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Artículo de método

Producción recombinante de endoglicosidasas bifidobacterianas para la liberación de N-glicanos

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DOI:

10.3791/62804

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20 de julio de 2021

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1Department of Molecular Biology and Genetics, Çanakkale Onsekiz Mart University, 2Uluova Dairy Farm, 3Department of Nutrition, University of Nevada, 4Department of Food Science and Technology, University of Nebraska, 5Evolve BioSystems Inc., 6Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 7Department of Chemistry, Hacettepe University

En este artículo

Resumen

Las bifidobacterias poseen una capacidad genómica única para la escisión de N-glicanos. La producción recombinante de estas enzimas sería una herramienta nueva y prometedora para liberar N-glicanos bioactivos de sustratos ricos en glicoproteínas como el calostro.

Resumen

La glicosilación de proteínas es una modificación postraduccional diversa y común que se ha asociado con muchas funciones importantes, como la función de las proteínas, incluido el plegamiento de proteínas, la estabilidad, la protección enzimática y el reconocimiento biológico. Los N-glicanos unidos a las glicoproteínas (como la lactoferrina, la lactadherina y las inmunoglobulinas) no pueden ser digeridos por el huésped y llegan al intestino grueso, donde son consumidos por ciertos microbios beneficiosos. Por lo tanto, se consideran compuestos prebióticos de próxima generación que pueden estimular selectivamente los microorganismos beneficiosos del microbioma intestinal. Sin embargo, el aislamiento de estas nuevas clases de prebióticos requiere nuevas enzimas. Aquí, describimos la producción recombinante de nuevas glicosidasas a partir de diferentes cepas de bifidobacterias (aisladas de bebés, conejos, pollos y abejorros) para mejorar el aislamiento de N-glicanos de glicoproteínas. El método presentado en este estudio incluye los siguientes pasos: clonación molecular de genes de bifidobacterias mediante una estrategia de clonación recombinatoria in vivo, control del éxito de la transformación, inducción de proteínas y purificación de proteínas.

Introducción

La glicosilación es una modificación postraduccional muy importante que se observa en las proteínas. Aproximadamente más del 50% de las proteínas se encuentran en sus formas glicosiladas en los eucariotas. La N-glicosilación y la O-glicosilación son los dos tipos principales de glicosilación 1,2. Los glicanos ligados a O (O-glicanos) se unen covalentemente a las proteínas a través de N-acetilgalactosamina al grupo hidroxilo de un residuo de aminoácido de serina (Ser) o treonina (Thr). Los glicanos ligados a N (N-glicanos) son oligosacáridos complejos, que se unen covalentemente a la asparagina (Asn) residuo de aminoácidos de las proteínas a través de la N-acetilglucosamina (GlcNAc) en una secuencia particular de aminoácidos comoN-X-Ser/Thr y una menos común, comoN-X-Cys (cisteína) (donde X podría ser cualquier aminoácido excepto la prolina)3,4. El núcleo básico de N-glicano consta de dos residuos de HexNAc y tres de manosa. La elongación adicional de este núcleo común con otros monosacáridos a través de las enzimas glicosiltransferasa y glicosidasa determina el tipo de N-glicanos en función del grado de ramificación y el tipo de enlace5. Los N-glicanos generalmente se agrupan en tres clases principales: manosa alta (HM), tipo complejo (CT) e híbrido (HY)6.

Los N-glicanos son compuestos no digeribles por los organismos huéspedes debido a la falta de enzimas glucósidos hidrolasas. Estos compuestos llegan al intestino delgado/grueso en una forma no digerida, donde miles de especies bacterianas diferentes los utilizan, y pueden actuar como prebióticos al promover microbios intestinales especializados, especialmente las especies de Bifidobacterium 7. Hallazgos recientes demostraron que los N-glicanos estimulan selectivamente el crecimiento de ciertas especies bacterianas 8,9. Los N-glicanos liberados por las glicoproteínas de la leche bovina estimularon selectivamente el crecimiento de la subespecie infantis (B. infantis) de Bifidobacterium longum, que es una especie bifidobacteriana crucial en el intestino del lactante, pero otras especies de bifidobacterias como Bifidobacterium animalis (B. animalis) no utilizaron estos compuestos9. Además, un reciente estudio in vivo demostró que 19 N-glicanos únicos de la lactoferrina e inmunoglobulinas de la leche estimulan selectivamente el crecimiento de B. infantis8. Especialmente, B. infantis posee una capacidad genómica para la escisión y el metabolismo de los glicanos. Una Endo-β-N-acetilglucosaminidasa (EndoBI-1), que pertenece a la familia de las glicosilhidrolasas 18, producida recombinantemente a partir de B. infantis ATCC 15697, mostró una alta actividad sobre las glicoproteínas de la leche en condiciones in vitro 9,10. Esta nueva enzima glucósido hidrolasa puede escindir las partes N-N-diacetilquitobiasa que se encuentran en los N-glicanos 10,11. La actividad de EndoBI-1 no se ve afectada por la fucosilación del núcleo y las diferentes condiciones de reacción, como alta temperatura, pH, tiempo de reacción, etc. 3,11,12. Esta característica única de las glucósidos hidrolasas bifidobacterianas proporciona una herramienta prometedora para la producción de N-glicanos a partir de sustratos ricos en glicoproteínas como el calostro bovino13,14.

