Secuenciación de transposon-inserción como herramienta para dilucidar factores de colonización bacteriana en un simbionte de gladiolos de Burkholderia de escarabajos lagria villosa

Resumen

Este es un método adaptado para identificar factores candidatos de colonización de insectos en un simbionte beneficioso de Burkholderia. El huésped escarabajo está infectado con una biblioteca mutante aleatoria generada a través de la mutagénesis del transposón, y la complejidad de la biblioteca después de la colonización se compara con un control cultivado in vitro.

Resumen

Inferir la función de los genes mediante la manipulación de su actividad es una herramienta esencial para comprender los fundamentos genéticos de la mayoría de los procesos biológicos. Los avances en microbiología molecular han visto la aparición de diversas técnicas de mutagénesis para la manipulación de genes. Entre ellos, la secuenciación de transposon-inserción (Tn-seq) es una herramienta valiosa para evaluar simultáneamente la funcionalidad de muchos genes candidatos de una manera no objetivo. La técnica ha sido clave para identificar mecanismos moleculares para la colonización de huéspedes eucariotas en varios microbios patógenos y algunos simbiontes beneficiosos.

Aquí, Tn-seq se establece como un método para identificar factores de colonización en un simbionte mutualista Burkholderia gladioli del escarabajo Lagria villosa. Por conjugación, la inserción mediada por transposón Tn5 de un casete de resistencia a los antibióticos se lleva a cabo en ubicaciones genómicas aleatorias en B. gladioli. Para identificar el efecto de las alteraciones genéticas en la capacidad de las bacterias para colonizar al huésped escarabajo, la biblioteca generada de transposones-mutantes de B. gladioli se inocula en los huevos de escarabajo, mientras que un control se cultiva in vitro en un medio de cultivo líquido. Después de permitir suficiente tiempo para la colonización, el ADN se extrae de las bibliotecas cultivadas in vivo e in vitro. Siguiendo un protocolo de preparación de la biblioteca de ADN, las muestras de ADN se preparan para la secuenciación de transposon-inserción. Se seleccionan fragmentos de ADN que contienen el borde transposon-insert y el ADN bacteriano flanqueante, y los sitios de mutación se determinan mediante secuenciación lejos del borde transposon-insert. Finalmente, al analizar y comparar las frecuencias de cada mutante entre las bibliotecas in vivo e in vitro, se puede predecir la importancia de genes simbiontes específicos durante la colonización del escarabajo.

Introducción

Burkholderia gladioli puede participar en una asociación simbiótica con los escarabajos Lagria villosa, desempeñando un papel importante en la defensa contra los antagonistas microbianos del insecto huésped^4,5,6. Los escarabajos hembra albergan varias cepas de B. gladioli en glándulas especializadas accesorias al sistema reproductivo. Al poner huevos, las hembras untan las células de B. gladiolos en la superficie del huevo donde los compuestos antimicrobianos producidos por B. gladioli inhiben las infecciones por hongos entomopatógenos^4,6. Durante el desarrollo embrionario tardío o temprano después de la eclosión de las larvas, las bacterias colonizan las invaginaciones cuticulares en la superficie dorsal de las larvas. A pesar de esta localización especializada y la ruta de transmisión vertical de los simbiontes, L. villosa presumiblemente también puede adquirir B. gladioli horizontalmente del entorno⁴. Además, se han encontrado al menos tres cepas de B. gladioli en asociación con L. villosa^4,6. Entre estos, B. gladioli Lv-StA es el único que es susceptible de cultivo in vitro.

B. gladiolos Lv-StA tiene un tamaño de genoma de 8,56 Mb⁶ y contiene 7.468 genes. ¿Cuál de estos genes es importante para que la bacteria B. gladioli colonice al huésped escarabajo? Para responder a esta pregunta, utilizamos la secuenciación de transposon-inserción (Tn-seq), un método exploratorio para identificar genes microbianos condicionalmente esenciales^1,2,3. Una biblioteca mutante de B. gladioli Lv-StA fue creada usando un transposón Tn5. A través de la conjugación de células donantes de Escherichia coli a B. gladioli Lv-StA, se transfirió un plásmido pRL27 portador del transposón Tn5 y un casete de resistencia a antibióticos flanqueado por repeticiones invertidas (Figura 1). De este modo, se generó un conjunto de mutantes que individualmente portan interrupciones de 3.736 genes simbiontes(Figura 2).

El grupo mutante se infectó en huevos de escarabajo para identificar los factores de colonización y, como control, también se cultivó in vitro en el medio King's B (KB). Después de permitir suficiente tiempo para la colonización, las larvas eclosionadas se recolectaron y agruparon para la extracción de ADN. Los fragmentos de ADN que contienen el inserto del transposón y la región genómica flanqueante de B. gladioli Lv-StA se seleccionaron utilizando un protocolo de preparación de la biblioteca de ADN modificado para la secuenciación. El procesamiento de calidad de lectura seguido de un análisis con DESeq2 se llevó a cabo para identificar genes específicos cruciales para que B. gladioli Lv-StA colonice las larvas de L. villosa cuando se transmiten a través de la superficie del huevo.

