Secuenciación de transposon-inserción como herramienta para dilucidar factores de colonización bacteriana en un simbionte de gladiolos de Burkholderia de escarabajos lagria villosa

Burkholderia gladioli puede participar en una asociación simbiótica con los escarabajos Lagria villosa, desempeñando un papel importante en la defensa contra los antagonistas microbianos del insecto huésped^4,5,6. Los escarabajos hembra albergan varias cepas de B. gladioli en glándulas especializadas accesorias al sistema reproductivo. Al poner huevos, las hembras untan las células de B. gladiolos en la superficie del huevo donde los compuestos antimicrobianos producidos por B. gladioli inhiben las infecciones por hongos entomopatógenos^4,6. Durante el desarrollo embrionario tardío o temprano después de la eclosión de las larvas, las bacterias colonizan las invaginaciones cuticulares en la superficie dorsal de las larvas. A pesar de esta localización especializada y la ruta de transmisión vertical de los simbiontes, L. villosa presumiblemente también puede adquirir B. gladioli horizontalmente del entorno⁴. Además, se han encontrado al menos tres cepas de B. gladioli en asociación con L. villosa^4,6. Entre estos, B. gladioli Lv-StA es el único que es susceptible de cultivo in vitro.

B. gladiolos Lv-StA tiene un tamaño de genoma de 8,56 Mb⁶ y contiene 7.468 genes. ¿Cuál de estos genes es importante para que la bacteria B. gladioli colonice al huésped escarabajo? Para responder a esta pregunta, utilizamos la secuenciación de transposon-inserción (Tn-seq), un método exploratorio para identificar genes microbianos condicionalmente esenciales^1,2,3. Una biblioteca mutante de B. gladioli Lv-StA fue creada usando un transposón Tn5. A través de la conjugación de células donantes de Escherichia coli a B. gladioli Lv-StA, se transfirió un plásmido pRL27 portador del transposón Tn5 y un casete de resistencia a antibióticos flanqueado por repeticiones invertidas (Figura 1). De este modo, se generó un conjunto de mutantes que individualmente portan interrupciones de 3.736 genes simbiontes(Figura 2).

El grupo mutante se infectó en huevos de escarabajo para identificar los factores de colonización y, como control, también se cultivó in vitro en el medio King's B (KB). Después de permitir suficiente tiempo para la colonización, las larvas eclosionadas se recolectaron y agruparon para la extracción de ADN. Los fragmentos de ADN que contienen el inserto del transposón y la región genómica flanqueante de B. gladioli Lv-StA se seleccionaron utilizando un protocolo de preparación de la biblioteca de ADN modificado para la secuenciación. El procesamiento de calidad de lectura seguido de un análisis con DESeq2 se llevó a cabo para identificar genes específicos cruciales para que B. gladioli Lv-StA colonice las larvas de L. villosa cuando se transmiten a través de la superficie del huevo.

1. Preparación de medios y búferes

1. Prepare los medios KB y LB y las placas de agar como se da en la Tabla 1, y el autoclave a 121 ° C, 15 psi, 20 min.
   1. Añadir 50 μg/ml de kanamicina esterilizada por filtro y ácido 2,6-diaminopimélico (DAP) esterilizado por filtro de 300 μM al medio LB en autoclave antes de cultivar E.coli WM3064 + pRL27.
   2. Agregue kanamicina esterilizada por filtro de 50 μg/ml al agar KB en autoclave para verter las placas necesarias para seleccionar transconjugantes exitosos de B. gladioli Lv-StA.
2. Preparar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) mezclando los siguientes componentes: NaCl 8 g/L, KCl 0.201 g/L, Na₂HPO₄ 1.42 g/L y KH₂PO_{4 0.272} g/L. Disolver las sales en agua destilada y autoclave la mezcla a 121 °C, 15 psi, 20 min antes de su uso. Conservar a temperatura ambiente.
3. Prepare un tampón 2x Bind-and-wash disolviendo los siguientes componentes: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM de ácido tetraacético etilendiamina (EDTA) y 2 M de NaCl en agua destilada. Filtrar-esterilizar la mezcla antes de su uso. Conservar a temperatura ambiente.
4. Prepare 1x Low-TE disolviendo 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) y 0.1 mM EDTA en agua de doble destilación. Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 psi, 20 min. Conservar a temperatura ambiente.

