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Este estudio fue aprobado por el Instituto Nacional para el Desarrollo de la Investigación Médica y el Comité de Revisión de Ética en investigación, No. 958680. Los lentivirus se clasifican como organismos BSL-2; por lo tanto, todos los procedimientos de cultivo de laboratorio en este protocolo se llevaron a cabo utilizando prácticas de laboratorio estériles y se llevaron a cabo bajo una campana de flujo laminar de acuerdo con las pautas de los NIH. La Figura 1 muestra una presentación esquemática del protocolo de estudio para las diferentes etapas de E. granulosus .
1. Recolección de quistes hidatídicos
- Recolecte quistes hidatídicos hepáticos de ovejas infectadas naturalmente que se sacrifican rutinariamente en un matadero.
- Esterilizar completamente la superficie del quiste con gasa estéril y alcohol al 70% antes de aspirar los protoescoces (PSC).
- Aspire 20-50 ml de líquido hidatídico en tubos cónicos estériles de 50 ml.
- Después del drenaje, elimine el quiste con una cuchilla afilada, transfiera la capa germinal a un tubo cónico estéril de 50 ml y agítelo durante un corto período (~ 2 min) para aumentar la acumulación de PSC. Transfiera la capa germinal a un nuevo tubo de 1,5 ml para la caracterización molecular.
- Lave las PSC 3-5x con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Observe las PSC en eosina al 0,1% durante 5 minutos para determinar la viabilidad de la PSC bajo un microscopio de luz. Utilice PSC con al menos un 95% de viabilidad para la cultura.
- Tratar el precipitado de PSC con 2 ml de pepsina (2 mg/ml, pH 2) durante 15-20 min.
- Para aislar PSC individuales, resuspender el sedimento PSC en PBS y pasarlo a través de dos capas de gasa estéril en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml.
NOTA: Calcule el promedio de tres recuentos en 50 μL de sedimentos PSC utilizando un microscopio de luz. Para ensayos posteriores, utilice el valor estimado para determinar las PSC/μL. Cada aislado de quiste hidatídico debe caracterizarse en base a polimorfismos de nucleótidos por métodos moleculares, como la secuenciación por PCR17 o el análisis de la curva de fusión de alta resolución18.
2. Cultivo bifásico de PSCs de E. granulosus para obtener gusanos adultos
NOTA: Las PSC aisladas deben cultivarse en condiciones estériles bajo un gabinete de flujo laminar Clase II. Prepare las fases sólida y líquida del medio de cultivo bifásico por separado antes de continuar con los siguientes pasos19.
- Preparar el medio de cultivo bifásico para que conste de dos fases.
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Para la fase sólida, añadir 10 ml de suero bovino a un matraz de 25 ml y dejar coagular a 76 °C durante 20-30 min.
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Para la fase líquida (CMRL modificado), mezcle 100 ml de suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor, 36 ml de extracto de levadura al 5%, 5,6 ml de glucosa al 30 % (en agua destilada), 1,4 ml de bilis de perro al 5 % en PBS, tampón HEPES de 20 mM y 10 mM naHCO3 en 260 ml de medio CMRL-1066. Finalmente, agregue penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 mg/ml) a la mezcla.
- Añadir 10 ml del medio en fase líquida a cada matraz de cultivo de25 cm 2 .
- Agregue ~ 5,000 PSC al matraz de cultivo y transfiera el matraz a la incubadora de CO2 (37 ° C, 5% CO2).
- Después de 24-48 h, transfiera las PSC a un nuevo matraz con la fase sólida (suero bovino) y agregue 1 ml del mismo medio de fase líquida fresca por matraz. Transfiera los matraces a la incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2).
- Cada 5-7 días, reemplace el medio con un medio de fase líquida fresca en función de los cambios en el color del medio de cultivo y la proporción estimada de PSC diferenciadas.
NOTA: Los protoescoleces responden rápidamente a los cambios ambientales después de ser cultivados, y la mayoría de ellos experimentan diferenciación dentro de 2-3 semanas. Debido al consumo de nutrientes y al crecimiento y desarrollo de los protoscoleces, el pH del medio de cultivo cambia y su color cambia hacia el naranja y el amarillo.
3. Cultivo monofásico de PSCs de E. granulosus
- Asegúrese de que el cultivo monofásico se realiza 24-48 h antes de la transducción.
- Cultivo ~ 5,000 PSCs en un matraz de cultivo de 25 cm2 con RPMI y suero bovino fetal al 10% (FBS).
- Transfiera los matraces a la incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2) hasta su uso.
