Method Article

Formulación y modulación acústica de nanogotas de perfluorocarbono vaporizadas ópticamente

DOI:

10.3791/62814

⸱

July 16th, 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering and School of Electrical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las nanogotas de perfluorocarbono activadas ópticamente son prometedoras en aplicaciones de imágenes fuera del sistema vascular. Este artículo demostrará cómo sintetizar estas partículas, fantasmas de poliacrilamida de entrecruzamiento y modular las gotas acústicamente para mejorar su señal.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las microburbujas son el agente de contraste de imágenes más utilizado en ultrasonido. Sin embargo, debido a su tamaño, se limitan a compartimentos vasculares. Estas microburbujas pueden condensarse o formularse como nanogotas de perfluorocarbono (PFCnD) que son lo suficientemente pequeñas como para extravasarse y luego activarse acústicamente en el sitio objetivo. Estas nanopartículas pueden mejorarse aún más mediante la inclusión de un absorbente óptico, como un tinte orgánico infrarrojo cercano o nanopartículas (por ejemplo, nanopartículas de sulfuro de cobre o nanopartículas / nanovarillas de oro). Los PFCnD marcados ópticamente se pueden vaporizar a través de la irradiación láser en un proceso conocido como vaporización óptica de gotas (ODV). Este proceso de activación permite el uso de núcleos de perfluorocarbono de alto punto de ebullición, que no pueden vaporizarse acústicamente por debajo del umbral máximo de índice mecánico para el diagnóstico por imágenes. Los núcleos de punto de ebullición más altos dan como resultado gotas que se recondensarán después de la vaporización, lo que resulta en PFCnD "parpadeantes" que producen contraste brevemente después de la vaporización antes de condensarse nuevamente en forma de nanogotas. Este proceso se puede repetir para producir contraste bajo demanda, lo que permite la creación de imágenes sin fondo, multiplexación, superresolución y mejora del contraste a través de la modulación óptica y acústica. Este artículo demostrará cómo sintetizar PFCnD de cáscara lipídica ópticamente activables utilizando sonicación de sonda, crear fantasmas de poliacrilamida para caracterizar las nanogotas y modular acústicamente los PFCnD después de ODV para mejorar el contraste.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las microburbujas son el agente de contraste de ultrasonido más ubicuo debido a su biocompatibilidad y excelente ecogenicidad en comparación con los tejidos blandos. Esto los convierte en herramientas valiosas para visualizar el flujo sanguíneo, la delineación de órganos y otras aplicaciones1. Sin embargo, su tamaño (1-10 μm), que los hace excepcionales para la obtención de imágenes en función de su frecuencia de resonancia, restringe sus aplicaciones a la vasculatura2.

Esta limitación ha llevado al desarrollo de PFCnDs, que son nanoemulsiones compuestas de un surfactante encerrado alrededor de un núcleo de perfluorocarbono líquido. Estas nanopartículas se pueden sintetizar en tamaños tan pequeños como 200 nm y están diseñadas para aprovechar la vasculatura o los poros "permeables" y las fenestraciones abiertas que se encuentran en la vasculatura tumoral. Si bien estas interrupciones dependen del tumor, esta permeabilidad permite la extravasación de nanopartículas de ~ 200 nm - 1.2 μm dependiendo del tumor 3,4. En su forma inicial, estas partículas producen poco o ningún contraste de ultrasonido. Tras la vaporización, inducida acústica u ópticamente, la fase central cambia de líquido a gas, induciendo un aumento de dos veces y media a cinco veces en el diámetro 5,6,7 y generando contraste fotoacústico y de ultrasonido. Si bien la vaporización acústica es el método de activación más común, este enfoque crea artefactos acústicos que limitan la imagen de la vaporización. Además, la mayoría de los perfluorocarbonos requieren ultrasonido focalizado con un índice mecánico más allá del umbral de seguridad para vaporizar8. Esto ha llevado al desarrollo de PFCnD de menor punto de ebullición, que pueden sintetizarse condensando microburbujas en nanogotas9. Sin embargo, estas gotitas son más volátiles y están sujetas a vaporización espontánea10.