Varios métodos de desglicosilación desarrollados química y enzimáticamente han sido ampliamente utilizados para obtener N-glicanos y O-glicanos a partir de glicoproteínas 2,15. Los métodos químicos son ampliamente utilizados en glicobiología para la desglicosilación de glicoproteínas debido a su facilidad de uso, bajo costo y alta especificidad del sustrato16. Los métodos de desglicosilación química más comunes son la eliminación β y la hidratación17. Entre estos métodos, la eliminación de β se basa en el principio de escisión de los glicanos de las glicoproteínas mediante la exposición de las glicoproteínas a condiciones alcalinas. Los glicanos liberados pueden degradarse durante el proceso debido a las reacciones de β-eliminación, pero este problema puede prevenirse utilizando agentes reductores como el borohidruro de sodio (NaBH4)18,19,20. Existen diferentes limitaciones en el método de eliminación β. Los agentes reductores convierten los glicanos en alditoles, evitando que se unan a un fluoróforo o cromóforo. Por lo tanto, el desafío de monitorear la liberación de glicanos se vuelve difícil19,20. Debido al alto contenido de sal en la etapa de limpieza del método, la elución puede resultar en pérdidas de muestras20. Otro método para liberar glicano de las glicoproteínas es el método de la hidracina basado en el principio de la reacción de hidrólisis tras la adición de hidracina anhidra a la glicoproteína. Dado que permite controlar el aislamiento de glicanos mediante el cambio de las condiciones de reacción, como la temperatura, el método de hidrazinación ha sido ampliamente utilizado en glicobiología21. La desglicosilación química también puede llevarse a cabo utilizando la formulación anhidra de fluoruro de hidrógeno y ácido trifluoroacético, además de otros métodos de desglicosilación química 16,22,23. La liberación enzimática de N-glicanos a partir de glicoproteínas es comúnmente realizada por peptidil-N-glicosidasas (PNGasas) que generalmente liberan N-glicanos, independientemente de su tamaño y carga 24,25,26,27. Al igual que los métodos de desglicosilación química, el proceso de desglicosilación enzimática tiene diferentes desafíos. Las PNGasas muestran actividad en presencia de varios detergentes utilizados, lo que aumenta la accesibilidad de la enzima a los glicanos. Sin embargo, estos tratamientos severos podrían alterar los glicanos nativos y las estructuras polipeptídicas restantes28. Es posible que las PNGasas no escindan los glicanos cuando hay una fucosa unida a la N-acetilglucosamina29. Varias endoglicosidasas como F1, F2 y F3 muestran más actividad en las proteínas nativas que las PNGasas. Estas endoglicosidasas tienen baja actividad en los glicanos de antenas múltiples, mientras que el nuevo EndoBI-1 resistente al calor es eficaz en todos los tipos de N-glicanos 10,11,28. Con respecto a las limitaciones de los métodos actuales, es obvio que aún se requieren nuevas enzimas para una liberación efectiva de glicanos sin ninguna restricción. Para este propósito, las especies de bifidobacterias, que tienen una gran isla genómica que codifica varias enzimas glucósidos hidrolasas, permiten escindir los N-glicanos de las glicoproteínas 30,31. En este contexto, el objetivo general de este estudio es descubrir nuevas glicosidasas de las distintas especies de bifidobacterias. Para producir de forma recombinante estas enzimas, se utilizan diferentes etiquetas de fusión para mejorar su producción, así como su actividad.