Protocolo

1. Preparación de medios y búferes

1. Prepare los medios KB y LB y las placas de agar como se da en la Tabla 1, y el autoclave a 121 ° C, 15 psi, 20 min.
   1. Añadir 50 μg/ml de kanamicina esterilizada por filtro y ácido 2,6-diaminopimélico (DAP) esterilizado por filtro de 300 μM al medio LB en autoclave antes de cultivar E.coli WM3064 + pRL27.
   2. Agregue kanamicina esterilizada por filtro de 50 μg/ml al agar KB en autoclave para verter las placas necesarias para seleccionar transconjugantes exitosos de B. gladioli Lv-StA.
2. Preparar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) mezclando los siguientes componentes: NaCl 8 g/L, KCl 0.201 g/L, Na₂HPO₄ 1.42 g/L y KH₂PO_{4 0.272} g/L. Disolver las sales en agua destilada y autoclave la mezcla a 121 °C, 15 psi, 20 min antes de su uso. Conservar a temperatura ambiente.
3. Prepare un tampón 2x Bind-and-wash disolviendo los siguientes componentes: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM de ácido tetraacético etilendiamina (EDTA) y 2 M de NaCl en agua destilada. Filtrar-esterilizar la mezcla antes de su uso. Conservar a temperatura ambiente.
4. Prepare 1x Low-TE disolviendo 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) y 0.1 mM EDTA en agua de doble destilación. Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 psi, 20 min. Conservar a temperatura ambiente.

2. Conjugación para generar la biblioteca mutante de transposones

Figura 1: Pasos del protocolo de conjugación. El receptor de conjugación Burkholderia gladioli Lv-StA (rojo) y el donante Escherichia coli que contiene el plásmido pRL27 (rosa) se cultivan en agar KB y LB, respectivamente, complementados con kanamicina y DAP. Después de la transferencia conjugativa del plásmido durante 12-18 h a 30 °C, las células transconjugantes de B. gladioli se seleccionan en KB que contienen kanamicina y se agrupan. Abreviaturas: DAP = ácido 2,6-diaminopimílico; Kan = kanamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Bajo una capucha estéril, inocular un cultivo de donante fresco de Escherichia coli WM3064 + pRL27 en 10 ml de lb medio suplementado con kanamicina y DAP. Inocular células receptoras de Burkholderia gladioli Lv-StA en 5 mL de KB medio. Incubar los cultivos a 30 °C durante la noche en una coctelera a 250 rpm.
2. Después del crecimiento durante la noche, centrífuga 4 ml de cada uno de los cultivos a 9.600 × g durante 6 minutos para peletizar las células. Deseche el sobrenadante.
3. Bajo una capucha estéril, lave los cultivos celulares granulados en medio KB que contenga DAP y finalmente vuelva a colocar los cultivos por separado en 4 mL de medio KB + DAP.
4. En un tubo fresco de 15 ml, mezcle 250 μL de las células donantes de E. coli lavadas con 1 ml de las células receptoras de B. gladioli Lv-StA lavadas.
5. Punto 10 μL de esta mezcla de células de conjugación en placas de agar KB que contienen DAP. Deje que la placa descanse sin ser molestada en la campana estéril a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, incuba las placas con los puntos de conjugación a 30 °C durante 12-18 h.
   NOTA: El período de conjugación se puede ajustar de acuerdo con la especie objetivo. Sin embargo, un largo período de conjugación aumenta el riesgo de inserciones dobles o integración de plásmidos en el genoma. Para las bacterias de crecimiento lento, permita períodos de conjugación más largos.
6. Después de la incubación, agregue 2-4 ml de 1x PBS en las placas debajo de una capucha estéril y use un raspador celular para liberar las manchas de conjugación bacteriana cultivadas del agar. Pipetear la mezcla de células conjugadas en tubos de microfuge de 2 ml.
7. Pellet las células centrifugando a 9.600 × g durante 2 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet dos veces en 1 ml de 1x PBS pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Resuspend el pellet final en 1200 μL de 1x PBS. Hacer diluciones antes del recubrimiento si el número de células en la mezcla es superior a 1 × 10⁴.
8. Mezclar bien y extender 200 μL de la mezcla celular en placas grandes de agar KB (6 o más, si es necesario) suplementadas con kanamicina e incubar a 30 °C durante la noche.
   NOTA: Las colonias mutantes objetivo aparecen dentro de las 30 h en las placas de agar selectivo. Debido al marcador de resistencia a los antibióticos, solo aparecen colonias mutadas en la placa de agar selectivo. Por lo tanto, se espera que todas las colonias sean transconjugantes exitosos.
9. Contar el número total de colonias transconjugantes en tres placas y extrapolar para calcular el número aproximado de mutantes obtenidos en todas las placas. Para aumentar las posibilidades de obtener una biblioteca representativa, asegúrese de que el número total de colonias sea varias veces mayor que el número total de genes en el genoma. Para confirmar el éxito de la conjugación, realice una PCR dirigida al cassette de inserción utilizando 10-20 colonias de muestra, como se describe en la sección 3.
   NOTA: El objetivo es garantizar que el número de colonias sea al menos 10 veces el número de genes en todo el genoma, en este caso, >75.000 mutantes. Sin embargo, generalmente es difícil estimar con precisión el número de colonias que corresponderían a una biblioteca totalmente representativa. El número de genes únicos mutados no es evidente en este momento, dado que las interrupciones en los genes esenciales no se capturan, a menudo hay múltiples sitios de mutación diferentes para el mismo gen, y las mutaciones generadas con transposones Tn5 no son completamente aleatorias.
10. Bajo una capucha estéril, raspe las colonias de las placas agregando 1-2 ml de 1x PBS en el agar. Aguna la mezcla celular raspada de las placas en tubos de 50 ml. Vórtice la biblioteca para mezclarla a fondo y luego divida 4 ml de la biblioteca mutante agrupada en varios criotubos. Añadir 1 ml de glicerol al 70% a los tubos y conservar a -80 °C.