La vaporización óptica de gotas (ODV), por otro lado, requiere la adición de un disparador óptico como nanopartículas 11,12,13 o colorante 6,14,15 y puede vaporizar perfluorocarbonos de mayor punto de ebullición utilizando fluencias dentro del límite de seguridad ANSI 11. Los PFCnD sintetizados con núcleos de punto de ebullición más altos son más estables y se recondensarán después de la vaporización, lo que permite imágenes libres de fondo16, multiplexación 17 y superresolución18. Una de las principales limitaciones de estas técnicas es el hecho de que los PFCnD de alto punto de ebullición son ecogénicos después de la vaporización durante un corto período de tiempo, en la escala de milisegundos19, y son relativamente débiles. Si bien este problema puede mitigarse mediante vaporizaciones repetidas y promedios, la detección y separación de la señal de gotitas sigue siendo un desafío.

Inspirándose en la inversión del pulso, la duración y el contraste pueden mejorarse modificando la fase del pulso de imagen de ultrasonido19. Al iniciar el pulso de imagen de ultrasonido con una fase de rarefacción (n-pulso), tanto la duración como el contraste de los PFCnD vaporizados aumentan. Por el contrario, el inicio del pulso de imágenes de ultrasonido con una fase de compresión (pulso p), da como resultado un contraste reducido y una duración más corta. Este artículo describirá cómo sintetizar nanogotas de perfluorocarbono activables ópticamente, fantasmas de poliacrilamida comúnmente utilizados en imágenes, y demostrar la mejora del contraste y la longevidad mejorada de la señal a través de la modulación acústica.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Formulación de nanogotas de perfluorocarbono

  1. Enjuagar un matraz de fondo redondo de 10 ml con cloroformo y lavar una jeringa de vidrio hermético al gas de 10 μL y 1 ml con cloroformo aspirando repetidamente el volumen completo de la jeringa y expulsándolo un total de tres veces.
    PRECAUCIÓN: El cloroformo es volátil y puede ser tóxico si se inhala. Todo el trabajo con este disolvente debe realizarse en una campana extractora.
  2. Con ayuda de las jeringas, añadir 200 μL de DSPE-mPEG2000 (25 mg/ml), 6,3 μL de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, 25 mg/ml) y 1 ml de IR 1048 (1 mg/ml en cloroformo) en el matraz de fondo redondo. Recuerde limpiar las jeringas entre lípidos/tinte para evitar la contaminación del caldo.
    NOTA: Los tintes infrarrojos son sensibles a la luz, y el trabajo debe realizarse en condiciones de poca luz o los frascos deben cubrirse con papel de aluminio.
  3. Retire el disolvente utilizando un evaporador rotativo. Asegúrese de que el vacío se ajuste lentamente a 332 mbar para evitar golpes. Después de 5 minutos, reduzca la presión a 42 mbar para eliminar cualquier agua que pueda haber entrado en la solución.
    NOTA: La torta lipídica puede almacenarse durante la noche en un matraz de fondo redondo cubierto con parafilm a 4 °C.
  4. Suspenda la torta lipídica en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y sonicate o vórtice a temperatura ambiente durante 5 minutos o hasta que toda la torta lipídica se haya suspendido y disuelto en la solución. Sonicar durante 2 minutos adicionales para homogeneizar la solución.
  5. Transfiera la solución a un vial de vidrio de 7 ml y colóquelo en un plato de vidrio lleno de hielo para permitir que la solución se enfríe durante 5 minutos antes de agregar 50 μL de perfluorohexano con una jeringa de vidrio hermética al gas. Recuerde enjuagar la jeringa con perfluorohexano antes de dispensarla en el vial.
  6. Coloque el vial de vidrio que contiene los lípidos y el baño de hielo en el recinto del sonicador de la sonda y sumerja la punta de la sonda debajo del miniscus. Asegúrese de que los lados de la sonda sonicadora no toquen el borde del vial de vidrio.
  7. La sonda sonica la mezcla con los siguientes ajustes: Amplitud 1, Tiempo de proceso: 20 s, Pulso encendido: 1s, Pulso apagado: 5s. Luego sonicar en los siguientes ajustes: Amplitud: 50, Tiempo de proceso: 5 s, Pulso encendido: 1 s, Pulso apagado: 10 s.
  8. Transfiera la solución de nanogotas a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 minutos para separar las gotas más grandes (>1 μm) de las gotas más pequeñas.
  9. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a otro tubo de centrífuga de 1,5 ml. Lavar el sobrenadante centrifugando a 3000 x g durante 5 min para granular todas las gotas en solución. Resuspender los PFCnD en 1 ml de PBS pipeteando el pellet hacia arriba y hacia abajo y luego sonicar en un sonicador de baño durante 1 min.
  10. Mida el tamaño de las gotas utilizando la dispersión dinámica de luz (DLS). Diluir el stock de PFCnDs en 100 veces (10 μL de PFCnD en 990 μL de PBS) y bañar el sonicado para dispersar los PFCnDs antes de medir. Los resultados representativos se muestran en la Figura 1.
  11. Determine la concentración de los PFCnD utilizando el analizador de seguimiento de nanopartículas (consulte la Tabla de materiales). Diluya los PFCnD entre 100 y 1000 veces para garantizar una medición precisa de la concentración. El protocolo típicamente produce gotitas a una concentración del orden de 1010 partículas / ml.
  12. Prepare 10 ml de gel de acoplamiento de ultrasonido en un tubo de centrífuga de 50 ml y agregue 1% (v / v) o 100 μL de PFCnD para hacer una solución de ~ 108 partículas / ml. Vórtice la solución a mezclar. Centrifugar la mezcla a 4000 x g durante 3 min para eliminar las burbujas.

