Describimos una técnica de transducción transitoria rápida en diferentes etapas de desarrollo de Echinococcus granulosus utilizando vectores lentivirales de tercera generación.
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Artículo de método
Transducción transitoria de las formas estrobiladas de Echinococcus granulosus
En este artículo
Resumen
Resumen
La equinococosis quística o enfermedad hidatídica es una de las enfermedades parasitarias zoonóticas más importantes causadas por Echinococcus granulosus, una pequeña tenia que se alberga en el intestino de los caninos. Existe una necesidad urgente de investigación genética aplicada para comprender los mecanismos de patogénesis y control y prevención de enfermedades. Sin embargo, la falta de un sistema eficaz de evaluación de genes impide la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus . El presente estudio demuestra el potencial de transducción transitoria del gen lentiviral en las formas metacestoide y estrobilada de E. granulosus. Los protoescoleces (PSC) se aislaron de quistes hidatídicos y se transfirieron a medios de cultivo bifásicos específicos para convertirse en gusanos estrobilados. Los gusanos fueron transfectados con lentivirus cosechados de tercera generación, junto con células HEK293T como control del proceso de transducción. Se detectó una pronunciada fluorescencia en los gusanos estrobilados durante 24 h y 48 h, lo que indica una transducción lentiviral transitoria en E. granulosus. Este trabajo presenta el primer intento de transducción transitoria basada en lentivirus en tenias y demuestra los resultados prometedores con implicaciones potenciales en estudios experimentales sobre la biología de los gusanos planos.
Introducción
La equinococosis quística (CE) es una de las enfermedades helmínticas más importantes causadas por Echinococcus granulosus, una pequeña tenia dentro de la familia Taeniidae 1,2. Se han llevado a cabo extensos estudios sobre el inmunodiagnóstico y el desarrollo de vacunas para E. granulosus. Sin embargo, el conocimiento inadecuado sobre las bases moleculares de la biología del parásito plantea importantes limitaciones en el diagnóstico, manejo y prevención de la enfermedad hidatídica 3,4,5,6.
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el Instituto Nacional para el Desarrollo de la Investigación Médica y el Comité de Revisión de Ética en investigación, No. 958680. Los lentivirus se clasifican como organismos BSL-2; por lo tanto, todos los procedimientos de cultivo de laboratorio en este protocolo se llevaron a cabo utilizando prácticas de laboratorio estériles y se llevaron a cabo bajo una campana de flujo laminar de acuerdo con las pautas de los NIH. La Figura 1 muestra una presentación esquemática del protocolo de estudio para las diferentes etapas de E. granulosus .
1. Recolección de quistes hid....
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Resultados
Aquí, describimos una técnica de transducción transitoria rápida y eficiente en E. granulosus mediante el uso de vectores lentivirales de tercera generación. Cultivamos PSCs en un medio de cultivo bifásico para obtener gusanos estrobilados, como se describió anteriormente25,26. Los protoscoleces se convierten en gusanos estrobilados después de 6 semanas in vitro. Se observaron diferentes etapas de E. granulosus en el medio de cultivo bi.......
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Discusión
Comprender las bases moleculares de los nematodos y la biología de Platyhelminthes es crucial para comprender la patogenicidad de los parásitos zoonóticos27. La falta de un sistema eficaz de evaluación de genes es un obstáculo importante para la interpretación directa de la genética funcional de los parásitos cestodos, incluidas las especies de Echinococcus 12,27. El presente estudio demuestra el excelente potencial del lentivirus.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Comité de Subvenciones para Investigadores de Élite bajo el número de premio 958680 del Instituto Nacional para el Desarrollo de la Investigación Médica (NIMAD), Teherán, Irán.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de cultivo de 12 pocillos | SPL Life Sciences | 30012 | |
| Matraz de cultivo de 25 cm2 | SPL Life Sciences | 70325 | |
| Placas de cultivo de 6 pocillos | SPL Life Sciences | 30006 | |
| Cloruro de calcio | Sigma-Aldrich | C4901-500G | Concentración de trabajo: 2.5 mM |
| CMRL 1066 medio | Thermo Fisher Scientific | 11530037 | |
| CO2 | incubadora memmert | ICO150 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| Bilis | de perro Aislado de un perro sacrificado y esterilizado por 0.2 μ m filtro de jeringa | ||
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | preparar 0.1% de Eosina para la prueba de exclusión |
| de trabajo Suero fetal bovino (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | Inactivación de calor de FBS (30 min en 40 ° C) |
| Suero de ternera fetal (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100ml | Inactivación del calor de FCS (30 min en 40 ° C) |
| HEK293T células | BONbiotech | BN_0012.1.14 | Riñón embrionario humano 293T |
| HEPES solución salina tamponada (HBS) | Sigma-Aldrich | 51558-50ML | 2x concentrado |
| Microscopio de fluorescencia invertida | OLYMPUS | IX51 | |
| Penicilina | Sigma-Aldrich | P3032-10MU Concentración de | trabajo: 100 UI/mL |
| Pepsina | Roche | 10108057001 | Concentración de trabajo: 2 mg/mL, pH 2 |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | Este reactivo se resuelve en menos de 1 min en D.W |
| Polybrene (reactivo de transfección) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Medio RPMI | BioIdea | BI-1006-05 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| Estreptomicina | Sigma-Aldrich | S9137-25G | Concentración de trabajo: 100 μ g/mL |
| Plásmido lentiviral de tercera generación (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | Vector de transferencia (obtenido comercialmente del Departamento de Investigación de Medicina Molecular del Centro Académico Iraní para la Educación, la Cultura y la Investigación (ACECR), Mashhad, Irán) |
| Plásmido lentiviral de tercera generación (pLPI y pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | Vector auxiliar (obtenido comercialmente del Departamento de Investigación de Medicina Molecular del Centro Académico Iraní para la Educación, la Cultura y la Investigación (ACECR), Mashhad, Irán) |
| Plásmido lentiviral de tercera generación (pMD2G) | Plásmido Addgene 12259 | Vector auxiliar (obtenido comercialmente del Departamento de Investigación de Medicina Molecular del Centro Académico Iraní para la Educación, la Cultura y la Investigación (ACECR), Mashhad, Irán) | |
| Tampón Tris/EDTA (TE) | DNAbiotech | DB9713-100ml | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T9935-50MG | 1x soluciones de trabajo (pH 7.4– 7.6) |
Referencias
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. ....
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Reimpresiones y permisos
