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Artículo de método

Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto

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DOI:

10.3791/62829

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13 de enero de 2022

 ,  ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

En este artículo

Resumen

En este protocolo, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de insectos Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-proteína fluorescente verde (GFP) o gen terapéutico y células Sf9 infectadas con BV-AAV2-rep-cap en cultivo en suspensión. Las partículas de AAV se liberan de las células utilizando detergente, se clarifican, se purifican mediante cromatografía de columna de afinidad y se concentran mediante filtración de flujo tangencial.

Resumen

Los virus adenoasociados (AAV) son vectores prometedores para aplicaciones de terapia génica. Aquí, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de Spodoptera frugiperda (Sf9) con células Sf9 infectadas con baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gen terapéutico) y BV-AAV2-rep-cap en cultivo de suspensión sin suero. Las células se cultivan en un matraz en un agitador orbital o biorreactor de onda. Para liberar las partículas AAV, las células productoras se lisan en tampón que contiene detergente, que posteriormente se clarifica mediante centrifugación y filtración a baja velocidad. Las partículas AAV se purifican a partir del lisado celular mediante cromatografía de columna AVB Sepharose, que se une a las partículas AAV. Las partículas unidas se lavan con PBS para eliminar los contaminantes y se eluyen de la resina utilizando tampón de citrato de sodio a pH 3.0. El eluido ácido se neutraliza con tampón alcalino Tris-HCl (pH 8.0), se diluye con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se concentra aún más con filtración de flujo tangencial (TFF). El protocolo describe la producción de vectores preclínicos a pequeña escala compatible con la ampliación a la fabricación de AAV de grado clínico a gran escala para aplicaciones de terapia génica humana.

Introducción

Los virus adenoasociados (AAV) son parvovirus humanos no envueltos que contienen un ADN monocatenario de 4,6 kb. Los vectores AAV tienen varias ventajas sobre otros vectores virales para aplicaciones de terapiagénica 1,2,3,4. Los AAV son naturalmente incompetentes para la replicación, por lo tanto, requieren un virus ayudante y una maquinaria huésped para la replicación. Los AAV no causan ninguna enfermedad y tienen baja inmunogenicidad en el huésped infectado3,5. El AAV puede infectar tanto a las células inactivas como a las que se dividen activamente y puede persistir como episoma sin integrarse en el genoma de las células huésped (los AAV rara vez se integran en el genoma del huésped)1,3. Estas características han hecho de AAV una herramienta deseable para aplicaciones de terapia génica.

Para generar un vector de transferencia de genes AAV, el casete transgénico, incluido el gen terapéutico, se clona entre dos repeticiones terminales internas (ITR), que generalmente se derivan del serotipo AAV 2. El tamaño máximo de 5' ITR a 3' ITR, incluyendo la secuencia transgénica, es de 4,6 kb6. Diferentes cápsides pueden tener un tropismo celular o tisular diferente. Por lo tanto, las cápsides deben elegirse en función del tipo de tejido o célula que se pretende atacar con el vector AAV7.

Los vectores AAV recombinantes se producen comúnmente en líneas celulares de mamíferos como las células renales embrionarias humanas, HEK293 por transfección transitoria del vector de transferencia del gen AAV, AAV rep-cap y plásmidos de virus auxiliares2,3. Sin embargo, existen varias limitaciones para la producción de AAV a gran escala mediante la transfección transitoria de células HEK293 adherentes. Primero, se necesita una gran cantidad de pilas de celdas o botellas de rodillos. En segundo lugar, se necesitan ADN plásmido de alta calidad y reactivos de transfección, lo que aumenta el costo de fabricación. Finalmente, cuando se utilizan células ADHERENTES HEK293, el suero se necesita con frecuencia para una producción óptima, lo que complica el procesamiento posterior1,2,3. Un método alternativo de fabricación de AAV implica el uso de la línea celular de insectos, células de Spodoptera frugiperda (Sf9) y un virus de insecto llamado autografia californica multicápside recombinante virus de poliedrosis nuclear (AcMNPV o baculovirus)8,9,10. Las células Sf9 se cultivan en un cultivo de suspensión sin suero que es fácil de escalar y es compatible con la producción actual de buenas prácticas de fabricación (cGMP) a gran escala, que no requiere plásmidos ni reactivos de transfección. Además, el costo de la producción de AAV utilizando el sistema Sf9-baculovirus es menor que el costo de usar la transfección transitoria de plásmidos en células HEK29311.