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Protocolo

1. Clonación molecular de genes bifidobacterianos

  1. Anamplificación por PCR de genes diana mediante tres conjuntos de cebadores vectoriales (N-His, C-His y N-His SUMO)
    1. Fabricar 100 μM de soluciones de cebadores (oligómeros) añadiendo agua estéril en las cantidades determinadas por la empresa. Preparar 10 μM de nuevas existencias a partir de estas existencias para utilizarlas en la amplificación por PCR de los genes diana.
    2. Prepare la mezcla de PCR (volumen total 50 μL) con 25 μL de mezcla maestra, 1 μL de cebador directo e inverso a 0,2 μM, 21 μL de agua destilada sin DNasa/RNasa y 2 μL de ADN molde (células bacterianas) en los tubos de PCR. Revuelva suavemente la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
      NOTA: La mezcla maestra (Lucigen) utilizada para la PCR contiene ADN polimerasa Taq con alta pureza y alta actividad y puede funcionar a temperaturas más altas para una amplificación confiable de plantillas de hasta 5 kb.
    3. Configure el programa de PCR de la siguiente manera: paso inicial de desnaturalización a 95 °C durante 5 min para la liberación de ADN genómico, luego 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, recocido a 60 °C durante 30 s y elongación a 72 °C durante 1 min, y la extensión final a 72 °C durante 10 min.
    4. Compruebe los productos de PCR mediante el método de electroforesis en gel de agarosa con un sistema de documentación de gel después de ejecutarlos a 100 V durante 60 min en el gel de agarosa al 1%. Mezcle los productos de PCR y la escalera de ADN con el colorante de carga mezclando en una proporción de 1:5 (5 μL de producto de PCR + 1 μL de colorante de carga y 5 μL de escalera de ADN de 1 kb + 1 μL de colorante de carga) para cargar en el gel (Figura 1).
    5. Mida las concentraciones de ADN de los productos de PCR utilizando un fluorómetro antes de la etapa de clonación molecular.
      NOTA: Las concentraciones de productos de PCR deben estar en el rango requerido para la clonación molecular (25-100 ng/μL).
  2. Preparación de medio de agar caldo de lisogenia (LB) para clonación molecular
    1. Disolver 12,5 g de LB y 6 g de agarosa en 500 mL de dH2O y esterilizar en autoclave el medio de agar LB (esterilización a 121 °C durante 20 min).
    2. Disolver 15 mg de kanamicina con 1 mL de dH2O y conservar a -20 °C.
    3. Después de la esterilización en autoclave, agregue 1 mL de kanamicina en el frasco que contiene los 500 mL estériles de medio de agar LB. La concentración final de kanamicina es de 30 μg/mL. Vierta 25 mL de medio de kanamicina LB agar en cada placa en el gabinete del laboratorio.
  3. Transformación por choque térmico de células de E. coli químicamente competentes
    1. Agregue de 1 a 3 μL (25 a 100 ng) de los productos de PCR para cada cepa en el tubo, incluyendo 40 μL de células de E. coli químicamente competentes. A continuación, añada 2 μL del ADN vectorial al mismo tubo. Agite suavemente con la punta de la pipeta y transfiera las mezclas a tubos de centrífuga de 15 ml.
      NOTA: Realice este paso sobre hielo. No pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar para evitar burbujas de aire y calentar inadvertidamente las celdas.
    2. Incubar los tubos que contienen las células competentes y el ADN en hielo durante 30 min. Aplique un choque térmico a la mezcla en un baño de agua a 42 °C durante 45 s. Coloque estos tubos en hielo inmediatamente e incube durante 2 minutos.
    3. Añadir 960 μL del medio de recuperación, utilizado para la recuperación rápida de células después de la clonación molecular, a las células de los tubos e incubar los tubos a 250 rpm durante 1 h a 37 °C en una incubadora de agitación.
    4. Placa de 100 μL de células transformadas en placas de agar LB que contienen 30 μg/mL de kanamicina. Utilice únicamente células de E. coli químicamente competentes como control negativo.
      NOTA: Coloque placas de agar LB que contengan 30 μg/mL de kanamicina preparada en el paso 1.2.2 en la incubadora a 37 °C antes de usar.
    5. Incubar todas las placas durante la noche a 37 °C en atmósfera ambiente (Figura 2).
  4. Preparación del medio LB para la PCR de colonias
    1. Disolver 7,5 g de LB con 300 mL de dH2O en un frasco y esterilizar en autoclave el medio LB (esterilización a 121 °C durante 20 min).
    2. Disolver 9 mg de kanamicina (30 μg/mL) con 1 mL de dH2O y poner a -20 °C. Después de la esterilización en autoclave, agregue 1 mL de kanamicina en el frasco que contiene los 300 mL estériles de medio LB. Almacene el medio de cultivo líquido a +4 °C hasta su uso.
  5. Cribado de transformantes por PCR de colonias
    1. Para confirmar que todos los transformantes portan los genes recombinantes, seleccione las colonias al azar y amplifique los genes objetivo mediante PCR utilizando los cebadores de secuenciación suministrados con el kit de clonación.
    2. Realice todos los pasos con hielo y enfríe previamente todos los tubos de PCR y los tubos de 15 ml antes de usarlos.
    3. Con una punta de pipeta, transfiera la mitad de una colonia seleccionada al tubo de PCR para cada muestra. Tome otra mitad de la colonia con la punta de la pipeta y colóquela en el tubo de 15 mL que contiene 5 mL de medio líquido LB+kanamicina (preparado en el paso 1.4). Agite los tubos de 15 ml e incube los cultivos líquidos a 250 rpm a 37 °C durante la noche en una incubadora agitadora.
    4. Coloque 50 μL de mezcla de reacción de PCR (25 μL de mezcla maestra, 1 μL de cebador directo, 1 μL de cebador inverso, 23 μL de agua destilada sin DNasa/RNasa) en todos los tubos de PCR y disperse las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
    5. Ajuste el programa de PCR a 95 °C durante 5 min para la liberación de ADN genómico mediante lisis de células bacterianas, un total de 40 ciclos de 95 °C durante 30 s para la desnaturalización inicial, 60 °C durante 30 s para el recocido, 72 °C durante 1 min para la elongación y 72 °C durante 10 min para la extensión final.
    6. Comprobar los productos de PCR mediante el método de electroforesis en gel después de ejecutarlos a 100 V durante 60 min en el gel de agarosa al 1% (Figura 3). Los detalles de la electroforesis en gel de ADN se describen en el paso 1.1.3.
    7. Prepare existencias de glicerol al 15% de los transformantes exitosos. Poner 500 μL de caldo de glicerol al 60% en los criotubos y añadir 1.500 μL del cultivo líquido de los transformantes exitosos. Almacene las existencias preparadas a -80 °C.

