Método sándwich de membrana de dos capas para la recolección de saliva de Laodelphax striatellus

Resumen

El presente protocolo describe un método para recolectar suficiente saliva de insectos perforantes-chupadores utilizando un medio artificial. Este es un método conveniente para recolectar saliva de insectos y estudiar la función salival en el comportamiento de alimentación de insectos y la transmisión de virus transmitidos por vectores.

Resumen

El virus de la franja de arroz (VRS), que causa una pérdida económica significativa de la agricultura en Asia oriental, depende completamente de los insectos vectores para su transmisión efectiva entre el arroz huésped. Laodelphax striatellus (pequeño saltamontes marrón, SBPH) es el principal vector de insectos que transmite horizontalmente el VSR mientras chupa la savia del floema. La saliva juega un papel importante en el comportamiento de alimentación de los insectos. Aquí se describe un método conveniente que será útil para la investigación de la saliva de los insectos con un comportamiento de alimentación penetrante-chupador. En este método, se permitió que los insectos se alimentaran de una dieta artificial intercalada entre dos capas de película de parafina estiradas. La dieta que contenía la saliva se recolectaba cada día, se filtraba y se concentraba para su posterior análisis. Finalmente, la calidad de la saliva recolectada se examinó mediante tinción de proteínas e inmunoblotting. Este método se ejemplificó mediante la detección de la presencia de VRS y una proteína similar a la mucina en la saliva de SBPH. Estos métodos artificiales de alimentación y recolección de saliva sentarán las bases para una mayor investigación sobre los factores en la saliva de los insectos relacionados con el comportamiento de alimentación y la transmisión del virus.

Introducción

El virus de la raya de arroz (VRS), un virus de ARN de cadena negativa en el género Tenuivirus,causa enfermedades graves en la producción de arroz en Asia oriental^1,2,3. La transmisión del VSR de las plantas de arroz infectadas a las sanas depende de los insectos vectores, principalmente Laodelphax striatellus, que transmite el VSR de manera persistente-propagativa. SBPH adquiere el virus después de alimentarse de plantas infectadas por el VSR. Una vez dentro del insecto, el VSR infecta la célula epitelial del intestino medio un día después de la alimentació....

Protocolo

1. Mantenimiento SBPH

1. Coloque a los individuos DE SBPH virulíferos y libres de VRS en una incubadora de vidrio (65 x 200 mm) con 5-6 plántulas de arroz(Oryza sativa cv. Nipponbare) por cámara de vidrio en el laboratorio. Cultive las plantas de arroz a 25 °C bajo un fotoperíodo de luz de 16 h / 8 h de oscuridad.
   NOTA: Los individuos de SBPH virulíferos y libres de RSV fueron capturados inicialmente en la provincia de Jiangsu, China.
2. Detectar el VSR en sbph mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas de puntos (dot-ELISA) con un anticuerpo policlonal específico del VSR de conejo (ver Tabla de materiales)criado ....

Resultados

Esquemas de instalación de alimentación artificial y recolección de saliva
La Figura 1A representa el cilindro de vidrio (15 cm x 2,5 cm) utilizado como cámara de alimentación para recoger la saliva. En primer lugar, las larvas de SBPH se murieron de hambre durante varias horas para mejorar la eficiencia de la recolección y luego se inmovilizaron enfriando durante 5 minutos. Después de que los insectos fueron transferidos al cilindro de vidrio, ambos extremos abiertos de .......

Discusión

La cría exitosa de insectos en dietas artificiales se informó por primera vez en 1962 cuando Mittler y Dadd describieron la técnica de membrana de parafina para mantener una dieta artificial^29,30. Y este método se ha explorado en muchos aspectos de la biología y el comportamiento de los insectos, por ejemplo, suplementos nutricionales, alimentación con dsRNA y adquisición de virus. Según los requisitos del análisis de saliva, la sacarosa al 5% se utiliza como la .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro centrífugo 10-KD	Merck Millipore	R5PA83496	Para concentración
10x Tampón de transferencia de proteínas (húmedo)	macGENE	MP008	Tampón de transferencia para Western blot
10x Tampón TBST	Coolaber	SL1328-500mL× 10	Tampón de lavado para Western blot
Azure c600 Biosystems	Azure Biosystems	Azure c600	Sistema de imagen para Western blot y tinción de plata
Color Escalera de proteínas preteñida	GenStar	M221-01 Marcador de	proteínas para western blot
ECL  reactivos de detección de Western blot	GE Healthcare	RPN2209	Western blot detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit	TIANGEN		Reacción cromogénica
Anticuerpos anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante	Sigma	401393-2ML	Anticuerpo secundario policlonal para Western blot
Immobilon(R)-P Membrana de difluoruro de polivinilideno	Merck Millipore	IPVH00010	Membrana de transferencia para Western blot
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725125	Para PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES	Bio-Rad	1708891	Para PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
Filtro Millex-GP, 0,22 y micro; m	Merck Millipore	SLGP033RB	para filtración
Mini-PROTEAB TGX Geles	Bio-Rad	4561043	para SDS-PAGE
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONEC-W	Detección de la concentración de proteínas
Membrana de nylon	PALL	T42754	Membrana para dot-ELISA
Parafilm M Membrana	Sigma	P7793-1EA Elaboración de	dietas artificiales sándwiches
Anticuerpo policlonal anti-LssgMP de conejo contra péptidos LssgMP	Genstript		Anticuerpo policlonal primario anti-LssgMP de conejo para western blot
Anticuerpo policlonal anti-VRS de conejo	Genstript		Anticuerpo policlonal primario anti-RSV de conejo para western blot y dot-ELISA
RNAprep puro Micro Kit	TIANGEN	DP420	para extracción de ARN

#PA110