El sistema original de producción de rAAV utilizando células baculovirus-Sf9 utilizó tres baculovirus: un baculovirus que contiene casete de transferencia de genes, el segundo baculovirus que contiene el gen rep y el tercer baculovirus que contiene el gen de la cápside específico del serotipo12,13. Sin embargo, el baculovirus que contenía la construcción de rep era genéticamente inestable en múltiples rondas de pasajes, lo que impedía la amplificación del baculovirus para la producción de AAV a gran escala. Para resolver este problema, se desarrolló un nuevo sistema vectorial rAAV, que contenía dos baculovirus (TwoBac): un baculovirus que contiene el cassette de transferencia del gen AAV y otro baculovirus que contiene los genes AAV rep-cap juntos que son genéticamente más estables que el sistema original y más convenientes para producir rAAV debido al uso de TwoBac en lugar de tres14, 15. El sistema OneBac utiliza el casete de transferencia de genes AAV y los genes rep-cap en un solo baculovirus que es más conveniente para producir el rAAV debido al uso de un baculovirus en lugar de usar TwoBac o ThreeBac2,16,17. En nuestro estudio, se utilizó el sistema TwoBac para la optimización.

El sistema de baculovirus para la producción de AAV también tiene limitaciones: las partículas de baculovirus son inestables para el almacenamiento a largo plazo en medio libre de suero11, y si el título de baculovirus es bajo, se necesita un gran volumen de sobrenadante de baculovirus, que puede volverse tóxico para el crecimiento de las células Sf9 durante la producción de AAV (observación personal). El uso de células de preservación y ampliación de células infectadas sin título (TIPS), o células de insectos infectadas por baculovirus (BIIC), proporciona una buena opción para la producción de AAV en la que las células Sf9 infectadas por baculovirus se preparan, criopreservan y posteriormente se utilizan para la infección de células Sf9 frescas. Otra ventaja es el aumento de la estabilidad del baculovirus (VB) en las células Sf9 después de la criopreservación10,11.

Se generan dos tipos de células TIPS para permitir la producción de AAV: la primera por infección de células Sf9 con el gen BV-AAV2-GFP o terapéutico, y la segunda por infección de células Sf9 con BV-AAV2-rep-cap. Las células TIPS se criopreservan en alícuotas pequeñas y listas para usar. Los vectores AAV se producen en cultivo de suspensión sin suero en un matraz colocado en un agitador orbital o biorreactor de onda mediante el cultivo conjunto de células TIPS que producen baculovirus y células Sf9 frescas. Las células Sf9 están infectadas por baculovirus que transportan el vector AAV2-GFP y las secuencias rep-cap para generar AAV. Cuatro o cinco días después, cuando los rendimientos de AAV son los más altos, las células productoras se lisan con detergente para liberar las partículas de AAV. El lisado celular se clarifica posteriormente mediante centrifugación y filtración a baja velocidad. Las partículas de AAV se purifican a partir del lisado mediante cromatografía en columna AVB Sepharose. Finalmente, los vectores AAV se concentran utilizando TFF. El protocolo describe la producción de AAV a pequeña escala, útil para la investigación y los estudios preclínicos. Sin embargo, los métodos son escalables y compatibles con la fabricación de vectores AAV de grado clínico para aplicaciones de terapia génica.

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Protocolo

Consulte la Figura 1 para ver una ilustración que resume el protocolo.

