Artículo de método

Método sándwich de membrana de dos capas para la recolección de saliva de Laodelphax striatellus

DOI:

10.3791/62831

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27 de agosto de 2021

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

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El presente protocolo describe un método para recolectar suficiente saliva de insectos perforantes-chupadores utilizando un medio artificial. Este es un método conveniente para recolectar saliva de insectos y estudiar la función salival en el comportamiento de alimentación de insectos y la transmisión de virus transmitidos por vectores.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El virus de la franja de arroz (VRS), que causa una pérdida económica significativa de la agricultura en Asia oriental, depende completamente de los insectos vectores para su transmisión efectiva entre el arroz huésped. Laodelphax striatellus (pequeño saltamontes marrón, SBPH) es el principal vector de insectos que transmite horizontalmente el VSR mientras chupa la savia del floema. La saliva juega un papel importante en el comportamiento de alimentación de los insectos. Aquí se describe un método conveniente que será útil para la investigación de la saliva de los insectos con un comportamiento de alimentación penetrante-chupador. En este método, se permitió que los insectos se alimentaran de una dieta artificial intercalada entre dos capas de película de parafina estiradas. La dieta que contenía la saliva se recolectaba cada día, se filtraba y se concentraba para su posterior análisis. Finalmente, la calidad de la saliva recolectada se examinó mediante tinción de proteínas e inmunoblotting. Este método se ejemplificó mediante la detección de la presencia de VRS y una proteína similar a la mucina en la saliva de SBPH. Estos métodos artificiales de alimentación y recolección de saliva sentarán las bases para una mayor investigación sobre los factores en la saliva de los insectos relacionados con el comportamiento de alimentación y la transmisión del virus.

Introducción

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El virus de la raya de arroz (VRS), un virus de ARN de cadena negativa en el género Tenuivirus,causa enfermedades graves en la producción de arroz en Asia oriental1,2,3. La transmisión del VSR de las plantas de arroz infectadas a las sanas depende de los insectos vectores, principalmente Laodelphax striatellus, que transmite el VSR de manera persistente-propagativa. SBPH adquiere el virus después de alimentarse de plantas infectadas por el VSR. Una vez dentro del insecto, el VSR infecta la célula epitelial del intestino medio un día después de la alimentación y luego pasa a través de la barrera del intestino medio para penetrar la hemolinfa. Posteriormente, el VSR se propaga a diferentes tejidos a través de la hemolinfa y luego se propaga. Después de un período latente de aproximadamente 10-14 días después de la adquisición, el virus dentro de la glándula salival puede transmitirse a las plantas huésped sanas a través de la saliva secretada, mientras que SBPHchupa la savia del floema4,5,6,7,8,9,10 . Un proceso de alimentación eficiente y varios factores en la saliva son esenciales para la propagación del VRS del insecto a la planta huésped.

Se cree que la saliva de insecto secretada por las glándulas salivales media insectos, virus y plantas huésped. Los insectos hemípteros suelen producir dos tipos de saliva: saliva gelificante y saliva acuosa11,12,13. La saliva gelificante se secreta principalmente en el apoplasma para mantener el movimiento del estilete entre las células huésped y también se relaciona con la superación de la resistencia de las plantas y las respuestas inmunes14,15,16,17. En la etapa de sondeo de la alimentación, los insectos secretan intermitentemente saliva gelificante que inmediatamente se oxida para formar una brida superficial. Luego, las vainas simples o ramificadas encierran el estilete para reservar un canal tubular18,19,20. Se presume que la brida superficial en la epidermis facilita la penetración del estilete al servir como punto de anclaje, mientras que las vainas alrededor del estilete pueden proporcionar estabilidad mecánica y lubricación16,21,22,23. Nlshp fue identificado como una proteína esencial para la formación de vaina salival y la alimentación exitosa desaltamontes marrones (Nilaparvata lugens,BPH). La inhibición de la expresión de la proteína de la vaina estructural (SHP) secretada por el pulgón Acyrthosiphon pisum redujo su reproducción al interrumpir la alimentación de los tubos del tamiz del huésped24. Además, en algunas especies de insectos, se supone que los factores de saliva en gel desencadenan las respuestas inmunes de las plantas al formar los llamados patrones moleculares asociados a herbívoros (HAMP). En N. lugens,NlMLP, una proteína similar a la mucina relacionada con la formación de vaina, induce las defensas de las plantas contra la alimentación, incluida la muerte celular, la expresión de genes relacionados con la defensa y la deposición de callosa 25,26. Además, se ha demostrado que algunos factores de saliva en gel en los áfidos desencadenan respuestas de defensa de las plantas a través de interacciones de gen a gen similares a los patrones moleculares asociados a patógenos12,15,27.

