Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120

Summary

La optogenética es una herramienta poderosa con una amplia gama de aplicaciones. Este protocolo demuestra cómo lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul.

Abstract

Los sistemas de expresión génica inducibles son una herramienta invaluable para estudiar los procesos biológicos. Los sistemas de expresión optogenética pueden proporcionar un control preciso sobre el tiempo, la ubicación y la amplitud de la expresión génica utilizando la luz como agente inductor. En este protocolo, se utiliza un sistema de expresión optogenética para lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra. Este sistema se basa en un factor de transcripción diseñado llamado TAEL basado en un factor de transcripción activado por la luz natural de la bacteria E. litoralis. Cuando se ilumina con luz azul, TAEL se dimeriza, se une a su elemento regulador cognado llamado C120 y activa la transcripción. Este protocolo utiliza embriones transgénicos de pez cebra que expresan el factor de transcripción TAEL bajo el control del omnipresente promotor ubb. Al mismo tiempo, el elemento regulador C120 impulsa la expresión de un gen reportero fluorescente (GFP). Utilizando un panel LED simple para entregar luz azul activadora, la inducción de la expresión de GFP se puede detectar primero después de 30 minutos de iluminación y alcanza un pico de inducción de más de 130 veces después de 3 h de tratamiento de luz. La inducción de la expresión puede evaluarse mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y mediante microscopía de fluorescencia. Este método es un enfoque versátil y fácil de usar para la expresión génica optogenética.

Introduction

Los sistemas de expresión génica inducibles ayudan a controlar la cantidad, el momento y la ubicación de la expresión génica. Sin embargo, lograr un control espacial y temporal exacto en organismos multicelulares ha sido un desafío. El control temporal se logra más comúnmente^mediante la adición de compuestos de moléculas pequeñas 1 o la activación de promotores de choque^{térmico 2}. Aún así, ambos enfoques son vulnerables a problemas de tiempo, fuerza de inducción y respuestas de estrés fuera del objetivo. El control espacial se logra principalmente mediante el uso de promotores específicos de tejidos³

Protocol

Este estudio se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California Merced.

1. Cruce de peces cebra y recolección de embriones

1. Mantenga líneas separadas de pez cebra transgénico que contengan el activador transcripcional TAEL o el gen reportero controlado por C120 para minimizar la activación espuria.
2. Cruce de 6 a 8 peces cebra adultos de cada línea utilizando métodos estándar⁹ para producir embriones transgénicos dobles que contengan los componentes TAEL y C120(Figura 1B).
   NOTA: Alternativamente, ....

Results

Para esta demostración, se cruzó una línea reportera GFP sensible aC120 ( Tg (C120F: GFP)^ucm107) )con una línea transgénica que expresa TAEL-N ubicuamente desde el promotor de ubiquitina b (ubb) (Tg (ubb: TAEL-N)^ucm113)) para producir embriones transgénicos dobles que contienen ambos elementos. 24 h después de la fertilización, los embriones fueron expuestos a la activación de la luz azul, pulsados a una frecuencia de 1 h encendido / 1 h apagado. La inducción de l.......

Discussion

Este protocolo describe el uso del sistema optogenético TAEL/C120 para lograr la expresión génica inducible por la luz azul. Este sistema consiste en un activador transcripcional, TAEL, que se dimeriza al iluminar con luz azul y activa la transcripción de un gen de interés aguas abajo de un elemento regulador C120. La expresión inducida de un reportero GFP se puede detectar después de tan solo 30 minutos de exposición a la luz, lo que sugiere que este enfoque posee una cinética relativamente rápida y receptiva.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioRender herramienta de ilustración científica basada en la web	BioRender
digital CCD	Lumenara	755-107
Consola compacta de medidor de potencia y energía, LCD digital de 4"	Thorlabs	PM100D
Filtro de excitación, 545 nm	Olympus	ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit	GE Cuidado de la salud	95017-491
Instant Ocean Sal marina	Instant Ocean	SS15-10
MARS AQUA Regulable 165 W LED Luz de acuario (azul y blanco)	Amazon	B017GWDF7E
Metilcelulosa	Sigma-Aldrich	M7140
NEARPOW Interruptor temporizador digital programable	Amazon	B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR verde mezcla rápida	Quantabio	101414-286
Photoshop software de procesamiento de imágenes	Adobe
Prism software de gráficos y estadísticas	GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix	Quantabio	10142-786
QuantStudio 3 Sistema de PCR en tiempo real	Applied Biosystems	A28137
Microscopio estereoscópico	Olympus	SZX16
Tricaína (3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato)	Sigma-Aldrich	E10521
X-Cite 120 Fluorescencia Fuente de luz LED	Excelitas	010-00326R	Descontinuado. Ha sido reemplazado por el X-Cite mini+