2. Conjugación para generar la biblioteca mutante de transposones

Figura 1: Pasos del protocolo de conjugación. El receptor de conjugación Burkholderia gladioli Lv-StA (rojo) y el donante Escherichia coli que contiene el plásmido pRL27 (rosa) se cultivan en agar KB y LB, respectivamente, complementados con kanamicina y DAP. Después de la transferencia conjugativa del plásmido durante 12-18 h a 30 °C, las células transconjugantes de B. gladioli se seleccionan en KB que contienen kanamicina y se agrupan. Abreviaturas: DAP = ácido 2,6-diaminopimílico; Kan = kanamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Bajo una capucha estéril, inocular un cultivo de donante fresco de Escherichia coli WM3064 + pRL27 en 10 ml de lb medio suplementado con kanamicina y DAP. Inocular células receptoras de Burkholderia gladioli Lv-StA en 5 mL de KB medio. Incubar los cultivos a 30 °C durante la noche en una coctelera a 250 rpm.
2. Después del crecimiento durante la noche, centrífuga 4 ml de cada uno de los cultivos a 9.600 × g durante 6 minutos para peletizar las células. Deseche el sobrenadante.
3. Bajo una capucha estéril, lave los cultivos celulares granulados en medio KB que contenga DAP y finalmente vuelva a colocar los cultivos por separado en 4 mL de medio KB + DAP.
4. En un tubo fresco de 15 ml, mezcle 250 μL de las células donantes de E. coli lavadas con 1 ml de las células receptoras de B. gladioli Lv-StA lavadas.
5. Punto 10 μL de esta mezcla de células de conjugación en placas de agar KB que contienen DAP. Deje que la placa descanse sin ser molestada en la campana estéril a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, incuba las placas con los puntos de conjugación a 30 °C durante 12-18 h.
   NOTA: El período de conjugación se puede ajustar de acuerdo con la especie objetivo. Sin embargo, un largo período de conjugación aumenta el riesgo de inserciones dobles o integración de plásmidos en el genoma. Para las bacterias de crecimiento lento, permita períodos de conjugación más largos.
6. Después de la incubación, agregue 2-4 ml de 1x PBS en las placas debajo de una capucha estéril y use un raspador celular para liberar las manchas de conjugación bacteriana cultivadas del agar. Pipetear la mezcla de células conjugadas en tubos de microfuge de 2 ml.
7. Pellet las células centrifugando a 9.600 × g durante 2 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet dos veces en 1 ml de 1x PBS pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Resuspend el pellet final en 1200 μL de 1x PBS. Hacer diluciones antes del recubrimiento si el número de células en la mezcla es superior a 1 × 10⁴.
8. Mezclar bien y extender 200 μL de la mezcla celular en placas grandes de agar KB (6 o más, si es necesario) suplementadas con kanamicina e incubar a 30 °C durante la noche.
   NOTA: Las colonias mutantes objetivo aparecen dentro de las 30 h en las placas de agar selectivo. Debido al marcador de resistencia a los antibióticos, solo aparecen colonias mutadas en la placa de agar selectivo. Por lo tanto, se espera que todas las colonias sean transconjugantes exitosos.
9. Contar el número total de colonias transconjugantes en tres placas y extrapolar para calcular el número aproximado de mutantes obtenidos en todas las placas. Para aumentar las posibilidades de obtener una biblioteca representativa, asegúrese de que el número total de colonias sea varias veces mayor que el número total de genes en el genoma. Para confirmar el éxito de la conjugación, realice una PCR dirigida al cassette de inserción utilizando 10-20 colonias de muestra, como se describe en la sección 3.
   NOTA: El objetivo es garantizar que el número de colonias sea al menos 10 veces el número de genes en todo el genoma, en este caso, >75.000 mutantes. Sin embargo, generalmente es difícil estimar con precisión el número de colonias que corresponderían a una biblioteca totalmente representativa. El número de genes únicos mutados no es evidente en este momento, dado que las interrupciones en los genes esenciales no se capturan, a menudo hay múltiples sitios de mutación diferentes para el mismo gen, y las mutaciones generadas con transposones Tn5 no son completamente aleatorias.
10. Bajo una capucha estéril, raspe las colonias de las placas agregando 1-2 ml de 1x PBS en el agar. Aguna la mezcla celular raspada de las placas en tubos de 50 ml. Vórtice la biblioteca para mezclarla a fondo y luego divida 4 ml de la biblioteca mutante agrupada en varios criotubos. Añadir 1 ml de glicerol al 70% a los tubos y conservar a -80 °C.