2. Inducción de la expresión de proteínas por L-ramnosa

  1. Preparar un precultivo con 1 L de medio líquido LB que contenga 30 μg/mL de kanamicina.
  2. Coloque 8 mL del medio LB en tubos de centrífuga de 50 mL. Utilice uno de los tubos como control negativo que contenga solo el medio líquido. Para obtener un 20% de L-ramnosa en caldo, disolver 0,5 g de L-ramnosa con 2,5 mL dedH2O y conservar a -20 °C hasta su uso.
  3. Coloque 10 μl de las reservas bacterianas en los tubos de centrífuga que contienen 8 mL de medio líquido. Véncelos suavemente e incuba a 37 °C durante toda la noche en la incubadora agitadora.
  4. Vierta 250 mL de medio líquido LB en un matraz Erlenmeyer esterilizado de 2 L.
  5. Inocular 2,5 mL del cultivo líquido durante la noche en un matraz de 2 L que contenga medio líquido LB en una proporción de 1:100 entre el matraz y el medio, e incubar a 37 °C y 150 rpm durante 4 h en la incubadora de agitación.
  6. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600) para las células bacterianas mediante un espectrofotómetro. Cuando las células alcancen la densidad óptica de 0,5-0,6, añadir 2,5 mL de ramnosa al 20% (la concentración final es del 0,2%) a los 250 mL de cultivo de LB e incubar a 37 °C durante la noche a 250 rpm en la incubadora de agitación.
  7. Transfiera el cultivo líquido a los tubos de 5 x 50 mL, centrifugue las muestras de 3724 x g durante 15 min a +4 °C y deseche el sobrenadante. Almacene los pellets a -20 °C hasta la etapa de purificación.
    NOTA: Para evaluar la expresión de proteínas con SDS-PAGE, recoja 1 mL de cultivo no inducido (cuando se cultiva a una densidad óptica de 600 nm de 0,5-0,6, sin L-ramnosa) como control y 1 mL de cultivo inducido (después de la incubación durante la noche) como muestra inducida. Microcentrifugar todas las muestras a 12.000 x g durante 1 min y resuspender las muestras inducidas y no inducidas con 50 μL y 100 μL de tampón de carga SDS-PAGE, respectivamente.