Para estudiar los factores de saliva esenciales para la alimentación de insectos y / o la transmisión de patógenos, es necesario analizar la saliva secretada. Aquí, se describen métodos artificiales de alimentación y recolección para obtener cantidades suficientes de saliva para un análisis más detallado. Utilizando un medio que contenía un solo elemento nutricional, se recolectaron y analizaron muchas proteínas de saliva mediante tinción de plata y western blotting. Este método será útil en futuras investigaciones sobre los factores en la saliva que son esenciales para la transmisión del VSR por SBPH.

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Protocolo

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1. Mantenimiento SBPH

  1. Coloque a los individuos DE SBPH virulíferos y libres de VRS en una incubadora de vidrio (65 x 200 mm) con 5-6 plántulas de arroz(Oryza sativa cv. Nipponbare) por cámara de vidrio en el laboratorio. Cultive las plantas de arroz a 25 °C bajo un fotoperíodo de luz de 16 h / 8 h de oscuridad.
    NOTA: Los individuos de SBPH virulíferos y libres de RSV fueron capturados inicialmente en la provincia de Jiangsu, China.
  2. Detectar el VSR en sbph mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas de puntos (dot-ELISA) con un anticuerpo policlonal específico del VSR de conejo (ver Tabla de materiales)criado contra las ribonucleoproteínas (RNP) del VSR.
    NOTA: Para garantizar una alta eficiencia de la infección de la descendencia, las hembras virulíferas se mantuvieron por separado, y el 15% de sus crías se sometieron a pruebas aleatorias para detectar la infección por VRS. Los detalles de dot-ELISA se describen en los pasos 1.3-1.7.
  3. Homogeneizar SBPH simple en 20 μL de tampón de recubrimiento (0.05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9.5). Coloque 3 μL de cada uno en la membrana de nylon (consulte la Tabla de materiales),y luego seque la membrana a temperatura ambiente (RT).
  4. Incubar la membrana con 15 mL de tampón de bloqueo (PBS + 3% de leche descremada) durante 30 min a temperatura ambiente.
  5. Incubar la membrana con anticuerpos primarios diluidos de conejo contra el VSR (1:10000) en 15 ml de PBS durante 1 h a RT y lavar la membrana tres veces con PBS durante 5 minutos de incubación cada vez.
  6. Incubar la membrana con 1,5 μL de anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante (ver Tabla de Materiales)en 15 ml de PBS y lavar tres veces con PBS durante 5 min de incubación cada vez.
  7. Desarrollar los inmunoblots con Enhanced HRP-DAB Chromogenic Kit (ver Tabla de Materiales)según los protocolos proporcionados por el fabricante.

2. Preparación de la cámara de alimentación y dieta artificial

  1. Pesar 2 g de sacarosa en polvo y disolverlo en 40 mL de ddH2O para preparar una solución acuosa de sacarosa al 5% como dieta artificial.
  2. Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm (ver Tabla de Materiales)para eliminar la contaminación bacteriana y las impurezas.
  3. Matar de hambre 2003ª-5ª larvas de SBPH durante 3-5 h antes de introducirlas en la cámara.
    NOTA: Se preparan 200 SBPH para una cámara; se debe preparar más SBPH para varias cámaras.
  4. Preparar los cilindros de vidrio como cámaras de alimentación (Figura 1A). Cubra un extremo abierto de la cámara con una membrana de parafina (ver Tabla de Materiales)antes de introducir los insectos experimentales.
    NOTA: Cada cilindro tiene 15,0 cm de largo y 2,5 cm de diámetro. Estos cilindros de vidrio están hechos a medida de acuerdo con el requisito experimental.
  5. Transfiera insectos a un cilindro de vidrio.
  6. Cubra el otro extremo de la cámara con una membrana de parafina estirada (específicamente, Parafilm M). Luego, agregue 200 μL de dieta artificial. Finalmente, cubra el líquido con otra capa de membrana de parafina estirada.
    NOTA: La membrana de parafina se estira hasta aproximadamente el doble de su área original.
  7. Cubra la cámara con papel de aluminio, pero deje el extremo con el dispositivo de dieta artificial expuesto a la luz.

3. Recolección de saliva SBPH

  1. Recoja la dieta artificial de SBPH libre de RSV y virulífera por separado al final del período de 24 h.
  2. Enfríe el cilindro a 4 °C para inmovilizar los insectos.
  3. Destape la película exterior y recoja el líquido de dieta artificial usando una pipeta estéril en tubos estériles de 1.5 ml. Mantenga la saliva recogida a -80 °C hasta el análisis.
    NOTA: La saliva recolectada podría almacenarse a -80 °C durante 1 año.
  4. Enjuague la membrana interna con 50 μL de dieta artificial fresca tres veces pipeteando suavemente y recoja la dieta de lavado artificial como se describe en el paso 3.3. Coloque la nueva dieta artificial en la membrana interna y mantenga una membrana de parafina recién estirada en la parte superior.
  5. Repita los pasos 3.2 y 3.3 durante 5 días a 2 semanas.
    NOTA: Cuente la tasa de supervivencia de la alimentación artificial sbPH y asegure un suplemento suficiente de SBPH fresco de acuerdo con la tasa de supervivencia.
  6. Filtre las muestras recogidas a través de una unidad de filtro de 0,22 μm para eliminar microbios y otros contaminantes.