3. PCR y electroforesis en gel para confirmar inserciones exitosas en B. gladioli Lv-StA

1. Para confirmar la presencia de la inserción, elija colonias mutantes individuales de las placas de selección en el paso 2.9 y realice una PCR dirigida al cassette de inserción utilizando los cebadores enumerados en la Tabla 2. Preparar la mezcla maestra de PCR de acuerdo con la Tabla 3 y establecer las condiciones en el termociclador como se describe en la Tabla 4.
2. Ejecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,6% por electroforesis (250 V, 40 min) para verificar si los fragmentos de ADN amplificados son de la longitud esperada de 1580 pb.

4. Infección mutante de la piscina en huevos de escarabajo

1. Pasos de lavado de la biblioteca
   1. Descongela una alícuota de la biblioteca mutante preparada sobre hielo. Centrifugar a 2.683 × g durante 10 min y retirar el sobrenadante. Bajo una capucha estéril, lave las células con 4 ml de 1 pbS para eliminar cualquier medio restante de las células. Resuspend las células en 4 mL de 1x PBS.
   2. Cuente el número de celdas en una alícuota de la biblioteca utilizando una cámara de conteo de celdas. Diluya una parte de la biblioteca a 2 × 10⁶ células/μL en 1x PBS.
   3. Vórtice la alícuota de la biblioteca a fondo para mezclar toda la biblioteca de manera homogénea antes de tomar el volumen requerido.
2. Esterilización de la nidada de huevos e infección in vivo
   1. Seleccione un embrague de huevo L. villosa. Cuente el número de huevos y continúe si la puesta contiene más de 100 huevos.
   2. Esterilizar todo el embrague de huevos.
      1. Añadir 200 μL de etanol al 70% y lavar suavemente los huevos durante 5 min. Retire el etanol y lave los huevos dos veces con agua en autoclave.
      2. Añadir 200 μL de lejía al 12% (NaOCl) y lavar suavemente los huevos durante 30 s. Retire la lejía inmediatamente y lave los huevos nuevamente tres veces con 200 μL de agua en autoclave.
   3. Infectar 2 × 10⁶ células/μL de la biblioteca mutante lavada en la nidada de huevos esterilizados (2,5 μL por huevo).
   4. Dos días después de que eclosionen las larvas de escarabajo infectado, recolecte 100 larvas^{de 2º} instar por tubo de microfuge de 1,5 ml y guárdelo a -80 ° C.
3. Control de biblioteca mutante in vitro
   1. Bajo una capucha estéril, inocular 250 μL de 2 × 10⁶ células/μL de la biblioteca mutante lavada en 10 mL de medio KB que contenga kanamicina.
   2. Incubar el cultivo mutante in vitro a 30 °C durante 20 h.
      NOTA: Calcule la duración de la incubación para que coincida con el número aproximado de generaciones de WT B. gladioli Lv-StA in vivo durante la colonización.
   3. Después de la incubación de 20 h, agregue un volumen igual de glicerol al 70% al cultivo mutante in vitro y guárdelo a -80 ° C.

5. Escarabajos infectados y extracción de ADN de biblioteca mutante in vitro

NOTA: Las extracciones de ADN se realizaron utilizando un kit de purificación de ADN y ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante que se describe brevemente a continuación.

1. Homogeneizar las larvas agrupadas (máximo de 4 mg por tubo de microfuge) añadiendo 1-2 mL de nitrógeno líquido y triturando con un mortero.
2. Descongelar los cultivos mutantes cultivados in vitro a partir de existencias de glicerol en el hielo. Peletizar las células centrifugando a 9.600 × g durante 10 min antes de la lisis celular.
3. Añadir 300 μL de solución de lisis tisular y celular a las muestras in vitro e in vivo. Agregue 5 μL de 10 mg/ml de proteinasa K, incube la mezcla a 60 °C durante 15 min y luego colóquela en hielo durante 3-5 min.
4. Agregue 150 μL de reactivo de precipitación de proteínas a los lisados y vórtice a fondo. Pellet los restos de proteínas centrifugando a 9.600 × g durante 10 min.
5. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuge de 1,5 ml. Añadir 500 μL de isopropanol al sobrenadante e invertir suavemente los tubos al menos 40 veces antes de incubar a -20 °C durante 1 h o durante la noche.
6. Gletear el ADN precipitado centrifugando a 9.600 × g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y agregue etanol helado al 70% al pellet de ADN.
7. Centrifugadora a ≥10.000 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y deje que las muestras se sequen al aire durante al menos 1 h.
8. Resuspend el ADN de las muestras in vitro e in vivo en 100 μL de tampón low-TE.
9. Conservar las muestras a -20 °C.

6. Preparación de la biblioteca de secuenciación

NOTA: El protocolo y los reactivos para la preparación de la biblioteca de ADN se adaptan y modifican a partir de las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit de preparación de la biblioteca de ADN.

