Evaluación cuantitativa de la macropinocitosis en células hiperactivas mTORC1 mediante citometría de flujo

Resumen

Este protocolo proporciona herramientas experimentales para evaluar la absorción macropinocítica de nutrientes (carbohidratos y proteínas) por parte de las células hiperactivas mTORC1. Se describen los pasos detallados para cuantificar la absorción de dextrano marcado con fluorescencia y albúmina sérica bovina (BSA).

Resumen

La macropinocitosis es un proceso endocítico altamente conservado y dependiente de actina que permite la absorción de material extracelular, incluyendo proteínas y lípidos. En las células en proliferación, la macropinocitosis puede entregar nutrientes extracelulares al lisosoma, procesados en bloques de construcción de macromoléculas críticas. Estudios recientes han puesto de manifiesto la dependencia de múltiples cánceres de la macropinocitosis, incluidos el cáncer de mama, colorrectal y de páncreas. Se cree que las mutaciones de Ras son los eventos impulsores detrás del inicio de la macropinocitosis, lo que conduce a la activación de procesos anabólicos celulares a través de la vía de señalización mTORC1. Curiosamente, mTORC1 también puede ser activado por la macropinocitosis independientemente de Ras. Por lo tanto, la macropinocitosis representa una vulnerabilidad metabólica que puede aprovecharse para atacar los tumores macropinocíticos limitando su acceso a los nutrientes de forma terapéutica.

En el complejo de esclerosis tuberosa (TSC) y la linfangioleiomiomatosis (LAM), la hiperactivación de mTORC1 conduce a una mayor macropinocitosis y reprogramación metabólica. En este trabajo describimos un protocolo basado en citometría de flujo para evaluar cuantitativamente la macropinocitosis en células de mamíferos. Se emplean MEFs deficientes en TSC2, que exhiben una activación aberrante de mTORC1 y se ha demostrado que tienen un aumento de la macropinocitosis en comparación con las células que expresan TSC2. Las células tratadas con inhibidores farmacológicos de la macropinocitosis se incuban con dextrano de 70 kDa, marcado con fluorescencia, fijable con lisina, o con albúmina sérica bovina (BSA) marcada con fluorescencia mediante citometría de flujo. Hasta la fecha, se han desarrollado técnicas sólidas basadas en imágenes para evaluar cuantitativamente la macropinocitosis en células tumorales in vitro e in vivo. Este análisis proporciona una evaluación cuantitativa de la macropinocitosis en múltiples condiciones experimentales y complementa las técnicas existentes basadas en imágenes.

Introducción

La macropinocitosis es un proceso endocítico dedicado a la absorción masiva de material extracelular seguido de la formación de macropinosomas, ya sea reciclados a la membrana plasmática o fusionados con lisosomas para degradar la carga internalizada ^1,2. Aunque la absorción de la carga no es selectiva, la macropinocitosis es un proceso de varios pasos, estrictamente regulado por las GTPasas Rab y los fosfolípidos de membrana ^3,4. En particular, las células cancerosas emplean la macropinocitosis para internalizar nutrientes extracelulares, incluidas proteínas, polisacáridos y lípidos. La macropinocitosis en las células cancerosas es activada por oncogenes aguas abajo de Ras o v-Src como un mecanismo para apoyar su proliferación, especialmente en condiciones de estrés nutricional ^5,6. Por lo tanto, la macropinocitosis representa un nuevo enfoque terapéutico para atacar las células cancerosas mediante la interrupción de las vías de absorción de nutrientes ^7,8.