4. Concentración de la saliva recogida

  1. Transfiera las muestras de saliva recogidas en un filtro centrífugo de 0,5 ml y 10 kD (véase la Tabla de materiales)y gire a 5.500 x g a 4 °C durante 20 min. Recoge el sobrenadante y haz el volumen final a 100 μL.
  2. Mida la concentración de la saliva recolectada utilizando un espectrofotómetro UV-Vis apropiado siguiendo los pasos 4.3-4.6.
  3. Encienda el espectrofotómetro y lave los pedestales tres veces con ddH2O.
  4. Seleccione las siguientes opciones en la pantalla en el orden adecuado: Proteínas | Proteína A280 | Seleccione Tipo | 1 Abs = 1 mg/ml. A continuación, marque la casilla de verificación Corrección de línea base 340 nm.
  5. Cargue 2 μL de solución acuosa de sacarosa al 5% en blanco, toque Blanco en la parte inferior de la pantalla.
  6. Después de establecer los estándares, cargue 2 μL de la saliva recolectada para la medición. Lea y registre la concentración de proteínas.
    NOTA: Finalmente se recolectaron 1 mg de proteínas de saliva en total al menos.

5. Tinción de plata de proteínas de saliva

  1. Extraiga proteínas de las muestras de saliva de insectos utilizando tampón de carga de muestras (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% de glicerol, 2% de SDS, 0.1% de azul de bromofenol y 1% de β-mercaptoetanol). Luego, fraccionarlo en un 10% SDS-PAGE (ver Tabla de Materiales). Cargue la solución surosa al 5% tratada de la misma manera que un control negativo.
  2. Cargue una alícuota de 20 μL de la muestra en un gel SDS-PAGE junto con un marcador pretensado. Haga funcionar el gel durante 15 minutos a 90 voltios, y luego 50 minutos a 140 voltios.
  3. Fije el gel en etanol al 30% (vol/vol), ácido acético al 10% (vol/vol) durante al menos 30 minutos después de la electroforesis.
  4. Enjuague el gel dos veces con etanol al 20% (vol/vol) y agua por separado durante 10 min cada vez.
  5. Sensibilizar el gel en tiosulfato de sodio de 0,8 mM durante 1 min, y luego enjuagar dos veces en agua durante 1 min cada vez.
  6. Sumerja el gel en nitrato de plata de 12 mM durante al menos 1 h, y luego sumérjalo en agua desionizada durante 10 s antes de transferirlo a la solución reveladora.
  7. Cuando el fondo del gel se esté oscureciendo, sumerja el gel en una solución de parada (ácido acético al 5%) durante al menos 30 minutos para detener la reacción.
  8. Lave el gel dos veces con agua durante 30 minutos cada vez. Desarrollar la imagen con el Sistema de Detección (ver Tabla de Materiales).

6. Detección de proteínas por western blotting

  1. Detectar la proteína similar a la mucina en saliva de SBPH (LssgMP) y RSV por western blots utilizando anticuerpos específicos, respectivamente.
  2. Trate las muestras de saliva de insectos siguiendo el paso 5.1.
  3. Cargue una alícuota de 20 μL de la muestra en un gel SDS-PAGE al 10% junto con un marcador pretensado y una muestra de saliva no infectada por el VSR de 20 μL como control negativo. Haga funcionar el gel durante 15 minutos a 90 voltios, y luego durante 50 minutos a 140 voltios.
  4. Mezcle 100 ml de tampón de transferencia de proteínas 10x (húmedo) (ver Tabla de materiales)con 900 mL de ddH2O a una solución de trabajo (1x), y luego transfiera proteínas a una membrana de difluoruro de polivinilideno utilizando tampón de transferencia de proteínas (1x).
  5. Bloquee la membrana en leche descremada al 5% con solución salina tamponada con Tris de 0,05 m con Tween 20 al 0,05 % (TBST) a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
    NOTA: En este protocolo, mezcle 100 ml de 10x TBST (consulte la Tabla de materiales)con 900 ml de ddH2O en la solución de trabajo.
  6. Incubar la membrana con anticuerpos primarios de conejo contra el VSR o LssgMP (ambos 1:10000) diluidos en TBST a RT durante al menos 2 h.
    NOTA: La producción de anticuerpos primarios contra el VSR se mencionó anteriormente. Una compañía de biotecnología produjo el anticuerpo policlonal anti-LssgMP de conejo contra el péptido LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Lave la membrana tres veces con TBST durante 10 minutos de incubación cada vez.
  8. Incubar la membrana con anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rábano picante diluidos en 1:10000 TBST.
  9. Desarrolle los inmunoblots con el sistema de detección de western blotting de quimioluminiscencia mejorada.