3. PCR y electroforesis en gel para confirmar inserciones exitosas en B. gladioli Lv-StA

1. Para confirmar la presencia de la inserción, elija colonias mutantes individuales de las placas de selección en el paso 2.9 y realice una PCR dirigida al cassette de inserción utilizando los cebadores enumerados en la Tabla 2. Preparar la mezcla maestra de PCR de acuerdo con la Tabla 3 y establecer las condiciones en el termociclador como se describe en la Tabla 4.
2. Ejecute los productos de PCR en un gel de agarosa al 1,6% por electroforesis (250 V, 40 min) para verificar si los fragmentos de ADN amplificados son de la longitud esperada de 1580 pb.

4. Infección mutante de la piscina en huevos de escarabajo

1. Pasos de lavado de la biblioteca
   1. Descongela una alícuota de la biblioteca mutante preparada sobre hielo. Centrifugar a 2.683 × g durante 10 min y retirar el sobrenadante. Bajo una capucha estéril, lave las células con 4 ml de 1 pbS para eliminar cualquier medio restante de las células. Resuspend las células en 4 mL de 1x PBS.
   2. Cuente el número de celdas en una alícuota de la biblioteca utilizando una cámara de conteo de celdas. Diluya una parte de la biblioteca a 2 × 10⁶ células/μL en 1x PBS.
   3. Vórtice la alícuota de la biblioteca a fondo para mezclar toda la biblioteca de manera homogénea antes de tomar el volumen requerido.
2. Esterilización de la nidada de huevos e infección in vivo
   1. Seleccione un embrague de huevo L. villosa. Cuente el número de huevos y continúe si la puesta contiene más de 100 huevos.
   2. Esterilizar todo el embrague de huevos.
      1. Añadir 200 μL de etanol al 70% y lavar suavemente los huevos durante 5 min. Retire el etanol y lave los huevos dos veces con agua en autoclave.
      2. Añadir 200 μL de lejía al 12% (NaOCl) y lavar suavemente los huevos durante 30 s. Retire la lejía inmediatamente y lave los huevos nuevamente tres veces con 200 μL de agua en autoclave.
   3. Infectar 2 × 10⁶ células/μL de la biblioteca mutante lavada en la nidada de huevos esterilizados (2,5 μL por huevo).
   4. Dos días después de que eclosionen las larvas de escarabajo infectado, recolecte 100 larvas^{de 2º} instar por tubo de microfuge de 1,5 ml y guárdelo a -80 ° C.
3. Control de biblioteca mutante in vitro
   1. Bajo una capucha estéril, inocular 250 μL de 2 × 10⁶ células/μL de la biblioteca mutante lavada en 10 mL de medio KB que contenga kanamicina.
   2. Incubar el cultivo mutante in vitro a 30 °C durante 20 h.
      NOTA: Calcule la duración de la incubación para que coincida con el número aproximado de generaciones de WT B. gladioli Lv-StA in vivo durante la colonización.
   3. Después de la incubación de 20 h, agregue un volumen igual de glicerol al 70% al cultivo mutante in vitro y guárdelo a -80 ° C.

5. Escarabajos infectados y extracción de ADN de biblioteca mutante in vitro

NOTA: Las extracciones de ADN se realizaron utilizando un kit de purificación de ADN y ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante que se describe brevemente a continuación.