2. Preparación fantasma de poliacrilamida

  1. Desgasifique el agua llenando un matraz de vacío de 500 ml con 400 ml de agua desionizada, selle con un corcho de goma y conecte el matraz a la línea de vacío. Abra la línea de vacío y sumerja el fondo del matraz en el sonicador de baño. Sonicar durante 5 minutos o hasta que no se vea la formación de burbujas de gas.
  2. Prepare una solución de persulfato de amonio al 10% (APS) disolviendo 500 mg en 5 ml de agua desgasificada. Agite suavemente la solución si el persulfato de amonio no se disuelve completamente.
  3. En un vaso de precipitados de 400 ml con una barra de agitación en una placa de agitación, agregue 150 ml de agua desgasificada y 50 ml de solución de acrilamida-bisacrilamida al 40% (p/v) para formar 200 ml de solución de acrilamida-bisacrilamida al 10%. Revuelva la mezcla a 200 rpm para permitir la mezcla adecuada sin introducir burbujas.
    PRECAUCIÓN: La acrilamida es un carcinógeno, y todo el trabajo debe hacerse en una campana extractora con guantes, especialmente si se trabaja con acrilamida en forma de polvo.
  4. Pesar 400 mg de sílice y añadirlo a la solución de acrilamida-bisacrilamida al 10% del paso 2.3 para formar una solución de sílice y acrilamida al 0,2% (p/v).
    PRECAUCIÓN: La sílice cuando se inhala puede ser un carcinógeno. Todo el trabajo, incluido el pesaje, debe realizarse en una campana extractora.
  5. Prepare un molde cuadrado de 58 mm x 58 mm x 78 mm con una inclusión cilíndrica cortando las puntas de una pipeta de transferencia de plástico y apoyándola en el molde con cinta de laboratorio. Consulte la figura 2.
  6. Agregue 2 ml de solución de APS al 10% al vaso de precipitados para obtener una concentración final de 0.1% de APS y agregue 250 μL de tetrametiletilendiamina (TEMED) a la solución fantasma. Deje que la solución se agite brevemente (menos de un minuto).
  7. Vierta rápidamente la solución en el molde, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución. La solución debe polimerizarse en 10 min. Retire el fantasma pasando el extremo plano de una espátula de laboratorio alrededor del borde del molde e invirtiendo el molde.
    NOTA: Estos fantasmas se pueden reutilizar varias veces y deben sumergirse en agua y almacenarse a 4 ° C.

