Transducción transitoria de las formas estrobiladas de Echinococcus granulosus

Summary

Describimos una técnica de transducción transitoria rápida en diferentes etapas de desarrollo de Echinococcus granulosus utilizando vectores lentivirales de tercera generación.

Abstract

La equinococosis quística o enfermedad hidatídica es una de las enfermedades parasitarias zoonóticas más importantes causadas por Echinococcus granulosus, una pequeña tenia que se alberga en el intestino de los caninos. Existe una necesidad urgente de investigación genética aplicada para comprender los mecanismos de patogénesis y control y prevención de enfermedades. Sin embargo, la falta de un sistema eficaz de evaluación de genes impide la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus . El presente estudio demuestra el potencial de transducción transitoria del gen lentiviral en las formas metacestoide y estrobilada de E. granulosus. Los protoescoleces (PSC) se aislaron de quistes hidatídicos y se transfirieron a medios de cultivo bifásicos específicos para convertirse en gusanos estrobilados. Los gusanos fueron transfectados con lentivirus cosechados de tercera generación, junto con células HEK293T como control del proceso de transducción. Se detectó una pronunciada fluorescencia en los gusanos estrobilados durante 24 h y 48 h, lo que indica una transducción lentiviral transitoria en E. granulosus. Este trabajo presenta el primer intento de transducción transitoria basada en lentivirus en tenias y demuestra los resultados prometedores con implicaciones potenciales en estudios experimentales sobre la biología de los gusanos planos.

Introduction

La equinococosis quística (CE) es una de las enfermedades helmínticas más importantes causadas por Echinococcus granulosus, una pequeña tenia dentro de la familia Taeniidae ^1,2. Se han llevado a cabo extensos estudios sobre el inmunodiagnóstico y el desarrollo de vacunas para E. granulosus. Sin embargo, el conocimiento inadecuado sobre las bases moleculares de la biología del parásito plantea importantes limitaciones en el diagnóstico, manejo y prevención de la enfermedad hidatídica 3,4,5,6.

Protocol

Este estudio fue aprobado por el Instituto Nacional para el Desarrollo de la Investigación Médica y el Comité de Revisión de Ética en investigación, No. 958680. Los lentivirus se clasifican como organismos BSL-2; por lo tanto, todos los procedimientos de cultivo de laboratorio en este protocolo se llevaron a cabo utilizando prácticas de laboratorio estériles y se llevaron a cabo bajo una campana de flujo laminar de acuerdo con las pautas de los NIH. La Figura 1 muestra una presentación esquemática del protocolo de estudio para las diferentes etapas de E. granulosus .

1. Recolección de quistes hid....

Results

Aquí, describimos una técnica de transducción transitoria rápida y eficiente en E. granulosus mediante el uso de vectores lentivirales de tercera generación. Cultivamos PSCs en un medio de cultivo bifásico para obtener gusanos estrobilados, como se describió anteriormente^25,26. Los protoscoleces se convierten en gusanos estrobilados después de 6 semanas in vitro. Se observaron diferentes etapas de E. granulosus en el medio de cultivo bi.......

Discussion

Comprender las bases moleculares de los nematodos y la biología de Platyhelminthes es crucial para comprender la patogenicidad de los parásitos zoonóticos²⁷. La falta de un sistema eficaz de evaluación de genes es un obstáculo importante para la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus ^12,27. El presente estudio demuestra el excelente potencial del lentivirus.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de cultivo de 12 pocillos	SPL Life Sciences	30012
Matraz de cultivo de 25 cm2	SPL Life Sciences	70325
Placas de cultivo de 6 pocillos	SPL Life Sciences	30006
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C4901-500G	Concentración de trabajo: 2.5  mM
CMRL 1066 medio	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2	incubadora memmert	ICO150
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Life Technology	12100046
Bilis			de perro Aislado de un perro sacrificado y esterilizado por 0.2 μ m filtro de jeringa
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	preparar 0.1% de Eosina para la prueba de exclusión
de trabajo Suero fetal bovino (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Inactivación de calor  de  FBS (30 min en 40 ° C)
Suero de ternera fetal (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Inactivación del calor  de  FCS (30 min en 40 ° C)
HEK293T células	BONbiotech	BN_0012.1.14	Riñón embrionario humano 293T
HEPES solución salina tamponada (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x concentrado
Microscopio de fluorescencia invertida	OLYMPUS	IX51
Penicilina	Sigma-Aldrich	P3032-10MU Concentración de	trabajo: 100 UI/mL
Pepsina	Roche	10108057001	Concentración de trabajo: 2 mg/mL, pH 2
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	DNAbiotech	DB0011	Este reactivo se resuelve en menos de 1 min en D.W
Polybrene (reactivo de transfección)	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Medio RPMI	BioIdea	BI-1006-05
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Estreptomicina	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Concentración de trabajo: 100 μ g/mL
Plásmido lentiviral de tercera generación (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Vector de transferencia (obtenido comercialmente del Departamento de Investigación de Medicina Molecular del Centro Académico Iraní para la Educación, la Cultura y la Investigación (ACECR), Mashhad, Irán)
Plásmido lentiviral de tercera generación (pLPI y pLPII)	Invitrogen (Life Technologies)	K4975-00	Vector auxiliar (obtenido comercialmente del Departamento de Investigación de Medicina Molecular del Centro Académico Iraní para la Educación, la Cultura y la Investigación (ACECR), Mashhad, Irán)
Plásmido lentiviral de tercera generación (pMD2G)		Plásmido Addgene 12259	Vector auxiliar (obtenido comercialmente del Departamento de Investigación de Medicina Molecular del Centro Académico Iraní para la Educación, la Cultura y la Investigación (ACECR), Mashhad, Irán)
Tampón Tris/EDTA (TE)	DNAbiotech	DB9713-100ml
Tripsina	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x soluciones de trabajo (pH 7.4– 7.6)