1. Homogeneizar las larvas agrupadas (máximo de 4 mg por tubo de microfuge) añadiendo 1-2 mL de nitrógeno líquido y triturando con un mortero.
2. Descongelar los cultivos mutantes cultivados in vitro a partir de existencias de glicerol en el hielo. Peletizar las células centrifugando a 9.600 × g durante 10 min antes de la lisis celular.
3. Añadir 300 μL de solución de lisis tisular y celular a las muestras in vitro e in vivo. Agregue 5 μL de 10 mg/ml de proteinasa K, incube la mezcla a 60 °C durante 15 min y luego colóquela en hielo durante 3-5 min.
4. Agregue 150 μL de reactivo de precipitación de proteínas a los lisados y vórtice a fondo. Pellet los restos de proteínas centrifugando a 9.600 × g durante 10 min.
5. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuge de 1,5 ml. Añadir 500 μL de isopropanol al sobrenadante e invertir suavemente los tubos al menos 40 veces antes de incubar a -20 °C durante 1 h o durante la noche.
6. Gletear el ADN precipitado centrifugando a 9.600 × g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y agregue etanol helado al 70% al pellet de ADN.
7. Centrifugadora a ≥10.000 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y deje que las muestras se sequen al aire durante al menos 1 h.
8. Resuspend el ADN de las muestras in vitro e in vivo en 100 μL de tampón low-TE.
9. Conservar las muestras a -20 °C.

6. Preparación de la biblioteca de secuenciación

NOTA: El protocolo y los reactivos para la preparación de la biblioteca de ADN se adaptan y modifican a partir de las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit de preparación de la biblioteca de ADN.