3. Lisis celular de células de E. coli químicamente competentes que contienen enzimas marcadas con His

  1. Prepare tampón de lisis pH 8,0 (50 mM de Tris-HCl, 200 mM de NaCl, 1 mM de imidazol, 1% de SDS), tampón de equilibrio pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol), tampón de lavado pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 25 mM imidazol) y tampón de elución pH 7,4 (20 mM NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazol).
  2. Coloque los tubos de 50 ml que contienen los gránulos de celda a -80 °C durante 15 minutos para congelar. A continuación, retire los pellets a -80 °C y descongele a temperatura ambiente.
  3. Añadir 5 mL de dH2O a los pellets y disolver pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar a 3724 x g durante 15 min a +4 °C y desechar el sobrenadante.
  4. Para gránulos de cultivo de 50 mL, agregue 6.300 μL de tampón de lisis y 63 μL de cóctel de inhibidor de la proteasa halt sin EDTA (proporción 1:100) en los gránulos y disuelva pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubarlos en hielo durante 30 min, vórtice cada 10 min.
  5. Ajuste el modo de pulso del sonicador a 10 s ON y 59 s OFF, y la amplitud al 37%. Coloque el tubo en un vaso de precipitados que contenga hielo y sumerja la sonda del sonicador en el tubo.
    NOTA: La sonda debe sumergirse completamente sin tocar ningún lado del tubo.
  6. Después del proceso de sonicación (6 pulsos durante 10 s con 1 min de enfriamiento), centrifugar las muestras a 3.724 x g durante 45 min a +4 °C. A continuación, recoja todas las partes sobrenadantes en un tubo y centrifuga a 3.724 x g durante 5 min a +4 °C.
  7. Recoja el sobrenadante en un tubo y tome 100 μL de la muestra para la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) en el paso 4.7. Mida las concentraciones de proteínas de las muestras con un fluorómetro.

4. Purificación de enzimas marcadas con His por el método por lotes

  1. Añadir 1 mL de resina Ni-NTA a un tubo de centrífuga y centrifugar durante 2 min a 700 x g. Retire con cuidado el tubo y deseche el sobrenadante formado.
  2. Añade 2 mL (el doble del volumen de resina) del tampón de equilibrio en el tubo y mezcla bien hasta que la resina quede completamente suspendida. Centrifugar el tubo durante 2 minutos a 700 x g y retirar y desechar con cuidado el tampón.
  3. Mezcle el extracto de proteína y el tampón de equilibrio en una proporción de 1:1 en un tubo de centrífuga. Añade la mezcla al tubo que contiene la resina y ponla en una coctelera a 150 rpm durante 30 min. Centrifugar el tubo durante 2 min a 700 x g y desechar el sobrenadante.
  4. Lavar la resina con 5 mL de tampón de lavado y centrifugar el tubo durante 2 min a 700 x g. Repita el paso de lavado hasta que la concentración del sobrenadante disminuya hasta la línea de base.
  5. Agregue 1 mL de tampón de elución en el tubo para eluir las proteínas marcadas con His unidas. Centrifugar el tubo durante 2 min a 700 x g. Guarde el sobrenadante y tome 100 μL para el análisis SDS-PAGE en el paso 4.7. Repita el paso de elución tres veces. Mida las concentraciones de cada sobrenadante usando un fluorómetro.
  6. Recoja todos los sobrenadantes en el tubo de corte de 10 kDa y centrifugue durante 2 min a 700 x g. Repita la centrifugación hasta que el volumen del sobrenadante disminuya a 200 μL pipeteando hacia arriba y hacia abajo de vez en cuando. Almacene las proteínas purificadas a -20 °C y tome 100 μL para el análisis SDS-PAGE en el paso 4.7.
    NOTA: Se debe medir la concentración de proteínas y, si la concentración es baja, centrifugar hasta que aumente.
  7. Análisis SDS-PAGE de las proteínas purificadas
    1. Prepare un gel apilante al 4% (40% acrilamida/bisacrilamida, 1 M Tris pH 6,8, 10% SDS, 10% persulfato de amonio, TEMED, dH2O) y un 12% de gel resolutivo (40% acrilamida/bisacrilamida, 1 M Tris pH 8,8, 10% SDS, 10% persulfato de amonio, TEMED, dH2O).
    2. Mezclar la muestra con 2 tampones de muestra Laemmli en una proporción de 1:1 e incubar a 95 °C durante 5 min para desnaturalizar las proteínas.
      NOTA: La concentración de proteínas de las muestras debe medirse antes de cargarlas, y el volumen cargado se basará en su concentración para una carga igual.
    3. Agregue 1x tampón de funcionamiento en el tanque y cargue las muestras y la escalera de proteínas en los pozos. Ejecute las proteínas primero a 80 V y aumente la corriente a 120 V cuando las proteínas se muevan del gel de apilamiento al gel de resolución.
    4. Pon el gel en el tinte tinte azul coomassie y ponlo en una coctelera durante 30 min. Lave el gel con una solución decolorante (250 mL dH2O + 50 mL de ácido acético (HOAc) + 200 mL de metanol) y tome la imagen (Figura 4).