Figura 2: Esquema de los pasos de preparación de la biblioteca de ADN. Después del cizallamiento y la ligadura del adaptador, el protocolo modificado incluye un paso de selección de perlas de estreptavidina para enriquecer los fragmentos de ADN que contienen el casete de inserción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Diluya las muestras a una concentración de 20 ng/μL y un volumen de 100 μL y manténgalas en hielo.
2. Corte de ADN de muestra in vivo e in vitro utilizando un ultrasonido. Configure el ultrasonido al 70% de potencia. Vórtice las muestras brevemente y cizalla durante 1 min 30 s.
   NOTA: La configuración del ultrasonido diferirá entre los instrumentos. En este caso, el tamaño del fragmento fue de 200-400 pb, lo cual es apropiado para este enfoque de secuenciación de 150 pb, pareado (ver paso. 9.1). Los parámetros de cizallamiento se pueden ajustar de acuerdo con los requisitos del experimentador.
3. Compruebe si el ADN se cizalló al rango de tamaño deseado (en este caso, 200-400 pb). Cargue 5 μL del ADN no escuchado y esquilado después de mezclarlo con el tinte de carga de gel en una proporción de 1: 1 en un gel de agarosa al 1.6% a 250 V durante 40 min (Figura 3A,B).
4. Preparación de los extremos de los fragmentos necesarios para la ligadura del adaptador
   1. A 50 μL del ADN esquilado, agregue los reactivos de preparación final dados en el kit de preparación de la biblioteca: 3 μL de la mezcla de enzimas y 7 μL de tampón de reacción y mezcle bien mediante pipeteo. Fije un termociclador con una tapa calentada a ≥ 75 °C e incube las muestras durante 30 min a 20 °C y 30 min a 65 °C. Mantener a 4 °C.
5. Ligadura del adaptador
   1. Para la ligadura del adaptador, agregue los siguientes reactivos a los productos de la etapa de preparación final: Mezcla maestra de ligadura de 30 μL, Potenciador de ligadura de 1 μL y Adaptador diluido de 2,5 μL. Mezclar bien mediante pipeteo e incubar la muestra durante 15 min a 20 °C en el termociclador con la tapa calentada apagada.
   2. Después de 15 min, agregue 3 μL de la enzima (uracilo ADN glicosilasa + ADN glicosilasa-liasa Endonucleasa VIII) (ver la Tabla de Materiales). Mezclar bien mediante pipeteo e incubar la muestra durante 15 min a 37 °C en un termociclador con la tapa calentada a ≥47 °C.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en este paso y las muestras se pueden almacenar a -20 °C.
6. Selección de tamaño de ADN ligado al adaptador dirigido a fragmentos de 250 pb
   1. Vórtice la solución de perla magnética (consulte la Tabla de materiales)y colóquela a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.
   2. Agregue 0.3x de cuentas a 96.5 μL de la mezcla de ADN ligado y mezcle pipeteando a fondo. Incubar la mezcla de perlas durante 5 min.
      NOTA: La presencia de sales y polietilenglicol en la mezcla de perlas facilita la precipitación de fragmentos de ADN en las perlas. Una baja proporción de perlas a moléculas de ADN conduce a la unión de solo fragmentos de ADN más grandes a las cuentas. En este caso, los fragmentos de ADN por encima de 250 pb de longitud están unidos a las perlas.
   3. Coloque los tubos en un soporte magnético para tirar de las cuentas y eliminar fragmentos de ADN de tamaño no deseado. Deje que las perlas se asienten durante 5 minutos y luego transfiera el sobrenadante transparente a un nuevo tubo de microfuge (mantenga el sobrenadante).
   4. Agregue 0.15x de cuentas frescas al sobrenadante y mezcle pipeteando bien. Incubar la mezcla de perlas durante 5 minutos y luego colocar los tubos en un soporte magnético para tirar hacia abajo de las perlas unidas al ADN objetivo. Espere 5 minutos y luego deseche el sobrenadante (mantenga las cuentas).
      NOTA: Esta proporción de cuentas a ADN conduce a la unión de fragmentos del tamaño deseado de 250 pb.
   5. Con las perlas en el soporte magnético, agregue 200 μL de etanol al 80% (recién preparado) y espere 30 s. Pipetee y deseche el lavado de etanol con cuidado sin molestar las cuentas en el soporte magnético. Repita este paso.
   6. Después del último lavado, retire los rastros de etanol de las perlas y luego seque al aire las perlas durante 2 minutos hasta que aparezcan brillantes pero no completamente secas. No seque en exceso las cuentas.
   7. Retire los tubos del soporte magnético y agregue 17 μL de 10 mM Tris-HCl o 0.1x TE (Low-TE). Mezclar mediante pipeteo ~ 10 veces e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 min.
   8. Vuelva a colocar los tubos en el soporte magnético y espere 5 minutos. Una vez que las cuentas se hayan asentado, transfiera el sobrenadante de ADN a un nuevo tubo.
7. PCR I para añadir una etiqueta de biotina a los fragmentos de ADN que contienen el casete de inserción
   1. Añadir una etiqueta de imprimación biotinilada a los fragmentos de ADN que contienen el cassette de inserción de Tn5 utilizando la imprimación biotinilada específica del transposón (Tabla 5) y una imprimación de índice. Preparar la mezcla maestra de PCR según la Tabla 6 y seguir las condiciones de PCR para el termociclador enumeradas en la Tabla 7.
8. Limpieza de PCR I sin selección de tamaño
   1. Vórtice 0.9x perlas y colóquelas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de la limpieza.
   2. Agregue 0.9x perlas a los productos de PCR y mezcle bien.
   3. Coloque las cuentas en un soporte magnético para tirar de las cuentas.
   4. Retire el sobrenadante transparente y lave el ADN unido a la perla con 200 μL de etanol 80% recién preparado dos veces.
   5. Retire el etanol después de los pasos de lavado y seque al aire las perlas hasta que se vean brillantes pero no demasiado secas.
   6. Añadir 32 μL de 10 mM Tris-HCl o 0.1X TE (Low-TE) e incubar las perlas durante 5 min. Coloque la mezcla de nuevo en el soporte magnético y transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuge fresco.
9. Unión de fragmentos de ADN biotinilado a perlas de estreptavidina
   1. Resuspend 32 μL de perlas de estreptavidina en 1x tampón de unión y lavado. Lave las cuentas con el tampón tres veces mientras se colocan en un soporte magnético.
   2. Agregue 32 μL de tampón 2x Bind-and-wash y vuelva a colocar las perlas. A esto, agregue 32 μL de los productos PCR 1 limpiados. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Coloque la mezcla de perlas y ADN en un soporte magnético durante 2 minutos. Pipetee el sobrenadante ya que el ADN marcado con biotina que contiene el borde de inserción se une a la estreptavidina en las perlas.
   4. Lave las perlas con 500 μL de tampón de unión y lavado 1x y luego lave las cuentas con 200 μL de Low-TE. Resuspend las perlas unidas al ADN en 17 μL de TE baja.
10. PCR II para añadir adaptadores a los fragmentos que contienen el borde del cassette de inserción
    1. Prepare una mezcla maestra, como se muestra en la Tabla 8,utilizando los cebadores de índice y los cebadores de PCR universal modificados enumerados en la Tabla 5. Agregue 15 μL de las perlas de estreptavidina unidas al ADN del paso anterior a la mezcla de PCR. Consulte la Tabla 7 para conocer las condiciones del termociclador.
11. Limpie los productos de PCR sin selección de tamaño como se da en el paso 6.8 de este protocolo. Elute los productos finales de ADN en 30 μL de agua de grado molecular.
12. Almacene las muestras a -20 °C y utilícenlas para la secuenciación.