Figura 2: Esquema de los pasos de preparación de la biblioteca de ADN. Después del cizallamiento y la ligadura del adaptador, el protocolo modificado incluye un paso de selección de perlas de estreptavidina para enriquecer los fragmentos de ADN que contienen el casete de inserción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Diluya las muestras a una concentración de 20 ng/μL y un volumen de 100 μL y manténgalas en hielo.
2. Corte de ADN de muestra in vivo e in vitro utilizando un ultrasonido. Configure el ultrasonido al 70% de potencia. Vórtice las muestras brevemente y cizalla durante 1 min 30 s.
   NOTA: La configuración del ultrasonido diferirá entre los instrumentos. En este caso, el tamaño del fragmento fue de 200-400 pb, lo cual es apropiado para este enfoque de secuenciación de 150 pb, pareado (ver paso. 9.1). Los parámetros de cizallamiento se pueden ajustar de acuerdo con los requisitos del experimentador.
3. Compruebe si el ADN se cizalló al rango de tamaño deseado (en este caso, 200-400 pb). Cargue 5 μL del ADN no escuchado y esquilado después de mezclarlo con el tinte de carga de gel en una proporción de 1: 1 en un gel de agarosa al 1.6% a 250 V durante 40 min (Figura 3A,B).
4. Preparación de los extremos de los fragmentos necesarios para la ligadura del adaptador
   1. A 50 μL del ADN esquilado, agregue los reactivos de preparación final dados en el kit de preparación de la biblioteca: 3 μL de la mezcla de enzimas y 7 μL de tampón de reacción y mezcle bien mediante pipeteo. Fije un termociclador con una tapa calentada a ≥ 75 °C e incube las muestras durante 30 min a 20 °C y 30 min a 65 °C. Mantener a 4 °C.
5. Ligadura del adaptador
   1. Para la ligadura del adaptador, agregue los siguientes reactivos a los productos de la etapa de preparación final: Mezcla maestra de ligadura de 30 μL, Potenciador de ligadura de 1 μL y Adaptador diluido de 2,5 μL. Mezclar bien mediante pipeteo e incubar la muestra durante 15 min a 20 °C en el termociclador con la tapa calentada apagada.
   2. Después de 15 min, agregue 3 μL de la enzima (uracilo ADN glicosilasa + ADN glicosilasa-liasa Endonucleasa VIII) (ver la Tabla de Materiales). Mezclar bien mediante pipeteo e incubar la muestra durante 15 min a 37 °C en un termociclador con la tapa calentada a ≥47 °C.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en este paso y las muestras se pueden almacenar a -20 °C.
6. Selección de tamaño de ADN ligado al adaptador dirigido a fragmentos de 250 pb
   1. Vórtice la solución de perla magnética (consulte la Tabla de materiales)y colóquela a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.
   2. Agregue 0.3x de cuentas a 96.5 μL de la mezcla de ADN ligado y mezcle pipeteando a fondo. Incubar la mezcla de perlas durante 5 min.
      NOTA: La presencia de sales y polietilenglicol en la mezcla de perlas facilita la precipitación de fragmentos de ADN en las perlas. Una baja proporción de perlas a moléculas de ADN conduce a la unión de solo fragmentos de ADN más grandes a las cuentas. En este caso, los fragmentos de ADN por encima de 250 pb de longitud están unidos a las perlas.
   3. Coloque los tubos en un soporte magnético para tirar de las cuentas y eliminar fragmentos de ADN de tamaño no deseado. Deje que las perlas se asienten durante 5 minutos y luego transfiera el sobrenadante transparente a un nuevo tubo de microfuge (mantenga el sobrenadante).
   4. Agregue 0.15x de cuentas frescas al sobrenadante y mezcle pipeteando bien. Incubar la mezcla de perlas durante 5 minutos y luego colocar los tubos en un soporte magnético para tirar hacia abajo de las perlas unidas al ADN objetivo. Espere 5 minutos y luego deseche el sobrenadante (mantenga las cuentas).
      NOTA: Esta proporción de cuentas a ADN conduce a la unión de fragmentos del tamaño deseado de 250 pb.
   5. Con las perlas en el soporte magnético, agregue 200 μL de etanol al 80% (recién preparado) y espere 30 s. Pipetee y deseche el lavado de etanol con cuidado sin molestar las cuentas en el soporte magnético. Repita este paso.
   6. Después del último lavado, retire los rastros de etanol de las perlas y luego seque al aire las perlas durante 2 minutos hasta que aparezcan brillantes pero no completamente secas. No seque en exceso las cuentas.
   7. Retire los tubos del soporte magnético y agregue 17 μL de 10 mM Tris-HCl o 0.1x TE (Low-TE). Mezclar mediante pipeteo ~ 10 veces e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 min.
   8. Vuelva a colocar los tubos en el soporte magnético y espere 5 minutos. Una vez que las cuentas se hayan asentado, transfiera el sobrenadante de ADN a un nuevo tubo.
7. PCR I para añadir una etiqueta de biotina a los fragmentos de ADN que contienen el casete de inserción
   1. Añadir una etiqueta de imprimación biotinilada a los fragmentos de ADN que contienen el cassette de inserción de Tn5 utilizando la imprimación biotinilada específica del transposón (Tabla 5) y una imprimación de índice. Preparar la mezcla maestra de PCR según la Tabla 6 y seguir las condiciones de PCR para el termociclador enumeradas en la Tabla 7.
8. Limpieza de PCR I sin selección de tamaño
   1. Vórtice 0.9x perlas y colóquelas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de la limpieza.
   2. Agregue 0.9x perlas a los productos de PCR y mezcle bien.
   3. Coloque las cuentas en un soporte magnético para tirar de las cuentas.
   4. Retire el sobrenadante transparente y lave el ADN unido a la perla con 200 μL de etanol 80% recién preparado dos veces.
   5. Retire el etanol después de los pasos de lavado y seque al aire las perlas hasta que se vean brillantes pero no demasiado secas.
   6. Añadir 32 μL de 10 mM Tris-HCl o 0.1X TE (Low-TE) e incubar las perlas durante 5 min. Coloque la mezcla de nuevo en el soporte magnético y transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuge fresco.
9. Unión de fragmentos de ADN biotinilado a perlas de estreptavidina
   1. Resuspend 32 μL de perlas de estreptavidina en 1x tampón de unión y lavado. Lave las cuentas con el tampón tres veces mientras se colocan en un soporte magnético.
   2. Agregue 32 μL de tampón 2x Bind-and-wash y vuelva a colocar las perlas. A esto, agregue 32 μL de los productos PCR 1 limpiados. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Coloque la mezcla de perlas y ADN en un soporte magnético durante 2 minutos. Pipetee el sobrenadante ya que el ADN marcado con biotina que contiene el borde de inserción se une a la estreptavidina en las perlas.
   4. Lave las perlas con 500 μL de tampón de unión y lavado 1x y luego lave las cuentas con 200 μL de Low-TE. Resuspend las perlas unidas al ADN en 17 μL de TE baja.
10. PCR II para añadir adaptadores a los fragmentos que contienen el borde del cassette de inserción
    1. Prepare una mezcla maestra, como se muestra en la Tabla 8,utilizando los cebadores de índice y los cebadores de PCR universal modificados enumerados en la Tabla 5. Agregue 15 μL de las perlas de estreptavidina unidas al ADN del paso anterior a la mezcla de PCR. Consulte la Tabla 7 para conocer las condiciones del termociclador.
11. Limpie los productos de PCR sin selección de tamaño como se da en el paso 6.8 de este protocolo. Elute los productos finales de ADN en 30 μL de agua de grado molecular.
12. Almacene las muestras a -20 °C y utilícenlas para la secuenciación.

