In vivo Detección de inmunogenicidad de vesículas extracelulares derivadas de tumores mediante citometría de flujo de células T esplénicas

Resumen

Este manuscrito describe cómo evaluar la inmunogenicidad in vivo de las vesículas extracelulares (EV) derivadas de células tumorales utilizando citometría de flujo. Los EV derivados de tumores sometidos a muerte celular inmunogénica inducida por el tratamiento parecen particularmente relevantes en la inmunovigilancia tumoral. Este protocolo ejemplifica la evaluación de los EV tumorales inmunoestimulantes inducidos por oxaliplatino, pero se puede adaptar a diversos entornos.

Resumen

La muerte celular inmunogénica de los tumores, causada por la quimioterapia o la irradiación, puede desencadenar respuestas de células T específicas del tumor al liberar patrones moleculares asociados al peligro e inducir la producción de interferón tipo I. Las inmunoterapias, incluida la inhibición del punto de control, se basan principalmente en células T preexistentes específicas del tumor para desplegar un efecto terapéutico. Por lo tanto, los enfoques terapéuticos sinérgicos que explotan la muerte celular inmunogénica como una vacuna intrínseca contra el cáncer pueden mejorar su capacidad de respuesta. Sin embargo, el espectro de factores inmunogénicos liberados por las células bajo estrés inducido por la terapia sigue estando incompletamente caracterizado, especialmente con respecto a las vesículas extracelulares (EV). Se considera que los EV, partículas membranosas a nanoescala emitidas por prácticamente todas las células, facilitan la comunicación intercelular y, en el cáncer, se ha demostrado que median el cebado cruzado contra los antígenos tumorales. Para evaluar el efecto inmunogénico de los EV derivados de tumores en diversas condiciones, se buscan métodos adaptables, escalables y válidos. Por lo tanto, aquí se presenta un enfoque relativamente fácil y robusto para evaluar la inmunogenicidad in vivo de los EV. El protocolo se basa en el análisis de citometría de flujo de células T esplénicas después de la inmunización in vivo de ratones con EV, aislados por ensayos basados en precipitaciones de cultivos de células tumorales en condiciones de terapia o estado estacionario. Por ejemplo, este trabajo muestra que la exposición al oxaliplatino de las células de melanoma murino B16-OVA resultó en la liberación de EV inmunogénicos que pueden mediar la activación de las células T citotóxicas reactivas al tumor. Por lo tanto, la detección de EV a través de la inmunización in vivo y la citometría de flujo identifica las condiciones bajo las cuales pueden surgir EV inmunogénicos. La identificación de las condiciones de liberación de EV inmunogénicos proporciona un requisito previo esencial para probar la eficacia terapéutica de los EV contra el cáncer y explorar los mecanismos moleculares subyacentes para finalmente revelar nuevos conocimientos sobre el papel de los EV en la inmunología del cáncer.

Introducción

El sistema inmunitario desempeña un papel fundamental en la lucha contra el cáncer, tanto cuando es incitado por la inhibición del punto de control inmunitario como por la eficacia de las terapias convencionales contra el cáncer. Las células tumorales que sucumben a terapias genotóxicas como los agentes quimioterapéuticos oxaliplatino y doxorrubicina, o el tratamiento con radiación ionizante pueden liberar antígenos y patrones moleculares asociados al peligro (DAMP) que potencialmente inician una respuesta inmune antitumoral ^adaptativa1. Las DAMP más destacadas, en el contexto de la muerte celular inmunogénica, incluyen señales find-me como atp....

Protocolo

Al inicio de los experimentos, los ratones tenían al menos 6 semanas de edad y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos. El presente protocolo cumple con los estándares éticos institucionales y las regulaciones locales vigentes. Los estudios en animales fueron aprobados por la agencia reguladora local (Regierung von Oberbayern, Munich, Alemania). Los posibles sesgos relacionados con el sexo no se investigaron en estos estudios.

1. Generación y aislamiento de EV derivados de células tumorales después de la exposición a la quimioterapia

1. Cultivo de células de melanoma B16 murino que expresan ovoalbúmina (B16-OVA)....

Resultados

Este protocolo está destinado a facilitar la evaluación directa y fácilmente reproducible de la inmunogenicidad de los EV derivados de tumores. De este modo, los ratones son inoculados con EV derivados de cultivos in vitro de células tumorales que expresan el antígeno modelo de ovoalbúmina de pollo (OVA). La respuesta inmune posterior se analiza en células T esplénicas a través de citometría de flujo.

La Figura 1 ofrece una visión general de los .......

Discusión

Este protocolo proporciona una evaluación inmunológica in vivo de los EV derivados de células de melanoma bajo estrés inducido por la quimioterapia mientras se adapta a los EV emitidos por varios cánceres bajo diversos tratamientos. La inmunización de ratones con EV derivados de células B16-OVA tratadas con oxaliplatino, por ejemplo, expande las células T CD8 ⁺ productoras de IFN-γ en el bazo, que se estimulan aún más mediante la incubación ex vivo con ovoalbúmina, lo que indica una respuesta.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-CD3 FITC	Biolegend		100204 Clon 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Clon GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Clon 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Clon XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Solution (1,000x)
Colador de células, 100 µ m	Greiner	542000	EASYstrainer 100 µ m
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Medio de águila modificado de Dulbecco con D-glucosa (4,5 g/L) y L-glutamina (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Suero de ternera fetal (FCS)
Tinte de viabilidad fijable eFluor 506	eBioscience, división de Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Concentrado de fijación/permeabilización	eBioscience	00-5123-43	Concentrado de fijación/permeabilización (10x)
Diluyente de fijación/permeabilización	eBioscience	00-5223-56
Ionomicina	Sigma-Aldrich	407952	de Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamina	Gibco	25030-032	L-Glutamina (200 mM)
Ovoalbúmina	InvivoGen	vac-pova	Ovoalbúmina con < 1 UE/mg de endotoxina - CAS 9006-59-1
Oxaliplatino	Farmacia del hospital
magnética PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Solución salina tamponada con fosfato sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	1514-122	Mezcla de penicilina (10.000 U/mL) y estreptomicina (10.000 ug/mL)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Forbol 12-miristato 13-acetato, ≥ 99% (HPLC)
Filtro de PVDF, 0,22 y micro; m, para jeringas	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filter Unit 0.22 & micro; m Durapore Membrana de PVDF
Tampón de lisis de glóbulos rojos	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medio con D-glucosa (2,00 g/L) y L-glutamina (300 mg/L), sin HEPES
Jeringa, 26 g	BD Biosciences	305501	1 mL Jeringas Sub-Q con aguja (0,45 mm x 12,7 mm)
Reactivo de aislamiento total de exosomas	Invitrogen	4478359	Para el aislamiento de medios de cultivo celular
β -Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β -Mercaptoetanol (50 mM)

de resonancia