Artículo de método

Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa de vesículas extracelulares en tres dimensiones

DOI:

10.3791/62845

⸱

26 de agosto de 2021

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

En este artículo

Resumen

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La microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) se utiliza para eludir el límite de difracción típico de la microscopía de luz y para ver los exosomas a escala nanométrica. Se puede emplear tanto en dos como en tres dimensiones para caracterizar exosomas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las vesículas extracelulares (EV) son liberadas por todos los tipos de células y desempeñan un papel importante en la señalización celular y la homeostasis. La visualización de los vehículos eléctricos a menudo requiere métodos indirectos debido a su pequeño diámetro (40-250 nm), que está por debajo del límite de difracción de la microscopía de luz típica. Hemos desarrollado una visualización basada en microscopía de superresolución de vehículos eléctricos para evitar el límite de difracción en dos y tres dimensiones. Usando este enfoque, podemos resolver la forma tridimensional de los evs a una resolución de +/- 20 nm en el eje XY y una resolución de +/- 50 nm a lo largo del eje Z. En conclusión, proponemos que la microscopía de superresolución se considere como un método de caracterización de los EV, incluidos los exosomas, así como los virus envueltos.

Introducción

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Las vesículas extracelulares (EV) son vesículas unidas a la membrana liberadas por todos los tipos de células. Contienen lípidos, proteínas, metabolitos y ácidos nucleicos y transfieren estos materiales localmente entre las células y distalmente entre los tejidos y órganos. Hay tres subtipos principales de EV: cuerpos apoptóticos, microvesículas y exosomas1,2. Aquí, centramos nuestra discusión en los exosomas y sus proteínas asociadas.

Los exosomas son vesículas secretadas que se originan en la brotación interna de los endosomas tempranos en el cuerpo multivesicular (MVB). El MVB luego se fusiona con la membrana plasmática, liberando los exosomas en el espacio extracelular para viajar a otras células3,4. Los exosomas existen en un espectro de tamaños que van de 40 a 150 nm y están enriquecidos con proteínas transmembrana endosómicas conocidas como tetraspaninas (CD9, CD63, CD81), complejo de clasificación endosomal unido a la membrana requerido para el transporte (ESCRT) y proteínas asociadas a balsas lipídicas1,2,5,6,7.

La caracterización de la composición bioquímica de los exosomas se ha convertido en un campo popular para que los investigadores comprendan mejor su naturaleza funcional. Existen muchos métodos para visualizar y caracterizar exosomas, incluida la citometría de flujo a nanoescala, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), la microscopía electrónica de barrido y transmisión (TEM), la resonancia de plasmón de superficie, la detección de pulsos resistivos y la microscopía de luz tradicional, cada una de las cuales contiene pros y contras intrínsecos8,9. TEM y cryo-EM pueden lograr una resolución basada en nanómetros, pero a menudo requieren pasos de deshidratación y congelación-fractura, lo que reduce o lisa los EV10,11. NTA se basa en la dispersión de la luz, lo que permite la caracterización de cientos de EV a la vez, pero es una medida indirecta del tamaño de partícula y no puede distinguir fácilmente entre EV, virus y agregados de proteínas12,13,14,15,16. La citometría de flujo a nanoescala emplea la dispersión de la luz desde una ruta de excitación, que luego se puede traducir en mediciones de tamaño, pero es una tecnología emergente, y hay poco consenso sobre qué tamaño de partículas están dentro del rango lineal de detección para varios instrumentos12,17,18.

La microscopía de luz tradicional que utiliza proteínas fluorescentes o colorantes ha sido una de las técnicas más empleadas para visualizar compartimentos subcelulares, complejos de proteínas y maquinaria de señalización dentro de una célula. Si bien esta técnica resulta útil para visualizar la localización de complejos, el límite de difracción de la microscopía de luz tradicional (alrededor de 250-400 nm) impide la resolución clara de proteínas o estructuras en el rango de tamaño típico de un exosoma (40-150 nm)12,19,20.

La microscopía de superresolución, es decir, la microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM), se distingue de la microscopía de luz convencional al emplear las propiedades fotoconmutables de fluoróforos específicos y detectar estos eventos parpadeantes para reconstruir imágenes con una precisión nanométrica21. Los eventos de photoswitching se recopilan utilizando una cámara de detección de alta velocidad de fotogramas en el transcurso de decenas de miles de exposiciones individuales, y se utiliza una función de dispersión de puntos para mapear con alta confianza la ubicación exacta del fluoróforo fotoconmutante19,20,22. Esto permite a dSTORM eludir el límite de difracción de la microscopía de luz. Varios grupos han reportado el uso de técnicas de superresolución para visualizar y rastrear exosomas y sus proteínas asociadas22,23,24,25. La resolución final depende de las propiedades biofísicas del fluoróforo, pero a menudo oscila entre +/-10-100 nm a lo largo del eje XY, lo que permite una resolución de una sola molécula.

