Transducción transitoria de las formas estrobiladas de Echinococcus granulosus

La equinococosis quística (CE) es una de las enfermedades helmínticas más importantes causadas por Echinococcus granulosus, una pequeña tenia dentro de la familia Taeniidae ^1,2. Se han llevado a cabo extensos estudios sobre el inmunodiagnóstico y el desarrollo de vacunas para E. granulosus. Sin embargo, el conocimiento inadecuado sobre las bases moleculares de la biología del parásito plantea importantes limitaciones en el diagnóstico, manejo y prevención de la enfermedad hidatídica 3,4,5,6.

En los últimos años, debido al desarrollo de la secuenciación del genoma y los métodos transcriptómicos, varios grupos de investigación ^7,8,9 han realizado una amplia gama de estudios moleculares sobre gusanos planos. Sin embargo, en el mundo de los parásitos, los avances en la tecnología de transferencia de genes en gusanos planos parásitos siguen siendo limitados en comparación con los métodos de transducción transitoria altamente reproducibles desarrollados para algunos protozoos 10,11,12.

El uso de sistemas de administración viral se ha convertido en una herramienta esencial para la administración de transgenes y las investigaciones de genes / proteínas en las últimas dos décadas¹³. El lentivirus infecta tanto a las células en división como a las que no se dividen, lo que permite infectar las células postmitóticas 14,15,16. La evidencia reciente indica que el uso de un sistema de transducción basado en lentivirus en células de mamíferos ofrece el potencial de superar la mayoría de las limitaciones de las técnicas anteriores de knock-in/knock-down. El diseño y construcción de vectores lentivirales de expresión con marcadores moleculares apropiados, como la expresión GFP, han sido descritos previamente¹⁶. Por lo tanto, evaluamos la transducción transitoria lentiviral de un gen reportero GFP en los protoescoleces y gusanos estrobilados de E. granulosus.

Este estudio fue aprobado por el Instituto Nacional para el Desarrollo de la Investigación Médica y el Comité de Revisión de Ética en investigación, No. 958680. Los lentivirus se clasifican como organismos BSL-2; por lo tanto, todos los procedimientos de cultivo de laboratorio en este protocolo se llevaron a cabo utilizando prácticas de laboratorio estériles y se llevaron a cabo bajo una campana de flujo laminar de acuerdo con las pautas de los NIH. La Figura 1 muestra una presentación esquemática del protocolo de estudio para las diferentes etapas de E. granulosus .

1. Recolección de quistes hidatídicos

1. Recolecte quistes hidatídicos hepáticos de ovejas infectadas naturalmente que se sacrifican rutinariamente en un matadero.
2. Esterilizar completamente la superficie del quiste con gasa estéril y alcohol al 70% antes de aspirar los protoescoces (PSC).
3. Aspire 20-50 ml de líquido hidatídico en tubos cónicos estériles de 50 ml.
4. Después del drenaje, elimine el quiste con una cuchilla afilada, transfiera la capa germinal a un tubo cónico estéril de 50 ml y agítelo durante un corto período (~ 2 min) para aumentar la acumulación de PSC. Transfiera la capa germinal a un nuevo tubo de 1,5 ml para la caracterización molecular.
5. Lave las PSC 3-5x con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
6. Observe las PSC en eosina al 0,1% durante 5 minutos para determinar la viabilidad de la PSC bajo un microscopio de luz. Utilice PSC con al menos un 95% de viabilidad para la cultura.
7. Tratar el precipitado de PSC con 2 ml de pepsina (2 mg/ml, pH 2) durante 15-20 min.
8. Para aislar PSC individuales, resuspender el sedimento PSC en PBS y pasarlo a través de dos capas de gasa estéril en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml.
   NOTA: Calcule el promedio de tres recuentos en 50 μL de sedimentos PSC utilizando un microscopio de luz. Para ensayos posteriores, utilice el valor estimado para determinar las PSC/μL. Cada aislado de quiste hidatídico debe caracterizarse en base a polimorfismos de nucleótidos por métodos moleculares, como la secuenciación por PCR¹⁷ o el análisis de la curva de fusión de alta resolución¹⁸.

2. Cultivo bifásico de PSCs de E. granulosus para obtener gusanos adultos

NOTA: Las PSC aisladas deben cultivarse en condiciones estériles bajo un gabinete de flujo laminar Clase II. Prepare las fases sólida y líquida del medio de cultivo bifásico por separado antes de continuar con los siguientes pasos¹⁹.