1. Generación de células TIPS infectadas por baculovirus

  1. Descongele un vial de células Sf9 e inmediatamente sembrarlas en 50 ml de medio de cultivo de células de insectos. Cultive células Sf9 en una incubadora agitadora orbital a 125 rpm y 28 °C en matraces de fondo redondo con una tapa suelta para el intercambio de aire8,9. Propague las células en un matraz de 1 L que contenga 200 ml de medio para obtener suficientes células para la producción de células TIPS.
  2. Añadir 50 mL de células Sf9 a 2 x 106 células/ml en dos matraces: infectar un matraz de células Sf9 con 0,5 mL de baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gen terapéutico) y el otro matraz de células con 0,5 mL de BV-AAV2-rep-cap.
    NOTA: Los plásmidos vectoriales AAV fueron generosamente proporcionados por el Dr. Robert M. Kotin (NIH). La producción de baculovirus a partir de ADN bacmid (Sistema Bac-to-Bac) ha sido descrita previamente8,9. La estabilidad del baculovirus durante el paso es un problema crítico para la ampliación de la producción de rAAV. Es mejor usar un número de paso más bajo de baculovirus (hasta el número de paso 4). Determinar empíricamente el volumen óptimo del sobrenadante de baculovirus comprobando la eficiencia de la infección por baculovirus mediante citometría de flujo (Figura 2) durante la producción de células TIPS.
  3. Monitoree la infección por baculovirus 3-4 días después de la infección tiñendo el baculovirus gp64 en células Sf9 infectadas de la siguiente manera.
    1. Tinción de 2 x 105 células Sf9 (células no infectadas e infectadas por baculovirus) con 0,5 μg de anticuerpo anti-baculovirus gp64 de ratón (1:200) que contiene un colorante fluorescente en 100 μL de tampón de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente.
    2. Lavar las células con 1 ml de PBS para eliminar el anticuerpo y resuspendir las células teñidas en 300 μL de PBS que contengan albúmina sérica bovina al 0,5%.
    3. Analizar la expresión del baculovirus gp64 en células mediante citometría de flujo (Figura 2).
      NOTA: Determinar empíricamente la estrategia de cierre para la adquisición y análisis de citometría de flujo. Se adquiere un total de 10.000 células vivas individuales. La expresión de Baculovirus gp64 en las superficies celulares de Sf9 indica infección por baculovirus. Después de 3-4 días, la mayoría de las células Sf9 se infectan con el baculovirus, como lo demuestra la expresión de baculovirus gp64 (Figura 2).
  4. Cuando las células son 80%-90% viables con un aumento en el diámetro (Figura 3), cosechar las células y criopreservar 1 x 107 células en 1 mL de medio de cultivo de insectos suplementado con 10% de suero fetal bovino y 10% de dimetilsulfóxido en un recipiente de congelación lenta a -80 °C. Al día siguiente, transfiera el tubo que contiene las células TIPS a un congelador de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: Realizar cultivo celular en un gabinete de bioseguridad siguiendo la técnica estándar de laboratorio aséptico en Biosafety Level 2 (BSL-2).