7. Secuenciación y análisis

1. Secuenciar la biblioteca utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Ajuste la profundidad de secuenciación en función del tamaño de la biblioteca de transposones, como se indica a continuación. Evalúe la calidad de lectura con FastQC⁷. Seleccione las lecturas que contienen la arista de inserción Tn5 en el extremo 5' de la lectura y elimine la secuencia de aristas de inserción mediante Cutadapt⁸ y/o Trimmomatic^9.
   NOTA: Aquí, se utilizó un enfoque de secuenciación de extremo pareado para apuntar a 150 pb por lectura y un total de 8 lecturas de Mio. Para obtener un conjunto de datos representativo, asegúrese de que el número total de lecturas secuenciadas supere el número máximo posible de mutantes en la biblioteca, es decir, el número total estimado de colonias a partir del paso 2.9. Como referencia, este protocolo apuntaba a 40 veces el tamaño máximo posible de la biblioteca. Otros estudios exitosos que utilizaron Tn-seq para un propósito similar secuenciaron un número total de lecturas cercanas a 25 veces el número real de inserciones únicas en la biblioteca mutante correspondiente^22,23.
2. Teniendo en cuenta que las mutaciones en los extremos de los genes no son funcionalmente disruptivas, recorte un 5% de ambos extremos de las anotaciones de genes del archivo GFF del genoma de referencia. Mapee las lecturas recortadas al genoma de referencia usando Bowtie2¹⁰.
3. Calcule el número de inserciones a partir del número de posiciones únicas de 5' en el archivo BAM de alineación.
4. Usando FeatureCounts¹¹, obtenga el número de genes hit para cada muestra replicada.
5. Usando el paquete DESeq2¹² en RStudio, calcule la diferencia en abundancias mutantes entre diferentes condiciones.

Resultados

Las bacterias asociadas al huésped pueden emplear varios factores para establecer una asociación, incluidos los que median la adhesión, la motilidad, la quimiotaxis, las respuestas al estrés o los transportadores específicos. Si bien se han reportado factores importantes para las interacciones patógeno-huésped para varias bacterias^{13,14,15,16,17,18,}incluidos los miembros del género Burkholderia^19,20,menos estudios han explorado los mecanismos moleculares utilizados por los simbiontes beneficiosos para la colonización^21,22,23 . Utilizando la secuenciación de inserción de transposones, el objetivo fue identificar los factores moleculares que permiten a B. gladioli colonizar los escarabajos L. villosa.

La mutagénesis mediada por transposón se realizó utilizando el plásmido pRL27, que lleva un transposón Tn5 y un cassette de resistencia a la kanamicina flanqueado por sitios de repetición invertida. El plásmido se introdujo en las células diana B. gladioli Lv-StA por conjugación con el donante plásmido E. coli WM3064 cepa (como se muestra en la Figura 1). Después de la conjugación, la mezcla de conjugación que contenía células receptoras de B. gladiolos y donantes de E. coli se enchaparon en placas de agar selectivas que contenían kanamicina. La ausencia de DAP en las placas eliminó las células de E. coli del donante, y la presencia de kanamicina seleccionada para transconjugantes exitosos de B. gladioli Lv-StA. La biblioteca de mutantes B. gladioli Lv-StA agrupada obtenida de la cosecha de las 100,000 colonias transconjugantes se preparó para su secuenciación utilizando un kit de preparación de biblioteca de ADN modificado y cebadores personalizados. La Figura 2 destaca los pasos de preparación de la biblioteca de ADN. La secuenciación produjo 4 lecturas pareadas de Mio; 3.736 genes de 7.468 genes en B. gladioli Lv-StA fueron alterados.

Para identificar mutantes que eran defectuosos para la colonización en el huésped, la biblioteca de mutantes B. gladioli Lv-StA se infectó en los huevos de escarabajos y se cultivó in vitro en medio KB como control. El tamaño del cuello de botella de colonización in vivo se calculó antes del experimento. Un número conocido de células B. gladioli Lv-StA se infectó en huevos de escarabajo, y el número de células colonizadoras en las primeras larvas de instar recién eclosionadas se obtuvo mediante el recubrimiento de una suspensión de cada larva y el recuento de unidades formadoras de colonias por individuo. Estos cálculos se realizaron para garantizar que el número de células colonizadoras sea suficiente para evaluar todos o un alto porcentaje de los mutantes en la biblioteca por su capacidad para colonizar al huésped. Además, el tiempo de crecimiento entre las condiciones in vitro e in vivo se normalizó en función del número de generaciones bacterianas para hacer que estas muestras sean comparables.