7. Secuenciación y análisis

1. Secuenciar la biblioteca utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Ajuste la profundidad de secuenciación en función del tamaño de la biblioteca de transposones, como se indica a continuación. Evalúe la calidad de lectura con FastQC⁷. Seleccione las lecturas que contienen la arista de inserción Tn5 en el extremo 5' de la lectura y elimine la secuencia de aristas de inserción mediante Cutadapt⁸ y/o Trimmomatic^9.
   NOTA: Aquí, se utilizó un enfoque de secuenciación de extremo pareado para apuntar a 150 pb por lectura y un total de 8 lecturas de Mio. Para obtener un conjunto de datos representativo, asegúrese de que el número total de lecturas secuenciadas supere el número máximo posible de mutantes en la biblioteca, es decir, el número total estimado de colonias a partir del paso 2.9. Como referencia, este protocolo apuntaba a 40 veces el tamaño máximo posible de la biblioteca. Otros estudios exitosos que utilizaron Tn-seq para un propósito similar secuenciaron un número total de lecturas cercanas a 25 veces el número real de inserciones únicas en la biblioteca mutante correspondiente^22,23.
2. Teniendo en cuenta que las mutaciones en los extremos de los genes no son funcionalmente disruptivas, recorte un 5% de ambos extremos de las anotaciones de genes del archivo GFF del genoma de referencia. Mapee las lecturas recortadas al genoma de referencia usando Bowtie2¹⁰.
3. Calcule el número de inserciones a partir del número de posiciones únicas de 5' en el archivo BAM de alineación.
4. Usando FeatureCounts¹¹, obtenga el número de genes hit para cada muestra replicada.
5. Usando el paquete DESeq2¹² en RStudio, calcule la diferencia en abundancias mutantes entre diferentes condiciones.

Las bacterias asociadas al huésped pueden emplear varios factores para establecer una asociación, incluidos los que median la adhesión, la motilidad, la quimiotaxis, las respuestas al estrés o los transportadores específicos. Si bien se han reportado factores importantes para las interacciones patógeno-huésped para varias bacterias13,14,15,16,17,18,incluidos los miembros del género Burkholderia19,20,menos estudios han explorado los mecanismos moleculares utilizados por los simbiontes beneficiosos para la colonización21,22,23 . Utilizando la secuenciación de inserción de transposones, el objetivo fue identificar los factores moleculares que permiten a B. gladioli colonizar los escarabajos L. villosa.

La mutagénesis mediada por transposón se realizó utilizando el plásmido pRL27, que lleva un transposón Tn5 y un cassette de resistencia a la kanamicina flanqueado por sitios de repetición invertida. El plásmido se introdujo en las células diana B. gladioli Lv-StA por conjugación con el donante plásmido E. coli WM3064 cepa (como se muestra en la Figura 1). Después de la conjugación, la mezcla de conjugación que contenía células receptoras de B. gladiolos y donantes de E. coli se enchaparon en placas de agar selectivas que contenían kanamicina. La ausencia de DAP en las placas eliminó las células de E. coli del donante, y la presencia de kanamicina seleccionada para transconjugantes exitosos de B. gladioli Lv-StA. La biblioteca de mutantes B. gladioli Lv-StA agrupada obtenida de la cosecha de las 100,000 colonias transconjugantes se preparó para su secuenciación utilizando un kit de preparación de biblioteca de ADN modificado y cebadores personalizados. La Figura 2 destaca los pasos de preparación de la biblioteca de ADN. La secuenciación produjo 4 lecturas pareadas de Mio; 3.736 genes de 7.468 genes en B. gladioli Lv-StA fueron alterados.