1. Preparar el medio de cultivo bifásico para que conste de dos fases.
   1. Para la fase sólida, añadir 10 ml de suero bovino a un matraz de 25 ml y dejar coagular a 76 °C durante 20-30 min.
   2. Para la fase líquida (CMRL modificado), mezcle 100 ml de suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor, 36 ml de extracto de levadura al 5%, 5,6 ml de glucosa al 30 % (en agua destilada), 1,4 ml de bilis de perro al 5 % en PBS, tampón HEPES de 20 mM y 10 mM naHCO₃ en 260 ml de medio CMRL-1066. Finalmente, agregue penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 mg/ml) a la mezcla.
2. Añadir 10 ml del medio en fase líquida a cada matraz de cultivo de^{25 cm 2} .
3. Agregue ~ 5,000 PSC al matraz de cultivo y transfiera el matraz a la incubadora de CO₂ (37 ° C, 5% CO₂).
4. Después de 24-48 h, transfiera las PSC a un nuevo matraz con la fase sólida (suero bovino) y agregue 1 ml del mismo medio de fase líquida fresca por matraz. Transfiera los matraces a la incubadora de CO₂ (37 °C, 5% CO₂).
5. Cada 5-7 días, reemplace el medio con un medio de fase líquida fresca en función de los cambios en el color del medio de cultivo y la proporción estimada de PSC diferenciadas.
   NOTA: Los protoescoleces responden rápidamente a los cambios ambientales después de ser cultivados, y la mayoría de ellos experimentan diferenciación dentro de 2-3 semanas. Debido al consumo de nutrientes y al crecimiento y desarrollo de los protoscoleces, el pH del medio de cultivo cambia y su color cambia hacia el naranja y el amarillo.

3. Cultivo monofásico de PSCs de E. granulosus

1. Asegúrese de que el cultivo monofásico se realiza 24-48 h antes de la transducción.
   1. Cultivo ~ 5,000 PSCs en un matraz de cultivo de 25 cm² con RPMI y suero bovino fetal al 10% (FBS).
   2. Transfiera los matraces a la incubadora de CO₂ (37 °C, 5% CO₂) hasta su uso.

4. Cultivo celular para la producción y preparación de virus

NOTA: Las células 293T (HEK293T) del riñón embrionario humano se obtuvieron para la producción de vectores del Centro de Investigación de Patología y Células Madre de la Universidad de Ciencias Médicas de Kerman.

1. Transfiera 5 × 10⁵ células HEK293T a un matraz de^{25 cm 2} que contenga 5 ml de DMEM con 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina.
2. Incubar las células HEK293T a 37 °C en 5% de CO₂ y pasarlas en el medio de cultivo completo cada 48 h. Finalmente, utilice células HEK293T de paso bajo para la transducción²⁰.

5. Producción y preparación del virus con los vectores lentivirales de tercera generación

NOTA: El vector lentivirus pCDH513b (vector de transferencia) y PLPII, PLPI y PMD2G (vectores ayudantes) se utilizaron para expresar el gen reportero GFP. Véase la Tabla de Materiales y la Figura Suplementaria S1.

1. Día 1:
   1. Después de tripsinizar las células HEK293T²¹ en placas de cultivo de 6 pocillos, sembrar 7 × 10⁴ células por pozo con DMEM fresco libre de antibióticos que contiene 10% de FBS.
   2. Utilice células con una confluencia del 50% al 60% para la transducción por el método del fosfato de calcio.
2. Día 2:
   1. Reemplace el medio de cultivo celular 2-3 h antes del experimento con DMEM fresco libre de antibióticos que contenga 2% de FBS.
   2. En un tubo de 1,5 ml, mezcle los plásmidos lentivirales de tercera generación, incluidos 7 μg/μL pCDH513b (vector de transferencia), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI y 2 μg/μL PMD2G (vectores auxiliares).
   3. Agregue el tampón HEPES (0.28 M NaCl, 0.05 M HEPES y 1.5 mM Na₂HPO₄; rango de pH óptimo, 7.00-7.28) a la mezcla a un volumen de 422 μL.
   4. Agregue 16 μL de tampón Tris-EDTA (TE) al 1% a la mezcla.
   5. Añadir 62 μL de cloruro de calcio de 2,5 mM a los tubos y mezclar bien.
   6. Agregue 500 μL de solución salina tamponada (HBS) 2x HEPES a la mezcla, gota a gota, dentro de 1-2 min usando una pipeta Pasteur. Mezclar suavemente hasta obtener una solución semiopaca, e incubar la mezcla durante 20 min a temperatura ambiente.
   7. Agregue la mezcla a cada plato lentamente y distribúyala con movimientos circulares lentos.
   8. Incubar las placas a 37 °C en una incubadora de CO_{2 al} 5% y reemplazar el medio después de 4-6 h con DMEM libre de antibióticos que contenga 10% de FBS.
3. Día 3:
   1. Confirme el éxito de la transducción transitoria y la viabilidad celular utilizando un microscopio de fluorescencia invertida.
4. Día 4:
   1. Cosechar los virus del medio de cultivo recolectando el sobrenadante de cada pozo y almacenarlos a -70 °C hasta su uso.
      NOTA: Los lentivirus cosechados podrían concentrarse y titularse para una transfección precisa²².