Después de que los huevos eclosionaron, se recolectaron 1.296 larvas en 13 piscinas. Los cultivos mutantes in vitro correspondientes se cultivaron y almacenaron como reservas de glicerol. El ADN de las bibliotecas mutantes cultivadas in vivo e in vitro se extrajo y fragmentó en un ultrasonido. La Figura 3 muestra la distribución de tamaño del ADN cizallado, donde la mayoría de los fragmentos abarcan entre 100 y 400 pb, como se esperaba. Este paso fue seguido por el protocolo de preparación de la biblioteca de ADN modificado para la secuenciación. En cada paso del protocolo, se comprobó la concentración de ADN restante para garantizar que los pasos se realizaran correctamente y para rastrear las pérdidas de ADN. Un control de calidad (ver la Tabla de Materiales)antes de la secuenciación reveló que las bibliotecas de ADN contenían fragmentos de ADN inesperadamente grandes (>800 pb), y esto fue más pronunciado en las bibliotecas in vivo. Dada la dificultad de optimizar la agrupación de fragmentos en los carriles de secuenciación, fue necesario aumentar la profundidad de secuenciación a 10 Mio de lecturas pareadas en las bibliotecas in vivo para alcanzar el número deseado de lecturas. El análisis de los resultados de la secuenciación reveló que un promedio de 4 Mio lee en las bibliotecas in vivo y 3.1 Mio lee en las bibliotecas in vitro que contenían el borde del transposón en el extremo 5' de Read-1(Tabla 9),lo que fue satisfactorio para este experimento. La distribución de las 24.224 inserciones únicas a través del genoma de B. gladioli en la biblioteca original se muestra en la Figura 4. Un análisis realizado utilizando DESeq2 reveló que las abundancias de 271 mutantes eran significativamente diferentes entre las condiciones in vivo e in vitro.

Figura 3: Geles de agarosa de un mutante y bibliotecas de ADN. (A) Gel de agarosa con ADN inaudito de un mutante en el carril x y una escalera de 1 kbp para la escala. (B) Gel con biblioteca de ADN esquilado. Los tamaños de banda de la escalera en el primer carril se indican en el lado izquierdo. Los tres primeros carriles a, b y c contienen fragmentos de ADN esquilados de las bibliotecas in vivo. Los carriles d, e, f y g contienen fragmentos de ADN cizallados de las bibliotecas in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4:Ubicación de sitios de inserción únicos en la biblioteca original a través de los cuatro replicones en el genoma de Burkholderia gladioli Lv-StA. Cada barra a lo largo del eje x se encuentra en un sitio de inserción. La altura de una barra a lo largo del eje Y corresponde al número de lecturas asociadas con ese sitio. Tenga en cuenta que los dos cromosomas y dos plásmidos se muestran en longitud completa y, por lo tanto, tienen diferentes escalas en el eje x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

King's B medio / agar
Peptona (soja)	20 g/L
K2HPO4	1,5 g/L
MgSO4.7H2O	1,5 g/L
Agar-agar	15 g/L
Disuelto en agua destilada
LB medio/agar
Triptona	10 g/L
Extracto de levadura	5 g/L
NaCl	10 g/L
Disuelto en agua destilada

Tabla 1: Componentes de medios.

No.	Imprimaciones	Secuencia		Temperatura de recocido por PCR (°C)
1	tpnRL17–1RC	5'-CGTTACATCCCTGGCTTGTT-3'		58.2
2	tpnRL13–2RC	5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'

Tabla 2: Imprimaciones para confirmar el éxito de la conjugación.

Componente	Volumen (μL)
Agua purificada por HPLC	4.92
10x Buffer S (alta especificidad)	1
MgCl2 (25 mM)	0.2
dNTP (2 mM)	1.2
Imprimación 1 (10 pmol/μL)	0.8
Imprimación 2 (10 pmol/μL)	0.8
Taq (5 U/μL)	0.08
Total de Mastermix	9
Plantilla	1

Tabla 3: Mezcla maestra de PCR para confirmar el éxito de la conjugación. Abreviaturas: HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento; dNTPs = trifosfato de desoxinucleósido.

Pasos	Temperatura °C	Hora	Ciclos
Desnaturalización inicial	95	3 min	1
Desnaturalización	95	40 s
Recocido	58.2	40 s	De 30 a 35
Extensión	72	1-2 min
Extensión final	72	4 minutos	1
Sostener	4	∞

Tabla 4: Condiciones de PCR para confirmar el éxito de la conjugación.

Imprimaciones	Secuencia		Tm °C	Uso	Fuente
Imprimación biotinilada específica del transposón	5'-Biotina-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'		63.5	6.7.1. PCR I	Costumbre
Imprimación PCR universal modificada	5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'		62	6.10.1. PCR II	Costumbre
Cartilla de índice	Consulte el manual del fabricante			6.7.1. PCR I y 6.10.1. PCR II	NEBNext Multiplex Oligos para Illumina (Conjunto de cebadores de índice 1)
Adaptador	Consulte el manual del fabricante			6.5. Ligadura del adaptador	Kit de preparación de la biblioteca de ADN NEBNext Ultra II para Illumina

Tabla 5: Cebadores y adaptador para PCR I y II durante la preparación de la biblioteca de ADN.

Mezcla de PCR	(μL)
Fragmentos de ADN ligados por adaptador	15
Mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5	25
Imprimación índice (10 pmol/μL)	5
Imprimación biotinilada específica de transposones (10 pmol/ μL)	5
Volumen total	50

Tabla 6: Preparación de la biblioteca de ADN-MEZCLA MAESTRA DE PCR I.

