Low Glucose GlutamaxGIBCO21885025
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A Suero
Fetal Bovino (FBS) Embrionic CertifiedGIBCO16000044
Filtropur S 0.2 µ m filtro de jeringaSarstedt83.1826.001
HiPrep  16/60 Sephacryl  S-400 HRGE Healthcare28-9356-04Columnas prefabricadas células
madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC)IdISBa Biobank
Espectrofotómetro Nanodrop 2000ThermoFisherND-2000
NanoSight NS300 Análisis de seguimiento de nanopartículasMalvernNS300Dispositivo con láser integrado a λ= 532 nm y cámara sCMOS
AgujaTerumo946077135
Ácido nítrico 69,5%ScharlauAC16071000
Optima L-100 XP UltracentrífugaBeckman Coulter8043-30-1124SW-32Ti
Rotor Penicilina-Estreptomicina Solución 100XBiowestL0022
Tiras reactivas de pH 4.5-10.0SigmaP-4536
Lisado de plaquetas (PL)Biobanco IdISBaObtenido de  Capas de leucocitaria desechadas después de la donación de sangre
Réplicas de implantes de titanio Implantmedia, SANATitanio grado IV. Diámetro: 6,2 mm. Alto: 1,95 mm
Tripsina-EDTA 1 XBiowestL0930
Tryton X100SigmaT8787
de Tinas de centrífuga de polipropileno Beckman Coutler 326823 Power wave HT BioTek 10340763 Tubo con tapón de rosca, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, con impresión Sarstedt 62554502 Hidróxido de sodio Sharlau SO04251000

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  2. Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
  3. Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
  4. Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
  5. Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590(2020).
  6. Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725(2015).
  7. Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694(2017).
  8. Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
  9. Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
  10. Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571(2020).
  11. Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369(2015).
  12. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  13. Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541(2018).
  14. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
  15. Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
  16. Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Platelet Derived EVsExtracellular VesiclesTitanium FunctionalizationDrop CastingSize Exclusion ChromatographyNanoparticle TrackingBone RegenerationLDH Release AssayRegenerative MedicineBiomaterial Coating

Artículos relacionados