La capacidad de resolver fluoróforos individuales a esta escala en el eje XY ha revolucionado la microscopía. Sin embargo, hay pocos datos sobre el dSTORM tridimensional (3-D) de un exosoma. Por lo tanto, buscamos establecer un procedimiento operativo estándar (SOP) para la visualización y caracterización basada en dSTORM de EV purificados, incluidos los exosomas con precisión nanométrica en 3-D.

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Protocolo

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1 Propagación y mantenimiento de líneas celulares

  1. Adquirir células de osteosarcoma humano (U2OS) y colocar las células en el medio de crecimiento suplementado con suero bovino fetal libre de exosomas al 10% y 1 solución de penicilina/ estreptomicina.
    NOTA: Se generó suero fetal bovino libre de exosomas siguiendo el protocolo presentado en McNamara et. al.26.
  2. Mantener las células U2OS en una incubadora recubierta de cobre a 37 °C enco2 al 5% y las celdas de paso en matraces T17526,27. Las células deben mantenerse en la fase de crecimiento logarítmico medio para evitar que surjan subpoblaciones, o de la acumulación de restos apoptóticos durante la fase estacionaria.

2 Aislamiento y purificación de exosomas

  1. Haga crecer las líneas celulares U2OS hasta la confluencia total en 10 matraces T175 separados con 50 ml de medios por matraz. Retire el sobrenadante celular y páselo sucesivamente a través de un aparato de filtración al vacío de 0,45 μm y 0,22 μm.
  2. Someter el sobrenadante a filtración de flujo cruzado (también conocida como filtración de flujo tangencial) en un sistema de filtración equipado con el cartucho de fibra hueca de 750 kDa para eliminar proteínas o metabolitos más pequeños28.
    1. Pase el sobrenadante a través del operador de filtración de flujo tangencial a una presión de avance constante de 30 psi, mientras mantiene una presión de retención de <20 psi para producir una presión Δ de 10 o más psi. Coloque una barra de agitación magnética en el tanque de retención y ajuste a 150 rpm26.
    2. Mantenga la velocidad de alimentación a 40 ml/min o más. Recoger el permeado en un depósito y desecharlo.
  3. Concentre el sobrenadante a 30 ml y luego equilibre con cuatro volúmenes de 1x PBS. Recoger la solución filtrada y equilibrada de flujo cruzado en un tubo cónico de 50 ml.
  4. Precipitar los EV a 4 °C durante la noche en una concentración final de 40 mg/ml de polietilenglicol con un peso molecular de 8.000 Da. Centrifugar los EV a 1.200 x g a 4 °C durante 1 h y resuspendir en 500 μL de 1x PBS.
  5. Incubar los EV con 50 μg/mL de colorante intercalante de membrana roja fotoconmutable y 50 μg/mL de RNasa A en 1x PBS a 4 °C durante 1 h.
  6. Elimine el exceso de colorante a través de una columna en un sistema de purificación de proteínas conectado a un colector de fracciones. Identifique las fracciones EV a través de la absorbancia UV y agréguelas en un tubo demicrocentrífuga 26.
  7. Affinity-seleccione un total de 200 μL de EV utilizando perlas magnéticas anti-CD81 equilibradas en 1x PBS.
    1. Diluya 100 μL de las perlas magnéticas anti-CD81 en 1x PBS a un volumen total de 1 mL y deje que se unan a 4 °C durante 2 h en un tubo de microcentrífuga de 2 mL con balanceo continuo.
  8. Lave las perlas anti-CD81 y EV tres veces con 1x PBS. Elute CD81+ EV de la solución con 100 mM de glicina a pH 2.0 durante 30 min a 37 °C.
  9. Pipetear el CD81+ EV purificado en un volumen igual de 100 mM Tris-HCl a pH 7.5 en 1x PBS.
    NOTA: Se puede reservar una alícuota de solución purificada de CD81+ EV para el análisis de seguimiento de nanopartículas o microscopía electrónica con el fin de confirmar la pureza de la solución y la presencia de EV26.