Pasos	Temperatura	Hora	Ciclos
Desnaturalización inicial	98 °C	30 s	1
Desnaturalización	98 °C	10 s	De 6 a 12
Recocido	65 °C	30 s
Extensión	72 °C	30 s
Extensión final	72 °C	2 min	1
Sostener	16 °C	∞

Tabla 7: Preparación de la biblioteca de ADN-condiciones de PCR I y II.

Mezcla de PCR	(μL)
ADN seleccionado por perlas	15
Mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5	25
Cartilla de índice	5
Imprimación PCR universal modificada	5
Volumen total	50

Tabla 8: Preparación de la biblioteca de ADN-Mezcla maestra de PCR II.

Bibliotecas		Invivo-1	Invivo-2	Invivo-3	Invitro-1	Invitro-2	Invitro-3	Biblioteca original
No. de lecturas (PE)		56,57,710	39,19,051	30,65,849	35,73,494	28,83,440	36,61,956	46,09,410
No. de lecturas que contienen Tn – borde en el extremo 5' de Read-1		54,15,880	37,31,169	29,36,247	33,00,499	27,35,705	33,50,402	41,53,270
Tasa de alineación general de Bowtie2 (%) (solo Lectura-1)		95.53%	83.71%	89.87%	80.79%	78.00%	73.06%	74.92%
Número de inserciones únicas		8,539	4,134	7,183	18,930	18,421	20,438	24,224
Número de genes afectados		1575	993	1450	2793	2597	3037	3736

Tabla 9: Resumen de la salida de secuenciación y la frecuencia de inserción de transposones por biblioteca. Abreviatura: PE = pareado- final.

Discusión

Se generó una biblioteca de mutantes de transposones de B. gladiolos para identificar importantes factores de colonización del huésped en la interacción simbiótica entre los escarabajos L. villosa y la bacteria B. gladioli. Los principales pasos en el protocolo fueron la conjugación, la infección del huésped, la preparación de la biblioteca de ADN y la secuenciación.

Como muchas cepas de Burkholderia son susceptibles de modificación genética por conjugación^24,25, el plásmido que lleva el transposón y el cassette de inserción de antibióticos se conjudicó con éxito en la cepa objetivo B. gladioli Lv-StA de E. coli. Los intentos anteriores de transformación por electroporación produjeron muy bajo o casi ningún transformador de B. gladioli. Es aconsejable optimizar la técnica de transformación para que el organismo objetivo produzca de manera eficiente una gran cantidad de transformadores.

Una ronda de conjugación y 40 puntos de conjugación interrumpieron 3.736 genes en B. gladioli Lv-StA. En retrospectiva, serían necesarias múltiples rondas de conjugación para interrumpir la mayoría de los 7.468 genes y obtener una biblioteca saturada. En particular, no se permitió que el tiempo de incubación durante la conjugación superara las 12-18 h, que es el final de la fase de crecimiento exponencial de B. gladioli. Permitir la conjugación más allá de la fase de crecimiento exponencial de las células bacterianas reduce las posibilidades de éxito de la obtención de transconjugantes²⁶. Por lo tanto, el período de conjugación debe ajustarse de acuerdo con el crecimiento de la especie bacteriana.

Para llevar a cabo con éxito un experimento que involucre la infección de bibliotecas mutantes en un huésped, es importante evaluar el tamaño del cuello de botella de la población bacteriana durante la colonización y la diversidad de mutantes en la biblioteca antes de la infección^1,2,27. En preparación para el experimento, estimamos que el número mínimo de escarabajos que deben infectarse tiene una alta probabilidad de que cada mutante en la biblioteca sea muestreado y se le permita colonizar. También se calculó el tiempo aproximado de generación bacteriana in vivo y el número de generaciones durante la duración del experimento. El cultivo in vitro se cultivó hasta un número comparable de generaciones ajustando el tiempo de incubación. Para un experimento de infección similar en otros huéspedes no modelo, es deseable la capacidad de mantener un cultivo de laboratorio y una fuente constante de los organismos huéspedes.

Tras el crecimiento de la biblioteca de mutantes in vivo e in vitro y la recolección de muestras, se llevó a cabo un protocolo de preparación de la biblioteca de ADN modificado para la secuenciación de inserción de transposones. La modificación en el protocolo implicó el diseño de cebadores de PCR personalizados y la adición de pasos de PCR para seleccionar fragmentos de ADN que contienen el casete de inserción. Debido a que el protocolo se personalizó, los ciclos de PCR adicionales en el protocolo aumentaron el riesgo de sobreamplificación y la obtención de fragmentos híbridos de adaptador-adaptador en las bibliotecas finales. Por lo tanto, se recomienda un paso final de limpieza (sin selección de tamaño) después de las dos PCR, ya que ayuda a eliminar estos fragmentos. La distribución del tamaño de las bibliotecas de ADN fue aún más amplia de lo esperado. Sin embargo, el aumento de la profundidad de secuenciación proporcionó datos suficientes que se filtraron durante el análisis bioinformático, obteniendo resultados satisfactorios.

Como la mutagénesis mediada por transposones genera miles de inserciones aleatorias en un solo experimento, es posible generar una biblioteca saturada de mutantes que contiene todos excepto aquellos mutantes donde se han interrumpido genes esenciales para el crecimiento bacteriano. Lo más probable es que no trabajáramos con una biblioteca de mutantes saturados, dadas las estimaciones de genes esenciales en otros estudios sobre Burkholderia sp. ^28,29. Sin embargo, una biblioteca no saturada ayuda a explorar varios genes candidatos para estudios adicionales utilizando mutagénesis dirigida. Antes de los experimentos, también es importante recordar que algunos transposones tienen sitios objetivo de inserción específicos que aumentan la abundancia de mutantes en ciertos loci en el genoma³⁰. Se sabe que los transposones de Mariner se dirigen a sitios AT para la inserción^31,y los transposones Tn5 tienen un sesgo GC^32,33. Incluir pasos durante el análisis bioinformático para reconocer puntos críticos para las inserciones de transposones ayudará a evaluar cualquier sesgo de distribución.