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Resultados

En este estudio se seleccionaron enzimas miembro de la glicosilhidrolasa seleccionadas de diferentes orígenes. Se asumió que la aplicación conjunta de diferentes enzimas con diferentes estructuras podría proporcionar una mejor liberación de glicanos, ya que han evolucionado para ser activas en diferentes glicoproteínas. La lista de genes diana y su origen se enumeran en la Tabla 1. Las cepas bacterianas se obtuvieron de las Colecciones Coordinadas de Microorganismos de Bélgica. Los juegos de cebadores se...

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Discusión

La estrategia de clonación recombinacional in vivo utilizada para la clonación molecular de los genes objetivo proporciona resultados rápidos y fiables en comparación con otros protocolos de clonación tradicionales. Aunque existen muchos métodos convenientes para la clonación molecular, el método descrito en este artículo tiene más ventajas. El sistema de clonación in vivo , a diferencia de otros sistemas de clonación, no necesita ningún tratamiento enzimático ni purifi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio cuenta con el apoyo de TUBITAK #118z146 y Uluova Süt Ticaret A.Ş (Uluova Milk Trading Co.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
EconoTaq PLUS 2X Master MixLucigen30035-1Amplificación de genes diana (PCR)
Agua destilada sin DNasa/RNasaInvitrogen10977035Amplificación de genes diana (PCR)
Safe-Red Loading DyeabmG108-RElectroforesis en gel de ADN
1 kb Plus DNA LadderGoldBioD011-500Electroforesis
en gel de ADNKit de ensayo de proteínas QubitInvitrogenQ33211Medición de la concentración de ADN
LB Broth, Miller (Luria-Bertani)amrescoJ106-2KGMedios de cultivo bacteriano
AgaroseInvitrogen16500-500 Medios decultivo bacterianoet al.
Monosulfato de kanamicinaGoldBioK-120-5Antibiótico en medios de cultivo bacteriano
Expresso Kit de Sistema de Clonación y Expresión de Ramnosa, N-HisLucigen49011-1Kit
Clonación y Sistema de Expresión Expresso Rhamnosa, SUMOLucigen49013-1Kit de Clonación
Expresso Kit de Sistema de Clonación y Expresión de Ramnosa, C-HisLucigen49012-1Kit de clonación
Solución de glicerolSigma-Aldrich15524-1L-RPreparación de caldo de glicerol
L-ramnosa monohidratoSigma-Aldrich83650Inducción de la expresión de proteínas
2X Laemmli Sample BufferClearBandTGS10SDS-Análisis de página
SureCast 40% (c/v) AcrylamidaInvitrogenHC2040SDS-Análisis
de página SureCast APSInvitrogenHC2005SDS-Análisis de página
SureCast TEMEDInvitrogenHC2006SDS-Análisis de página
10X Running BufferClearBandTGS10SDS-Análisis de página
Triset al.BioShopTRS001.1SDS-Análisis de páginas y lisis celular
10% SDSClearBandS100SDS-Análisis
de páginas PageRuler Plus Escalera de proteínas preteñidasThermoFisher26619SDS-Análisis de páginas
ImidazolSigma-Aldrich56750Lisis celular
NaClSigma-Aldrich31434-5Kg-RLisis celular
Sodio Fosfato Monobásico Anhidroamresco0571-1KgTampón de fosfato de sodio para lisis celular
Fosfato de sodio dibásico dihidratadoet al.Sigma-Aldrich04272-1KgTampón de fosfato de sodio para lisis celular
Filtro centrífugo de corte de 10 kDa<sup>® - MERCKUFC9010Purificación de enzimas
de

Referencias

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