4. Cultivo celular para la producción y preparación de virus
NOTA: Las células 293T (HEK293T) del riñón embrionario humano se obtuvieron para la producción de vectores del Centro de Investigación de Patología y Células Madre de la Universidad de Ciencias Médicas de Kerman.
- Transfiera 5 × 105 células HEK293T a un matraz de25 cm 2 que contenga 5 ml de DMEM con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina.
- Incubar las células HEK293T a 37 °C en 5% de CO2 y pasarlas en el medio de cultivo completo cada 48 h. Finalmente, utilice células HEK293T de paso bajo para la transducción20.
5. Producción y preparación del virus con los vectores lentivirales de tercera generación
NOTA: El vector lentivirus pCDH513b (vector de transferencia) y PLPII, PLPI y PMD2G (vectores ayudantes) se utilizaron para expresar el gen reportero GFP. Véase la Tabla de Materiales y la Figura Suplementaria S1.
- Día 1:
- Después de tripsinizar las células HEK293T21 en placas de cultivo de 6 pocillos, sembrar 7 × 104 células por pozo con DMEM fresco libre de antibióticos que contiene 10% de FBS.
- Utilice células con una confluencia del 50% al 60% para la transducción por el método del fosfato de calcio.
- Día 2:
- Reemplace el medio de cultivo celular 2-3 h antes del experimento con DMEM fresco libre de antibióticos que contenga 2% de FBS.
- En un tubo de 1,5 ml, mezcle los plásmidos lentivirales de tercera generación, incluidos 7 μg/μL pCDH513b (vector de transferencia), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI y 2 μg/μL PMD2G (vectores auxiliares).
- Agregue el tampón HEPES (0.28 M NaCl, 0.05 M HEPES y 1.5 mM Na2HPO4; rango de pH óptimo, 7.00-7.28) a la mezcla a un volumen de 422 μL.
- Agregue 16 μL de tampón Tris-EDTA (TE) al 1% a la mezcla.
- Añadir 62 μL de cloruro de calcio de 2,5 mM a los tubos y mezclar bien.
- Agregue 500 μL de solución salina tamponada (HBS) 2x HEPES a la mezcla, gota a gota, dentro de 1-2 min usando una pipeta Pasteur. Mezclar suavemente hasta obtener una solución semiopaca, e incubar la mezcla durante 20 min a temperatura ambiente.
- Agregue la mezcla a cada plato lentamente y distribúyala con movimientos circulares lentos.
- Incubar las placas a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% y reemplazar el medio después de 4-6 h con DMEM libre de antibióticos que contenga 10% de FBS.
- Día 3:
- Confirme el éxito de la transducción transitoria y la viabilidad celular utilizando un microscopio de fluorescencia invertida.
- Día 4:
- Cosechar los virus del medio de cultivo recolectando el sobrenadante de cada pozo y almacenarlos a -70 °C hasta su uso.
NOTA: Los lentivirus cosechados podrían concentrarse y titularse para una transfección precisa22.
6. Transducción transitoria de diferentes etapas de E. granulosus con el virus
- Día 1:
- Use una placa de cultivo de 12 pocillos para la transferencia de genes. Cultivo 5 × 103-5 × 104 células HEK293T en triplicado, con medio DMEM completo como referencia interna.
- Cultiva 150 PSCs frescos por triplicado en RPMI y 10% FBS.
- Cultivo de 30 gusanos estrobilados por triplicado en DMEM que contienen un 10% de FBS inactivado por calor.
NOTA: Todos los medios de transducción deben estar libres de antibióticos. Mantenga tres pozos de control no tratados para células HEK293T, PSC y gusanos estrobilados en el proceso.
- Preparar una mezcla de 1 × 106 virus con reactivo de transfección de 4 μg/ml (ver la Tabla de Materiales) para transducir las células HEK293T y las diferentes etapas del gusano.
- Agregue la mezcla a cada plato lentamente y distribúyala con movimientos circulares lentos. Incubar las placas durante 4-6 h en una incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2). Reemplace el medio para cada muestra con el mismo medio de cultivo completo para minimizar los efectos tóxicos del reactivo de transfección.
- Día 2:
- Repita los pasos 6.1.4-6.1.5 para aumentar la eficiencia de la transducción transitoria para las células HEK293T, las PSC y los gusanos estrobilados.
- Incubar todas las placas durante 24-48 h en una incubadora de CO2 con las mismas condiciones de cultivo en función del tipo de medio celular.
- Día 3:
- Compruebe si la transducción es exitosa mediante el uso de microscopía de fluorescencia.
NOTA: Considere el uso de ensayos confirmatorios adicionales como PCR / qPCR20,23 o técnicas de Western blotting24 en el procedimiento de transferencia de genes.