En el complejo de esclerosis tuberosa (TSC) y la linfangioleiomiomatosis (LAM), las mutaciones de pérdida de función en TSC1 o TSC2 conducen a la hiperactivación de la diana mamífero/mecanicista del complejo 1 de rapamicina (mTORC1)⁹. Se sabe que la activación aberrante de mTORC1 impulsa una amplia reprogramación metabólica, incluida la absorción y utilización de glucosa y glutamina, una mayor síntesis de ácidos nucleicos, síntesis de lípidos y autofagia^10,11. Para compensar este aumento de las demandas anabólicas, las células hiperactivas mTORC1 aumentan la absorción de nutrientes exógenos a través de la macropinocitosis y mejoran la degradación lisosomal de la carga internalizada¹². En un trabajo reciente, identificamos ritanserina, un inhibidor de la diacilglicerol quinasa alfa (DGKA) como un agente que inhibe selectivamente la proliferación de células deficientes en TSC2 ¹³. El DGKA es una quinasa lipídica que metaboliza el diacilglicerol a ácido fosfatídico (PA)¹⁴. El PA es una segunda molécula mensajera crucial que también desempeña un papel vital en el mantenimiento de la homeostasis de la membrana celular. Sorprendentemente, ritanserina inhibe fuertemente la macropinocitosis al reprogramar el metabolismo de los fosfolípidos en las células deficientes en TSC2. Por lo tanto, dirigirse a la vía de absorción de nutrientes de la macropinocitosis en células deficientes en TSC2 puede proporcionar nuevos enfoques terapéuticos en TSC y LAM.

La cuantificación de la absorción de macropinocíticos in vitro e in vivo puede proporcionar información crucial sobre la regulación de la formación de macropinosomas y acelerar el descubrimiento de mecanismos moleculares, al tiempo que identifica nuevos enfoques terapéuticos ^2,6. Hasta la fecha, se han desarrollado múltiples metodologías que cuantifican adecuadamente la absorción macropinocítica de dextrano fluorescente tanto in vitro como in vivo ^2,15. Aquí describimos un enfoque basado en citometría de flujo para evaluar directamente la cantidad de dextrano y albúmina internalizados en células hiperactivas mTORC1 (Figura 1). Este método se puede utilizar para analizar múltiples condiciones experimentales en paralelo y complementa los enfoques existentes basados en imágenes.

Figura 1. Flujo de trabajo para la evaluación de la macropinocitosis en células de mamíferos. Las células se siembran en placas de seis pocillos y posteriormente se tratan con compuestos de interés. Se añade dextrano fluorescente o BSA durante 60 min, y la absorción se inhibe mediante el lavado con PBS helado. Las células se fijan con paraformaldehído y la intensidad de la fluorescencia se cuantifica mediante citometría de flujo. Las celdas están cerradas y los datos se analizan con el software adecuado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. Tratamiento celular

Día 1

1. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) deficientes en TSC2 y que expresan TSC2 por triplicado, en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos utilizando DMEM, suplementado con FBS al 10%. Las células deben tener un 60-70% de confluentes para el día 3.
   1. Siembre pozos de control adicionales para cada condición de medicamento que no se teñirán con FITC-Dextrano o TMR-BSA.

Día 2

2. Aspire cuidadosamente los medios y enjuague las celdas dos veces con PBS a temperatura ambiente.
   1. Trate las células con vehículo (DMSO), 100 μM de ácido fosfatídico (PA), 25 μM de EIPA, 10 μM de ritanserina o una combinación de PA y ritanserina. Utilice DMEM suplementado con 1% de FBS.
      NOTA: El volumen de DMSO debe ser igual al volumen máximo de solvente utilizado en las condiciones de tratamiento. Por ejemplo, si se utilizan 10 μL de EIPA, el volumen de DMSO en las condiciones del vehículo también debe ser de 10 μL.

Día 3

3. Sustituya los medios por DMEM sin suero que contenga los fármacos mencionados anteriormente y 0,5 mg/ml de FITC-Dextran o 0,5 mg/ml de TMR-BSA 16 h después del tratamiento. Incubar las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C/5% CO₂ durante 60 min.
   NOTA: Para minimizar el fotoblanqueo de los fluoróforos, los tubos FITC-Dextrano y TMR-BSA deben envolverse en papel de aluminio y el experimento debe realizarse en un gabinete de cultivo celular con las luces apagadas.
4. Aspire los medios y lávelos dos veces con PBS helado.
   1. Separe las células con 500 μL de tripsina. Coloque las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C/5% CO₂ durante 2-3 min.
      NOTA: Asegúrese de que todas las células estén separadas observándolas bajo un microscopio de campo claro.
   2. Con una punta de pipeta limpia cada vez, recoja las células en tubos de 1,5 ml con DMEM suplementado con FBS al 1% en hielo.
   3. Células de pellets por centrifugación a 425 x g durante 2 min a 4 °C.
   4. Aspirar el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender el pellet celular con 50 μL de paraformaldehído al 2%.
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es altamente tóxico y debe manipularse bajo una campana extractora adecuada. Los residuos que contienen formaldehído deben eliminarse de acuerdo con las directrices institucionales.
   1. Incubar las células a temperatura ambiente durante 10 min.
   2. Agregue 1 ml de PBS helado a cada tubo y vuelva a suspender el pellet celular suavemente. Coloque los tubos sobre hielo.
6. Centrifugar las celdas a 425 x g durante 2 min a 4 °C.
7. Aspirar el sobrenadante.
   1. Resuspender el pellet celular en 300 μL de PBS helado.
   2. Transfiera las células a los tubos FACS apropiados en hielo.
   3. Proceda con la citometría de flujo.