3. Imágenes de nanogotas de perfluorocarbono

  1. Encienda y caliente el sistema láser pulsado durante ~ 20 minutos siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que el haz de fibra óptica esté conectado correctamente a la salida del láser y que las dos patas estén colocadas correctamente dentro del soporte del haz de fibra.
  2. Encienda el sistema de imágenes de ultrasonido, conecte el transductor de imágenes de matriz (L11-4v) al sistema y fije el transductor dentro del soporte para alinear su plano de imágenes con la sección transversal del láser.
  3. Ajuste la frecuencia de repetición de pulso del sistema láser a 10Hz y coloque un medidor de potencia al final del haz de fibra para medir la energía. Sintoniza el retardo q-switch hasta que la fluencia estimada sea de 70 mJ/cm2.
    PRECAUCIÓN: Se deben usar gafas adecuadas al disparar el láser y las cortinas láser deben encerrar el espacio.
  4. Rellene uno de los canales en el fantasma de poliacrilamida con la mezcla de gel de ultrasonido/PFCnD usando una jeringa de punta deslizante de plástico de 1 ml. Cubra generosamente la parte superior del canal con gel de ultrasonido y elimine cualquier burbuja con una jeringa de punta deslizante de plástico de 1 ml. Coloque el fantasma de poliacrilamida debajo del transductor y el haz de fibras, como se muestra en la Figura 3.
  5. Utilice la plataforma combinada de imágenes de ultrasonido y elasticidad láser (CLUE) basada en el software20 para obtener imágenes PFCnD sincronizadas con activación óptica. Cambie los parámetros generales definidos por el usuario en la estructura de parámetros para imágenes: establezca la profundidad de inicio/fin en 0/40 mm, la frecuencia central en 6,9 MHz y el nombre del transductor en 'L11-4v'.
  6. Defina un nuevo RunCase y diseñe una secuencia de módulos para la activación/recondensación óptica repetida y la obtención de imágenes US de PFHnDs. Esto se hace enumerando módulos predefinidos como imágenes ultrarrápidas (mUF), láser externo (mExtLaser) e inactivo (mIdle).
    1. Repita el conjunto de secuencias mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF dos veces para adquirir datos de imágenes de n-pulso y p-pulso.
      NOTA: El primer módulo mExtLaser de cada secuencia se establece como un láser simulado configurando ExtLaser.Enable en 0 y se incluye 'mIdle' para minimizar el tiempo entre las imágenes de fondo de EE. UU. y las imágenes de EE. UU. de pulso n/p después de la activación del láser.
  7. Establezca los parámetros del módulo para cada módulo colocado en la secuencia de módulos del caso de ejecución actual. Acceda a cada parámetro del módulo por índice correspondiente a su orden en la secuencia de módulos. Los módulos ejecutarán operaciones predefinidas con los parámetros del módulo configurados por el usuario aquí.
    1. Establezca ExtLaser.QSdelay en módulos láser externos al valor del retardo del interruptor Q del láser sintonizado en el paso 3.3, en microsegundos. Este módulo espera a que se active la linterna del sistema láser y genera el disparador Q-switch después del retraso especificado en QSdelay.
    2. En el módulo de imágenes ultrarrápidas, establezca Resource.numFrame en 100, establezca SeqControl.PRI en 200 (μs) y establezca TW.polarity en 1 para el pulso P y -1 para el pulso N (consulte la figura 4 para la forma de pulso correspondiente). Este módulo transmitirá onda plana ultrarrápida de 0 grados con el tipo de pulso especificado en TW.polarity.
      1. Adquiera una ventana de imagen de apertura completa de 38,8 mm de ancho para el número de fotogramas en Resource.numFrame, intervalo de repetición de pulsos de SeqControl.PRI y, a continuación, guarde los datos para el procesamiento fuera de línea.
    3. Establezca SeqControl.lastPRI_Module en módulo inactivo en el período de tiempo entre pulsos láser (100 ms) restado por el retardo del interruptor Q, el tiempo de adquisición de datos de imágenes (20 ms) y un margen de 20 μs para que la señal viaje. Este módulo mantiene el sistema en estado de "no operación" durante el tiempo en SeqControl.lastPRI_Module para llenar el intervalo de tiempo entre el final de la adquisición de datos de imágenes y la próxima excitación de pulso láser.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La formulación exitosa y la separación centrífuga de los PFCnD deberían producir gotas de alrededor del tamaño de 200-300 nm de diámetro (Figura 1A). Las gotitas mal separadas pueden mostrar pequeños picos alrededor de 1 μm. Estas soluciones se pueden sonicar aún más para romper las gotas más grandes. El tamaño de las gotitas aumentará con el tiempo debido a la coalescencia y/o difusión en un proceso conocido como maduración de Ostwald21,22

