Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto

Resumen

En este protocolo, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de insectos Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-proteína fluorescente verde (GFP) o gen terapéutico y células Sf9 infectadas con BV-AAV2-rep-cap en cultivo en suspensión. Las partículas de AAV se liberan de las células utilizando detergente, se clarifican, se purifican mediante cromatografía de columna de afinidad y se concentran mediante filtración de flujo tangencial.

Resumen

Los virus adenoasociados (AAV) son vectores prometedores para aplicaciones de terapia génica. Aquí, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de Spodoptera frugiperda (Sf9) con células Sf9 infectadas con baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gen terapéutico) y BV-AAV2-rep-cap en cultivo de suspensión sin suero. Las células se cultivan en un matraz en un agitador orbital o biorreactor de onda. Para liberar las partículas AAV, las células productoras se lisan en tampón que contiene detergente, que posteriormente se clarifica mediante centrifugación y filtración a baja velocidad. Las partículas AAV se purifican a partir del lisado celular mediante cromatografía de columna AVB Sepharose, que se une a las partículas AAV. Las partículas unidas se lavan con PBS para eliminar los contaminantes y se eluyen de la resina utilizando tampón de citrato de sodio a pH 3.0. El eluido ácido se neutraliza con tampón alcalino Tris-HCl (pH 8.0), se diluye con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se concentra aún más con filtración de flujo tangencial (TFF). El protocolo describe la producción de vectores preclínicos a pequeña escala compatible con la ampliación a la fabricación de AAV de grado clínico a gran escala para aplicaciones de terapia génica humana.

Introducción

Los virus adenoasociados (AAV) son parvovirus humanos no envueltos que contienen un ADN monocatenario de 4,6 kb. Los vectores AAV tienen varias ventajas sobre otros vectores virales para aplicaciones de terapia^{génica 1,2,3,4}. Los AAV son naturalmente incompetentes para la replicación, por lo tanto, requieren un virus ayudante y una maquinaria huésped para la replicación. Los AAV no causan ninguna enfermedad y tienen baja inmunogenicidad en el huésped infectado^3,5. El AAV puede infect....

Protocolo

Consulte la Figura 1 para ver una ilustración que resume el protocolo.

1. Generación de células TIPS infectadas por baculovirus

1. Descongele un vial de células Sf9 e inmediatamente sembrarlas en 50 ml de medio de cultivo de células de insectos. Cultive células Sf9 en una incubadora agitadora orbital a 125 rpm y 28 °C en matraces de fondo redondo con una tapa suelta para el intercambio de aire^8,9. Propague las células en un matraz de 1 L que contenga 200 ml de medio para obtener suficientes células para la producción de células TIPS.
2. Añ....

Resultados

Aquí, se muestran los resultados representativos del desarrollo de procesos para la producción y purificación de vectores AAV utilizando el sistema de células de insectos Sf9. El método incluye el cocultivo de células Sf9 con células TIPS infectadas por baculovirus, la alimentación de las células con medio de crecimiento, la recolección y lisis de las células productoras para liberar las partículas AAV, la clarificación del lisado celular con tratamiento con nucleasa, centrifugación y filtración, purificación de AAV medi.......

Discusión

Los parámetros utilizados en este protocolo para el desarrollo del proceso de producción, purificación y concentración de vectores AAV se pueden aplicar tanto a la fabricación a pequeña como a gran escala de vectores AAV para aplicaciones de terapia génica. Todo el proceso ascendente y descendente se puede realizar en un sistema cerrado compatible con las Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP) actuales. Las principales ventajas del sistema Sf9-baculovirus son la escalabilidad para la producción de AAV de grado GMP a gran.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 N Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	1.09137	Para la limpieza Akta Avant
Matraces de 2 L	ThermoFisher Scientific	431281	Matraz para cultivo en suspensión
50 ml Tubo cónico	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	Para la recogida de sobrenadantes Placa de
24 pocillos	ThermoFisher Scientific	07-200-80	Placa de cultivo celular adherente
250 mL	ThermoFisher Scientific	238071	Matraz para cultivo en suspensión
Akta Avant 150 con Unicorn Software	Cytiva		28976337 Sistema de cromatografía
AVB Sepharose de alto rendimiento	Cytiva	28411210	cromatografía
Baculovirus-AAV-2 GFP	Vector
de transferencia AAV interno fuera de catálogoBaculovirus-AAV-2 rep-cap	Vector de empaquetado de AAV	interno	fuera de catálogo
Nucleasa	Sigma-Aldrich	E1014	Enzima para degradar ADN y ARN
Tampón bloqueante	Cruz Biotechnologies		516214 Bloqueo para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos a las células
Tampón de lisis celular	interno	fuera de catálogo	20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L y 10 L	Cytiva	28937662	Bolsa de biorreactor
Tampón	de limpieza Interno	Artículo no catalogado	100 mM de ácido cítrico (pH 2,1)
Cryovial	Thomas Scientific	1222C24	Para criopreservación
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Medios de crecimiento para líneas celulares
Tampón de elución		Interno Artículo no catalogado	Tampón de citrato de sodio de 50 mM (pH 3.0)
Etanol	Sigma-Aldrich	E7073	Para la desinfección y el almacenamiento de la cromatografía
Unidad de filtración	Pall Corporation	12941	Filtro de membrana
HT1080 línea celular	ATCC	CCL-121	Línea celular de fibroblastos
HyClone™ SFX-Medios de cultivo de insectos	Cytiva	SH30278.02	Medio de crecimiento de células de insectos sin suero
Bomba peristáltica	Pall Corporation	Artículo fuera de catálogo	Bomba TFF
MaxQ 8000 incubadora agitadora orbital	ThermoFisher Scientific	Artículo fuera de catálogo	Agitador para cultivo en suspensión
Microscopio	Nikon	Artículo fuera de catálogo	Monitoreo y conteo de células
Anticuerpo anti-baculovirus gp64 PE en ratón	Santa Cruz Biotechnologies	65498 PE	Monitorización de la infección por baculovirus en células Sf9
Tanque de oxígeno	Praxair	Artículo fuera de catálogo	40 % El suministro de oxígeno es necesario para el crecimiento de las células Sf9
PBS	ThermoFisher Scientific	20012027	Tampón de lavado
Plata Kit de tinción	ThermoFisher Scientific	LC6100	AAV de tinción proteínas de la cápside
células Sf9	ThermoFisher Scientific	11496-015 Células de	insectos
Agua Steile Interno		Artículo no catalogado	Para la limpieza Akta Avant
Centrífuga de mesa	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Para aclarar el sobrenadante de Baculovirus
Cartucho de filtración de flujo tangencial (TFF)	Pall Corporation OA100C12		Cartucho TFF para concentrar el AAV
Tris-HCl, pH 8.0	ThermoFisher	15568025	Tampón alcalino para neutralizar el AAV
WAVE eluido Sistema de Biorreactor 20/50	Cytiva	28-9378-00	Biorreactor