2. Producción de vector AAV

  1. Día 1: Cocultivo de células Sf9 con las células TIPS infectadas por baculovirus
    1. Cultive y cultive células Sf9 naïve a 1 x 106 células/ml a 28 °C en varios matraces de 2 L que contengan 400 ml de medio de cultivo de células de insectos en una incubadora agitadora que se necesita para la producción de AAV. Después de 3-4 días, la densidad celular aumenta hasta 5 x 106-6 x 106 células / ml.
      NOTA: El CO2 y la humedad no son factores importantes para el crecimiento de las células Sf9.
    2. Sembra las células Sf9 ya sea en matraces de agitación o en un biorreactor de la siguiente manera.
      1. Producción de AAV en matraces en una incubadora de agitadores orbitales: Utilice una pipeta o una bomba peristáltica para sembrar 400 mL de cultivo sf9 a 2 x 106 células/ml en un matraz de 2 L asépticamente. Configure el agitador orbital a 125 rpm y 28 °C.
        NOTA Utilice una bomba peristáltica o pipeta estándar dependiendo de la escala de la producción de AAV.
      2. Producción de AAV en un biorreactor: Utilice una bomba peristáltica para sembrar 1 L de cultivo de Sf9 a 2 x 106 células/ml en una bolsa de biorreactor de 10 L de forma aséptica. Cargue la bolsa en la unidad biorreactor para su cultivo a 28 °C. Agregue oxígeno al 40% a la bolsa del biorreactor a 0.1 psi. Configure la unidad de biorreactor en un ángulo de 20° y agite la bolsa a 25 rpm.
    3. Descongele un vial de cada célula TIPS BV-AAV2-GFP (o gen terapéutico) y BV-AAV2-rep-cap. Diluir las células con 20 ml de medio de cultivo de insectos y realizar un recuento de viabilidad de las células utilizando azul de tripano. Inocular ambas células TIPS en una proporción de 1:10.000 en relación con las células Sf9 ingenuas cultivadas en un matraz agitador o biorreactor.
      NOTA: La supervivencia de las células TIPS se reduce debido a la criopreservación, y la tasa de recuperación es de aproximadamente el 50% cuando se determina la viabilidad celular con la tinción azul tripano. Realice un experimento piloto para determinar empíricamente la proporción de células TIPS y células Sf9 ingenuas antes de la producción de rAAV a gran escala.
  2. Día 2: Seguimiento de la cultura
    1. Cosecha 1 mL de cultivo de Sf9 asépticamente. Tinción con el tinte azul Trypan para analizar el recuento celular, la viabilidad y la morfología.
  3. Día 3: Monitoreo de la cultura y alimentación
    1. Cosechar 1 mL de cultivo de Sf9 y analizar el recuento celular, la viabilidad y la morfología. Compruebe el estado de la infección por baculovirus después de teñir las células Sf9 como se menciona en el paso 1.3.
      NOTA: El aumento en el diámetro celular y el efecto citopático son indicaciones de infección por baculovirus. El aumento en el diámetro precede a una disminución en la viabilidad de la célula, y estos parámetros se utilizan para determinar el tiempo de cosecha de células durante la producción de AAV. Determine empíricamente el punto de tiempo óptimo.
    2. Alimente el cultivo Sf9 con medio de cultivo de insectos frescos en una proporción de 1: 5 asépticamente.
  4. Día 4: Seguimiento de la cultura
    1. Cosechar 1 mL de cultivo de Sf9 y analizar el recuento celular, la viabilidad y la morfología. Desconecte el suministro de oxígeno de la bolsa del biorreactor.
  5. Día 5: Seguimiento de la cultura y cosecha
    1. Cosechar 1 mL de cultivo de Sf9 y analizar el recuento celular, la viabilidad y la morfología. Cosechar el medio de cultivo y las células cuando la viabilidad de las células Sf9 haya disminuido a alrededor del 50%(Figura 4).
    2. Girar la suspensión celular a 2100 x g durante 15 min a 4 °C. Recoge el sobrenadante y el pellet celular y guárdalos a -80 °C.

3. Lisis de las células y liberación de AAV

  1. Descongelar el pellet de célula productora AAV. Añadir 100 mL de tampón de lisis celular (20 mM Tris-HCl pH 8.0, cloruro de sodio 150 mM, 0.5 % Triton-X-100) al pellet celular, mezclar vigorosamente e incubar durante 30 min a temperatura ambiente para liberar las partículas AAV.
  2. Centrifugar a 2100 × g durante 30 min a 4 °C y transferir el lisado celular a un nuevo recipiente. Mezcle el lisado celular y el sobrenadante de cultivo celular después de la descongelación.
  3. Añadir 20 U/mL de nucleasa y 10 mM de MgCl2 al lisado celular para digerir el ADN y el ARN. Incubar durante 2-4 h a 37 °C.
  4. Filtre el lisado a través de un sistema de filtración dual de 0,8 μm y 0,2 μmpolyethersulfone utilizando una bomba.
  5. Guarde el lisado celular clarificado a 4 °C durante la noche o purifique el AAV inmediatamente.