2. Citometría de flujo

1. Agite brevemente las celdas antes de insertarlas en el portamuestras FACS.
2. Usando un flujo de baja velocidad, compuerta las células vivas de cada muestra no teñida (control negativo) utilizando la potencia láser adecuada como se ve en la Figura 2A. Este paso difiere según los instrumentos y deberá optimizarse para cada experimento. Ajuste la potencia tanto para la dispersión directa (FSC) como para la dispersión lateral (SSC) para que las células vivas se distingan de los residuos o los grupos de células.
3. Con la función de puerta automática, seleccione las poblaciones de células vivas para cada muestra, evitando los restos de células y los grupos de células.
   NOTA: Todos los eventos de la célula (independientemente de la compuerta) son registrados en última instancia por el citómetro. Por lo tanto, seleccionar una puerta en este paso no es crítico.
4. Registre la intensidad de fluorescencia de cada muestra utilizando los láseres verdes o rojos adecuados.

3. Análisis de citometría de flujo

1. Celdas de puerta que utilizan parámetros de dispersión frontal y lateral. Aplique la misma puerta a todas las muestras.
2. Cree histogramas para la fluorescencia en cada muestra como se muestra en la Figura 2B.
3. Dentro de cada puerta de celda, calcule la intensidad de fluorescencia media/mediana para todas las muestras.
4. Exportar datos para un análisis estadístico adecuado.
   NOTA: Durante el análisis de datos, la intensidad de fluorescencia media/mediana de cada muestra debe normalizarse restando los valores de la muestra no teñida.

Resultados

La ritanserina inhibe la macropinocitosis en células deficientes en TSC2
Hemos demostrado previamente que la absorción de nutrientes por parte de los macropinocíticos se triplica en las células deficientes en TSC2 en comparación con las células que expresan TSC2 ¹⁶. En TSC y LAM, la macropinocitosis está mediada por la diacilglicerol quinasa alfa (DGKA). El producto metabólico de DGKA es el ácido fosfatídico (PA), un ...

Discusión

En este trabajo describimos un enfoque cuantitativo para evaluar la macropinocitosis mediante citometría de flujo. Este método proporciona una medición precisa y rápida de la carga macropinocítica marcada con fluorescencia, dextrano y albúmina. Estudios previos han caracterizado cuidadosamente el índice macropinocítico de las células cancerosas utilizando enfoques de microscopía confocal^15,20. Aunque estos métodos cuantifican con...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Gibco	11965-092 Medios de	crecimiento
EIPA (amilorida)	Sigma Aldrich	A3085	Inhibidor de la macropinocitosis
FBS	R& D Systems	S11150	Suero fetal bovino
FITC-Dextran	Invitrogen	D1822	Polisacárido fluorescente (70kDa)
Parafolmadehído	Pierce	28906	Agente de fijación
PBS	Gibco	10010-023	Tampón de fosfato
Penicilina/Estreptomicina	salina Sigma Aldrich	P4458-100ML	Antibióticos
de cultivo celularÁcido fosfatídico	Avanti	840101P	Fosfolípido derivado del huevo
Ritanserina	Tocris	1955	Inhibidor de DGKA
TMR-BSA	Invitrogen	A23016	Albúmina fluorescente
Tripsina	Sigma Aldrich	25300-054 Agente de	disociación