Para identificar mutantes que eran defectuosos para la colonización en el huésped, la biblioteca de mutantes B. gladioli Lv-StA se infectó en los huevos de escarabajos y se cultivó in vitro en medio KB como control. El tamaño del cuello de botella de colonización in vivo se calculó antes del experimento. Un número conocido de células B. gladioli Lv-StA se infectó en huevos de escarabajo, y el número de células colonizadoras en las primeras larvas de instar recién eclosionadas se obtuvo mediante el recubrimiento de una suspensión de cada larva y el recuento de unidades formadoras de colonias por individuo. Estos cálculos se realizaron para garantizar que el número de células colonizadoras sea suficiente para evaluar todos o un alto porcentaje de los mutantes en la biblioteca por su capacidad para colonizar al huésped. Además, el tiempo de crecimiento entre las condiciones in vitro e in vivo se normalizó en función del número de generaciones bacterianas para hacer que estas muestras sean comparables.

Después de que los huevos eclosionaron, se recolectaron 1.296 larvas en 13 piscinas. Los cultivos mutantes in vitro correspondientes se cultivaron y almacenaron como reservas de glicerol. El ADN de las bibliotecas mutantes cultivadas in vivo e in vitro se extrajo y fragmentó en un ultrasonido. La Figura 3 muestra la distribución de tamaño del ADN cizallado, donde la mayoría de los fragmentos abarcan entre 100 y 400 pb, como se esperaba. Este paso fue seguido por el protocolo de preparación de la biblioteca de ADN modificado para la secuenciación. En cada paso del protocolo, se comprobó la concentración de ADN restante para garantizar que los pasos se realizaran correctamente y para rastrear las pérdidas de ADN. Un control de calidad (ver la Tabla de Materiales)antes de la secuenciación reveló que las bibliotecas de ADN contenían fragmentos de ADN inesperadamente grandes (>800 pb), y esto fue más pronunciado en las bibliotecas in vivo. Dada la dificultad de optimizar la agrupación de fragmentos en los carriles de secuenciación, fue necesario aumentar la profundidad de secuenciación a 10 Mio de lecturas pareadas en las bibliotecas in vivo para alcanzar el número deseado de lecturas. El análisis de los resultados de la secuenciación reveló que un promedio de 4 Mio lee en las bibliotecas in vivo y 3.1 Mio lee en las bibliotecas in vitro que contenían el borde del transposón en el extremo 5' de Read-1(Tabla 9),lo que fue satisfactorio para este experimento. La distribución de las 24.224 inserciones únicas a través del genoma de B. gladioli en la biblioteca original se muestra en la Figura 4. Un análisis realizado utilizando DESeq2 reveló que las abundancias de 271 mutantes eran significativamente diferentes entre las condiciones in vivo e in vitro.

Figura 3: Geles de agarosa de un mutante y bibliotecas de ADN. (A) Gel de agarosa con ADN inaudito de un mutante en el carril x y una escalera de 1 kbp para la escala. (B) Gel con biblioteca de ADN esquilado. Los tamaños de banda de la escalera en el primer carril se indican en el lado izquierdo. Los tres primeros carriles a, b y c contienen fragmentos de ADN esquilados de las bibliotecas in vivo. Los carriles d, e, f y g contienen fragmentos de ADN cizallados de las bibliotecas in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4:Ubicación de sitios de inserción únicos en la biblioteca original a través de los cuatro replicones en el genoma de Burkholderia gladioli Lv-StA. Cada barra a lo largo del eje x se encuentra en un sitio de inserción. La altura de una barra a lo largo del eje Y corresponde al número de lecturas asociadas con ese sitio. Tenga en cuenta que los dos cromosomas y dos plásmidos se muestran en longitud completa y, por lo tanto, tienen diferentes escalas en el eje x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Componentes de medios.

Tabla 2: Imprimaciones para confirmar el éxito de la conjugación.

Tabla 3: Mezcla maestra de PCR para confirmar el éxito de la conjugación. Abreviaturas: HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento; dNTPs = trifosfato de desoxinucleósido.

Tabla 4: Condiciones de PCR para confirmar el éxito de la conjugación.

Tabla 5: Cebadores y adaptador para PCR I y II durante la preparación de la biblioteca de ADN.

Tabla 6: Preparación de la biblioteca de ADN-MEZCLA MAESTRA DE PCR I.

Tabla 7: Preparación de la biblioteca de ADN-condiciones de PCR I y II.

Tabla 8: Preparación de la biblioteca de ADN-Mezcla maestra de PCR II.

Tabla 9: Resumen de la salida de secuenciación y la frecuencia de inserción de transposones por biblioteca. Abreviatura: PE = pareado- final.

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses relacionado con el estudio.