4. Purificación del vector AAV mediante sistema de cromatografía de columna de afinidad

  1. Prepare el instrumento de cromatografía lavando secuencialmente la muestra y las líneas tampón con agua estéril, hidróxido de sodio 1 N, agua y solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4) a una velocidad de flujo de 50 ml / min.
  2. Monte la columna AVB Sepharose (10.0 mL) en el sistema de cromatografía y ejecute 100 mL de PBS a un caudal de 5 mL / min.
    NOTA: Utilice un volumen menor o mayor de columna avB Sepharose dependiendo de la escala de producción de AAV y configure el caudal según lo sugerido por el fabricante de la columna o resina (consulte la Tabla de materiales).
  3. Para recoger las fracciones de la solución de paso de columna, el tampón de lavado y el tampón de elución que contienen partículas AAV, inserte tubos en las ranuras del colector de fracciones del instrumento de cromatografía.
  4. Equilibre la columna con PBS a un caudal de 5,0 mL/min.
  5. Cargue el lisado de celda filtrada que contiene partículas AAV en la columna utilizando la máquina de cromatografía equipada con una bomba de muestras. Ejecute la muestra a un caudal de 3,0 ml por minuto.
  6. Ejecute PBS a través de la columna avB Sepharose a una velocidad de flujo de 3.0 mL / min hasta que la curva de absorbancia ultravioleta (UV) (280 nm) regrese a la línea de base y se vuelva estable.
  7. Eluya las partículas AAV de la columna con un tampón de citrato de sodio (pH 3.0) de 50 mM a un caudal de 3.0 mL/min (Figura 5).
    NOTA: Mientras que las partículas AAV se disocian de la resina y pasan a través del detector UV, se puede ver un pico de elución de proteína en el cromatograma.
  8. Diluya inmediatamente el sobrenadante AAV con un quinto de volumen de 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) para aumentar el pH del AAV que contiene sobrenadante a aproximadamente pH 5.5 para evitar la degradación mediada por pH con tampón de elución ácida. Además, diluya el sobrenadante AAV 10 veces con PBS para neutralizar completamente el pH.
    NOTA: El valor de pH es de aproximadamente 5,5 después de neutralizar la solución rAAV. Después de neutralizar el AAV, diluya la solución de rAAV 10 veces con PBS (pH 7.4) para que el AAV esté en un tampón fisiológico.
  9. Almacene 1 ml de cada columna de muestras de recorrido, tampón de lavado y 100 μL del sobrenadante AAV eluido para evaluar la presencia de AAV por infección de las células diana.
  10. Limpie la columna de sefalrosa AVB con 100 ml de ácido cítrico 100 mM (pH 2.1) y 100 ml de PBS (pH7.4) a un caudal de 5.0 ml / min. Enjuague la columna con etanol al 20% a un caudal de 5,0 ml/min y guárdelo a 4 °C.
  11. Limpie las tuberías del instrumento de cromatografía con la posición de la columna fuera de línea como se describe en la sección 4.1. Finalmente, enjuague el sistema de cromatografía con 200 ml de etanol al 20% a una velocidad de flujo de 50,0 ml / min y almacene en etanol al 20%.

5. Concentración y diafiltración del vector AAV mediante filtración de flujo tangencial (TFF)

  1. Configure el sistema TFF equipado con un cartucho de membrana de polisulfona (100 kDa Molecular Weight Cut Off) para concentrar el AAV.
  2. Equilibrar el módulo TFF con 200 mL de PBS durante 10 min.
  3. Cargue la muestra AAV controlando el flujo de la bomba hasta que la muestra se reduzca al volumen deseado mientras mantiene una presión transmembrana a 2-3 psi.
  4. Diafiltrar el retentato con 100 ml de PBS, como se utiliza en este estudio, o definir empíricamente un tampón alternativo que apoye la estabilidad a largo plazo de AAV.
  5. Después de concentrar la muestra de AAV al volumen deseado, recoja la muestra de AAV, filtre a través de un polietersulfonefonercer de 0,2 μm, alícuota y luego guárdela a -80 °C.