7. Detección del patrón de expresión LssgMP en SBPH

  1. Inmovilizar los insectos a 4 °C durante 5 min.
  2. Lave los insectos con etanol al 75% y ddH2O uno por uno, y luego diseccione los insectos en TBS preenfriados (solución salina tamponada con Tris de 0,01 M).
  3. Diseccionar los insectos del abdomen mientras se cortan las patas delanteras de SBPH en la articulación coxa-trocánter con fórceps; lavar el intestino medio y las glándulas salivales dos veces en TBS para eliminar cualquier contaminación de la hemolinfa.
  4. Coloque cinco tejidos en un tubo libre de RNasa de 1,5 ml para extraer el ARN. Considere cada tubo como una muestra.
  5. Realizar extracción de ARN según los protocolos del fabricante y PCR transcripcional inversa (RT-PCR) (ver Tabla de Materiales).
  6. Realizar PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para investigar los niveles relativos de expresión de transcripción de LssgMP en extractos de todo el cuerpo o diversos tejidos de L. striatellus.
    NOTA: Los pares de cebadores utilizados para la amplificación de genes fueron LssgMP-q-F /LssgMP-q-R, SYBR Green-based qPCR se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. El nivel de transcripción del factor de elongación de traducción de L. striatellus 2 (ef2) se cuantificó con el par de cebadores ef2-q-F/ef2-q-R para la normalización de las plantillas de ADNc. Y las secuencias de cebador se adjuntan a continuación:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

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Resultados

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Esquemas de instalación de alimentación artificial y recolección de saliva
La Figura 1A representa el cilindro de vidrio (15 cm x 2,5 cm) utilizado como cámara de alimentación para recoger la saliva. En primer lugar, las larvas de SBPH se murieron de hambre durante varias horas para mejorar la eficiencia de la recolección y luego se inmovilizaron enfriando durante 5 minutos. Después de que los insectos fueron transferidos al cilindro de vidrio, ambos extremos abiertos de ...

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Discusión

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La cría exitosa de insectos en dietas artificiales se informó por primera vez en 1962 cuando Mittler y Dadd describieron la técnica de membrana de parafina para mantener una dieta artificial29,30. Y este método se ha explorado en muchos aspectos de la biología y el comportamiento de los insectos, por ejemplo, suplementos nutricionales, alimentación con dsRNA y adquisición de virus. Según los requisitos del análisis de saliva, la sacarosa al 5% se utiliza como la ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2019YFC1200503), por la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 32072385) y por la Asociación de Promoción de la Innovación Juvenil CAS (2021084).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro centrífugo 10-KDMerck MilliporeR5PA83496Para concentración
10x Tampón de transferencia de proteínas (húmedo)macGENEMP008Tampón de transferencia para Western blot
10x Tampón TBSTCoolaberSL1328-500mL× 10Tampón de lavado para Western blot
Azure c600 BiosystemsAzure BiosystemsAzure c600Sistema de imagen para Western blot y tinción de plata
Color Escalera de proteínas preteñidaGenStarM221-01 Marcador deproteínas para western blot
ECL  reactivos de detección de Western blotGE HealthcareRPN2209Western blot detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic KitTIANGENReacción cromogénica
Anticuerpos anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picanteSigma401393-2MLAnticuerpo secundario policlonal para Western blot
Immobilon(R)-P Membrana de difluoruro de polivinilidenoMerck MilliporeIPVH00010Membrana de transferencia para Western blot
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725125Para PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHESBio-Rad1708891Para PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
Filtro Millex-GP, 0,22 y micro; mMerck MilliporeSLGP033RBpara filtración
Mini-PROTEAB TGX GelesBio-Rad4561043para SDS-PAGE
NanoDrop OneThermo ScientificND-ONEC-WDetección de la concentración de proteínas
Membrana de nylonPALLT42754Membrana para dot-ELISA
Parafilm M MembranaSigmaP7793-1EA Elaboración dedietas artificiales sándwiches
Anticuerpo policlonal anti-LssgMP de conejo contra péptidos LssgMPGenstriptAnticuerpo policlonal primario anti-LssgMP de conejo para western blot
Anticuerpo policlonal anti-VRS de conejoGenstriptAnticuerpo policlonal primario anti-RSV de conejo para western blot y dot-ELISA
RNAprep puro Micro KitTIANGENDP420para extracción de ARN
#PA110

Referencias

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