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sonicación de la sonda es un método relativamente simple y fácil de aprender para fabricar PFCnDs. Hay algunos pasos en los que se debe tener cuidado. Al manipular cloroformo, es imperativo que se utilice una pipeta de desplazamiento positivo o jeringas de vidrio, ya que es volátil y se "filtrará" de las pipetas de desplazamiento de aire estándar. Además, si utiliza un desplazamiento positivo, asegúrese de que se utiliza una punta adecuada, ya que el cloroformo disolverá la mayoría de las puntas de plástico, lo que pu...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trabajo fue apoyado en parte por la Fundación para la Investigación del Cáncer de Mama bajo la subvención BCRF-20-043.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Persulfato de amonio (APS)VWR97064-592
1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)Avanti Polar Lipids850365CLípidos, estos se pueden comprar suspendidos en cloroformo o en forma de polvo. Para el almacenamiento a largo plazo, la forma de polvo es la mejor, pero el cloroformo es más práctico.
1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (DSPE-PEG)Ávidos Lípidos polares880120CLípidos, estos se pueden comprar suspendidos en cloroformo o en forma de polvo. Para el almacenamiento a largo plazo, la forma de polvo es la mejor, pero el cloroformo es más práctico.
Acrilamida : Solución de bisacrilamida (19:1) 40% (p/v), OmniPur®VWREM-1300solución de acrilamida, concentración más baja/ polvo
IR-1048Sigma405175Colorante infrarrojo
L11-4vVerasonics-ultrasonidotransductor de matriz lineal
Microtip 1/8"Qsonica LLC4418microtip para sonda sonicador
N, N, N′, N′ -Tetrametiletilendiamina (TEMED)VWR97064-902Se utiliza para polimerizar poliacrilamida mediante la formación de radicales libres en presencia de persulfato de amonio
Nova IIOphir-Spiricon7Z01550Medidor de potencia láser
PerfluorohexanoFluoromadoAPF-60Mperfluorocarbono líquido
Fosfato tamponado (PBS) TabletasVWR97062-732Tabletas utilizadas para fabricar PBS
Q500Qsonica LLCQ500-110Sonicador de sonda
Gel de síliceSigma-Aldrich2885002-25 μ m tamaño de partícula
Tempest 30New waveresearch-Sistemaláser pulsado
Vantage 128Verasonics-sistemaimágenes de ultrasonido de investigación
Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments Ltd-Realizamediciones de tamaño basadas en la dispersión dinámica de la luz
de

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