6. Infección de muestras de AAV en las células diana para evaluar la presencia de AAV en las etapas de purificación

  1. Inocular 7 x 104 células HT1080/pozo en una placa de 24 pocillos en 500 μL de Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio y 10% de suero fetal bovino (FBS) el día antes de la infección. Cultive las células en una incubadora a 37 °C y 5% CO2.
  2. Cuente las células antes de la infección. Agregue la muestra a granel de AAV diluida no purificada antes de la ejecución de la columna, las muestras de ejecución de la columna, el tampón de lavado y la muestra de AAV purificada eluida.
    NOTA: Cuente las células teñidas de azul de Tripano con un hemocitómetro. Determinar empíricamente el factor de dilución y el volumen (μL) de las muestras de AAV. Cuanto más altos sean los títulos de AAV, más dilución se necesita. Asegúrese de que las partículas de baculovirus de la muestra a granel no purificada antes de que la columna funcione, las muestras de ejecución de columna, el tampón de lavado se inactiven por calor a 50 ° C durante 50 minutos antes de infectar las células objetivo para determinar los títulos infecciosos de AAV.
  3. Dos días después de la infección, analice la expresión de proteínas (por ejemplo, GFP o gen terapéutico) en las células utilizando un citómetro de flujo.
  4. Calcule los títulos infecciosos de AAV utilizando el número de células en el momento de la infección, el factor de dilución y el porcentaje de células GFP + con la fórmula: (Número total de células x Porcentajes de células GFP + x Factor de dilución) / Volumen de AAV en mililitros.
    NOTA: Por ejemplo, el número de células es 1 x 105, el porcentaje de células GFP+ es del 3,4%, el factor de dilución es 100 y el volumen de AAV añadido es de 2 μL. El título de AAV es de 1,7 x 108 unidades infecciosas (UI)/ml. La cantidad total de partículas AAV purificadas en 25 mL de la fracción eluida es de 4,3 x 109 unidades infecciosas (UI)/ml (Figura 6). El número total de partículas AAV iniciales no purificadas es de 1,09 x10 10 UI/ml, y las partículas AAV purificadas son 4,3 x 109 UI/ml. Por tanto, el porcentaje de recuperación es del 39,4%. El porcentaje de células GFP+ debe estar entre el 1% y el 30%, lo que corresponde a un rango lineal cuando se utiliza para calcular el título infeccioso de AAV. Si se infectan partículas vectoriales AAV más concentradas en las células diana; existe la posibilidad de que múltiples copias de las partículas AAV puedan infectar una sola célula que se mostrará como una sola copia del vector. Por lo tanto, diluya el sobrenadante del vector AAV para obtener una infección vectorial del 1% -30% en las células objetivo. Si el vector AAV no tiene un gen informador, tiñe el transgén o el gen terapéutico expresado por el vector AAV con un anticuerpo que contenga un colorante fluorescente que pueda detectarse y cuantificarse utilizando un citómetro de flujo. No todos los serotipos AAV pueden infectar eficientemente las células HT1080. Por lo tanto, para realizar el ensayo de infectividad para otros serotipos AAV, use diferentes líneas celulares. Titule las partículas AAV2-GFP antes de la purificación y después de la purificación en las células HT1080 y mida la expresión de GFP por citometría de flujo. Calcule la recuperación (%) por la relación entre el número de partículas AAV purificadas y el número de partículas AAV antes de la purificación multiplicado por 100.

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Resultados

Aquí, se muestran los resultados representativos del desarrollo de procesos para la producción y purificación de vectores AAV utilizando el sistema de células de insectos Sf9. El método incluye el cocultivo de células Sf9 con células TIPS infectadas por baculovirus, la alimentación de las células con medio de crecimiento, la recolección y lisis de las células productoras para liberar las partículas AAV, la clarificación del lisado celular con tratamiento con nucleasa, centrifugación y filtración, purificación de AAV medi...