Aunque es propenso a contratiempos, un experimento de secuenciación de inserción de transposones bien diseñado puede ser una herramienta poderosa para identificar muchos genes condicionalmente importantes en bacterias dentro de un solo experimento. Por ejemplo, una docena de genes en Burkholderia seminalis importantes para la supresión de la necrosis de la hoja de orquídea se identificaron combinando la mutagénesis del transposón y la genómica³⁴. Más allá de Burkholderia,se han identificado varios genes y transportadores de adhesión y motilidad como factores de colonización importantes en simbiontes de Snodgrassella alvi de Apis mellifera (Honeybee)^22,y en los simbiontes Vibrio fischerii de scolopes Euprymna (calamar bobtail hawaiano)²³ utilizando el enfoque de mutagénesis transposon-inserción.

Como enfoque alternativo, la mutagénesis de transposones puede ir seguida de la detección de mutantes individuales utilizando medios selectivos en lugar de secuenciación. El cribado fenotípico o los bioensayos para identificar deficiencias, como la motilidad, la producción de metabolitos secundarios bioactivos o auxotrofias específicas, son factibles. Por ejemplo, el cribado de una biblioteca mutante de burkholderia insecticola (reasignada al género Caballeronia³⁵⁾ha sido clave para identificar que los simbiontes emplean genes de motilidad para colonizar Riptortus pedestris,su insecto huésped^36. Además, utilizando mutagénesis de transposones y cribado fenotípico, se identificó el grupo de genes biosintéticos para el metabolito secundario bioactivo carioynencina en Burkholderia caryophylli³⁷. Se identificó un mutante auxotrófico de Burkholderia pseudomallei tras la mutagénesis de transposones y el cribado y es un posible candidato a vacuna atenuado contra la melioidosis, una enfermedad peligrosa en humanos y animales³⁸. Por lo tanto, la mutagénesis y secuenciación de transposones es un enfoque valioso en el estudio de los rasgos moleculares de las bacterias que son importantes para las interacciones con sus respectivos huéspedes en asociaciones patógenas o mutualistas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2,6- Ácido diaminopimélico	Alfa Aesar	B22391	para E.coli WM3064+ pRL27
Agar - Agar	Roth	5210
Agarosa	Biozym	840004
AMPure beads XP (perlas magenticas + polietilenglicol + sales)	Beckman Coulter	A63880	Selección de tamaño en el paso 6.6
Lejía (NaOCl) 12%	Roth	9062
Bowtie2 v.2.4.2			Herramienta bioinfromática para el mapeo de lecturas. Referencia 10 en el manuscrito principal.
Buffer-S	Peqlab	PEQL01-1020	Para PCRs
Raspador de células	Sarstedt	83.1830
Cutadapt v.2.10			Herramienta bioinformática para eliminar secuencias de adaptador específicas de las lecturas. Referencia 8 en el manuscrito principal.
Paquete DESeq2			RStudio para evaluar la abundancia diferencial de mutantes. Por lo general, se utiliza para el análisis de RNAseq. Referencia 12 en el manuscrito principal.
Escalera de ADN 100 pb	Roth	T834.1
dNTPs	Life Technology	R0182	PCR para confirmar el éxito de la conjugación
EDTA, sal disódica	Roth	8043
Epicentre MasterPure Kit completo de purificación de ADN y ARN Lucigen		MC85200
Bromuro de etidio	Roth	2218.1
FastQC v.0.11.8			Herramienta bioinformática para evaluar la calidad de los datos de secuenciación. Referencia 7 en el manuscrito principal.
FeatureCounts v.2.0.1			Herramienta bioinformática para obtener recuentos de lecturas por característica genómica. Referencia 11 en el manuscrito principal.
Glicerol	Roth	7530
K2HPO4	Roth	P749
Sulfato de kanamicina	Serva	26899
KCl	Merck	4936
KH2PO4	Roth	3904
MgSO4.7H2O	Roth	PO27
Na2HPO4	Roth	P030
NaCl	Merck	6404
NEBNext Multiplex Oligos para Illumina (Juego de cebadores de índice 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II Kit de preparación de la biblioteca de ADN para Illumina	New England Biolabs	E7645S
Peptona (soja)	Roth	2365	Para Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium
peqGOLD 'Hot' Taq- ADN polimerasa	VWR	PEQL01-1020	PCR para confirmar el éxito de la conjugación
Placas de Petri - 145 x 20 mm	Roth	XH90.1	Para la selección de transconjugantes
Placas de Petri - 90 x 16 mm	Roth	N221.2
Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Alemania)			Control de calidad después de la preparación de la biblioteca de ADN
Perlas de estreptavidina	Roth	HP57.1
Taq ADN polimerasa	VWR	01-1020
Trimmomatic v.0.36			Herramienta bioinformática para el recorte de lecturas de baja calidad y también secuencias de adaptación. Referencia 9 en el manuscrito principal.
Tris -HCl	Roth	9090.1
Triptona	Roth	2366	Para Escherichia coli WM3064 + pRL27 LB
medio Ultrasonicador	Bandelin	GM 70 HD	Para cizallamiento
Enzima del USUARIO (uracilo ADN glicosilasa + ADN glicosilasa-liasa Endonucleasa VIII)	New England Biolabs	E7645S	Ligadura paso 6.5.2
Extracto de	levaduraRoth	2363