6. Transducción transitoria de diferentes etapas de E. granulosus con el virus

1. Día 1:
   1. Use una placa de cultivo de 12 pocillos para la transferencia de genes. Cultivo 5 × 10^3-5 × 10⁴ células HEK293T en triplicado, con medio DMEM completo como referencia interna.
   2. Cultiva 150 PSCs frescos por triplicado en RPMI y 10% FBS.
   3. Cultivo de 30 gusanos estrobilados por triplicado en DMEM que contienen un 10% de FBS inactivado por calor.
      NOTA: Todos los medios de transducción deben estar libres de antibióticos. Mantenga tres pozos de control no tratados para células HEK293T, PSC y gusanos estrobilados en el proceso.
   4. Preparar una mezcla de 1 × 10⁶ virus con reactivo de transfección de 4 μg/ml (ver la Tabla de Materiales) para transducir las células HEK293T y las diferentes etapas del gusano.
   5. Agregue la mezcla a cada plato lentamente y distribúyala con movimientos circulares lentos. Incubar las placas durante 4-6 h en una incubadora de CO₂ (37 °C, 5% CO₂). Reemplace el medio para cada muestra con el mismo medio de cultivo completo para minimizar los efectos tóxicos del reactivo de transfección.
2. Día 2:
   1. Repita los pasos 6.1.4-6.1.5 para aumentar la eficiencia de la transducción transitoria para las células HEK293T, las PSC y los gusanos estrobilados.
   2. Incubar todas las placas durante 24-48 h en una incubadora de CO₂ con las mismas condiciones de cultivo en función del tipo de medio celular.
3. Día 3:
   1. Compruebe si la transducción es exitosa mediante el uso de microscopía de fluorescencia.
      NOTA: Considere el uso de ensayos confirmatorios adicionales como PCR / qPCR^20,23 o técnicas de Western blotting²⁴ en el procedimiento de transferencia de genes.

Aquí, describimos una técnica de transducción transitoria rápida y eficiente en E. granulosus mediante el uso de vectores lentivirales de tercera generación. Cultivamos PSCs en un medio de cultivo bifásico para obtener gusanos estrobilados, como se describió anteriormente25,26. Los protoscoleces se convierten en gusanos estrobilados después de 6 semanas in vitro. Se observaron diferentes etapas de E. granulosus en el medio de cultivo bifásico, incluyendo PSCs invaginadas (Figura 2A), PSCs evaginadas (Figura 2B) y gusanos estrobilados con formación proglotides primera y tercera (Figura 2C-E). Los protoescoleces y los gusanos estrobilados obtenidos de cultivos monofásicos y bifásicos, respectivamente, fueron transfectados con lentivirus que expresan GFP (Figura 3). Para evitar efectos de autofluorescencia, las observaciones microscópicas se compararon con la fluorescencia de fondo en los tres grupos de muestras, y todas las muestras por encima de este nivel de fondo se consideraron transfectadas.

Ajustamos la iluminación de campo y bajamos el obturador para evitar cualquier posible emisión de autofluorescencia en las muestras de control para cada tratamiento. Luego verificamos muestras tratadas con vectores lentivirales, en las que la emisión de luz verde contra un campo negro se consideró una transducción transitoria efectiva. Las células HEK293T, el control del proceso de transducción transitoria, expresan claramente la GFP (Figura 3D). Los gusanos adultos expresaron GFP más claramente en la capa tegumental (Figura 3F); sin embargo, las PSC demostraron un nivel algo más bajo de expresión de GFP después de 48 h. Algunos residuos de líquido de quiste y / o restos de la capa germinal alrededor de las PSC causaron cierta fluorescencia en el fondo en las muestras transfectadas. La intensidad de la fluorescencia en las células HEK293T y los gusanos estrobilados aumentó después de 24 h y 48 h (se observaron cambios menores en las PSC).

Figura 1: Presentación esquemática del protocolo de estudio. Abreviatura: PSCs = protoscoleces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Las diferentes etapas de Echinococcus granulosus en medio de cultivo bifásico. (A) PSCs invaginadas, (B) PSCs evaginadas, (C, D) gusanos en proceso de estrobilación, (E) gusanos estrobilados con tercera formación proglótida, (F) gusanos en diferentes etapas de estrobilación en el medio de cultivo. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Transducción transitoria de diferentes etapas de Echinococcus granulosus y la línea celular de control en microscopía de luz y fluorescencia. (A,D) Células HEK293T como control del proceso de transducción, (B, E) protoscoleces, y (C, F) gusanos estrobilados. (G, H, I) Microscopía mixta de luz y florescencia. Barras de escala = 50 μm, 100 μm y 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Mapa del vector de clonación y expresión de aDNc pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.