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Discusión

Los parámetros utilizados en este protocolo para el desarrollo del proceso de producción, purificación y concentración de vectores AAV se pueden aplicar tanto a la fabricación a pequeña como a gran escala de vectores AAV para aplicaciones de terapia génica. Todo el proceso ascendente y descendente se puede realizar en un sistema cerrado compatible con las Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP) actuales. Las principales ventajas del sistema Sf9-baculovirus son la escalabilidad para la producción de AAV de grado GMP a gran...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Robert M. Kotin (Instituto Nacional del Corazón, la Sangre y los Pulmones, NIH) por proporcionarnos generosamente los plásmidos AAV y a Danielle Steele y Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) por su asistencia técnica. Este trabajo es apoyado por el fondo Start-Up de Cincinnati Children's Research Foundation a M.N.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 N Hidróxido de sodioSigma-Aldrich1.09137Para la limpieza Akta Avant
Matraces de 2 LThermoFisher Scientific431281Matraz para cultivo en suspensión
50 ml Tubo cónicoThermoFisher Scientific14-959-49APara la recogida de sobrenadantes Placa de
24 pocillosThermoFisher Scientific07-200-80Placa de cultivo celular adherente
250 mLThermoFisher Scientific238071Matraz para cultivo en suspensión
Akta Avant 150 con Unicorn SoftwareCytiva28976337 Sistema de cromatografía
AVB Sepharose de alto rendimientoCytiva28411210cromatografía
Baculovirus-AAV-2 GFPVector
de transferencia AAV interno fuera de catálogoBaculovirus-AAV-2 rep-capVector de empaquetado de AAVinternofuera de catálogo
NucleasaSigma-AldrichE1014Enzima para degradar ADN y ARN
Tampón bloqueanteCruz Biotechnologies516214 Bloqueo para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos a las células
Tampón de lisis celularinternofuera de catálogo20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L y 10 LCytiva28937662Bolsa de biorreactor
Tampónde limpieza InternoArtículo no catalogado100 mM de ácido cítrico (pH 2,1) 
CryovialThomas Scientific1222C24Para criopreservación
DMEMSigma-AldrichD6429Medios de crecimiento para líneas celulares
Tampón de eluciónInterno Artículo no catalogadoTampón de citrato de sodio de 50 mM (pH 3.0)
EtanolSigma-AldrichE7073Para la desinfección y el almacenamiento de la cromatografía
Unidad de filtración Pall Corporation12941Filtro de membrana
HT1080 línea celularATCCCCL-121Línea celular de fibroblastos
HyClone™ SFX-Medios de cultivo de insectosCytivaSH30278.02Medio de crecimiento de células de insectos sin suero
Bomba peristálticaPall CorporationArtículo fuera de catálogoBomba TFF
MaxQ 8000 incubadora agitadora orbital ThermoFisher ScientificArtículo fuera de catálogoAgitador para cultivo en suspensión
MicroscopioNikonArtículo fuera de catálogoMonitoreo y conteo de células 
Anticuerpo anti-baculovirus gp64 PE en ratónSanta Cruz Biotechnologies65498 PEMonitorización de la infección por baculovirus en células Sf9
Tanque de oxígenoPraxairArtículo fuera de catálogo40 % El suministro de oxígeno es necesario para el crecimiento de las células Sf9
PBSThermoFisher Scientific20012027Tampón de lavado
Plata Kit de tinciónThermoFisher ScientificLC6100AAV de tinción proteínas de la cápside
células Sf9ThermoFisher Scientific11496-015 Células deinsectos
Agua Steile InternoArtículo no catalogadoPara la limpieza Akta Avant
Centrífuga de mesaThermoFisher Scientific75253839/433607Para aclarar el sobrenadante de Baculovirus
Cartucho de filtración de flujo tangencial (TFF)Pall Corporation OA100C12Cartucho TFF para concentrar el AAV
Tris-HCl, pH 8.0ThermoFisher15568025Tampón alcalino para neutralizar el AAV
WAVE eluido Sistema de Biorreactor 20/50Cytiva28-9378-00Biorreactor
Matraces de medio de Santa Artículo

Referencias

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