3 Fijación y preparación

  1. Coloque los EV purificados por afinidad en placas de 8 pocillos con fondo de vidrio μ deslizantes en un volumen total de 200 μL (puede diluir la muestra EV en 100 mM Tris-HCl a pH 7.5 en 1x PBS) y deje que se adhiera a la superficie durante la noche a 4 ° C.
  2. Sin quitar la solución existente de la placa de 8 pocillos, fije los EV en las placas agregando 200 μL de paraformaldehído al 4% en 1x PBS a la solución que contiene EV en cada pozo y deje incubar durante 30 min a temperatura ambiente21.
  3. Retire cuidadosamente el paraformaldehído y el exceso de solución con una micropipeta para no molestar a los EV. Lave el EV con 1x PBS para eliminar el exceso de paraformaldehído. Realice el procedimiento de lavado tres veces. Retire el exceso de 1x PBS.
  4. Preparar 250 μL de solución tampón dSTORM B-cubed por muestra creando una solución de protocatechuato dioxigenasa de 5 mM (Parte A) diluida en tampón de imagen (Parte B) según el protocolo del fabricante.
    NOTA: La concentración de la enzima en el tampón puede duplicarse a 10 mM si se produce el fotoblanqueo.
    1. Agregue 250 μL del tampón preparado a cada pocillo según el protocolo del fabricante durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de obtener imágenes para eliminar las moléculas oxidantes.
      NOTA: El EV se puede ver inmediatamente o almacenar a 4 ° C durante un máximo de una semana. Reemplace el búfer que sigue al almacenamiento antes de cada visualización.

4 Calibración de microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa

  1. Prepare las perlas requeridas para la calibración del microscopio de superresolución diluyendo microesferas de 100 nm a una concentración de 0.5% en agua de grado de biología molecular y pipeteando 200 μL en cada pozo de una placa de 8 pocillos con fondo de vidrio μ deslizante.
    1. Deje que las cuentas se asienten en los pozos durante 1 h a temperatura ambiente.
  2. Sin quitar la solución existente, agregue 200 μL de paraformaldehído al 4% en PBS a cada pozo a la solución de perla de calibración y deje incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  3. Retire cuidadosamente el paraformaldehído con una micropipeta para no molestar las cuentas y lave las perlas tres veces con 1x PBS. Prepare el búfer de acuerdo con el paso 3.4.
  4. Retire 1x PBS y agregue 250 μL del tampón preparado a cada pozo. Deje que el búfer permanezca durante 20 minutos antes de la visualización.
  5. Antes de colocar cualquier cosa en el escenario, conéctese al microscopio 3D con el botón Conectar el microscopio. Agregue aceite 100x al objetivo y coloque el centro del pozo encima del objetivo. En la configuración Adquirir, encienda los láseres de excitación de 473 y 640 nm y haga clic en Ver.
    1. Sin la lente 3D activada, vea las cuentas bajo la configuración de saturación de fotones haciendo clic en Conteos de fotones en las opciones de Visualización de imágenes. Establezca las potencias iniciales del láser en 8,4 mW para el láser de 473 nm y en 11,6 mW para el láser de 640 nm.
    2. Disminuya el enfoque del láser a alrededor de -300 nm o el plano focal de las perlas de calibración para producir una resolución clara de las cuentas individuales. Una vez que el plano Z está enfocado, ajuste aún más los niveles de potencia del láser para tener en cuenta la variación en cada campo de visión.
  6. Bajo las funciones del instrumento, complete la calibración de mapeo 3D y la calibración de mapeo de canales para obtener los errores en los ejes X, Y y Z. Establezca el número máximo de FOV en 20, el número objetivo de puntos en 4.000, la distancia máxima entre canales en 5,0 píxeles y el radio de exclusión entre canales en 10,0 píxeles durante la calibración de mapeo de canales.
  7. Asegúrese de que la calibración produzca una cobertura puntual de >90% y una calidad de mapeo que sea buena. Guarde los datos de calibración dados para futuras adquisiciones de imágenes.

5 Visualización del EV en tres dimensiones

  1. Agregue aceite 100x sobre el objetivo y coloque los EV preparados en el microscopio. Sin la lente 3D activada, encienda el láser de excitación de 640 nm e inicialmente elévelo a entre 1,2 mW y 12,5 mW dependiendo de la intensidad de la señal y el campo de visión para excitar los EV teñidos de tinte intercalante de membrana roja.
    1. En las opciones de visualización de imágenes, cambie el método de visualización de la saturación de fotones a los percentiles para visualizar mejor los vehículos eléctricos. Ajuste la potencia del láser para minimizar el ruido, al tiempo que maximiza la señal. Mantenga todos los demás parámetros.
    2. Ajuste el enfoque del plano Z haciendo clic en el icono arriba o abajo del eje Z.
      NOTA: El plano Z debe enfocarse entre -200 y -350 nm, pero variará según el campo de visión.
  2. Establezca el tiempo de exposición en 20 ms, la captura de fotogramas en 10.000 fotogramas y la potencia láser inicial entre 1,2 mW y 12,5 mW, o la potencia láser determinada en el paso 5,1, dependiendo de la intensidad de la señal y el campo de visión.
    1. Active la lente 3D usando el icono e inicie la adquisición haciendo clic en el botón Adquirir.
  3. A lo largo de la adquisición de imágenes, aumente la potencia del láser en 3 incrementos de 10 cada 1000 fotogramas, o lo suficiente como para mantener una alta relación señal-ruido. No ajuste el plano Z durante la adquisición.
    NOTA: El láser puede elevarse a un máximo de 90 mW de potencia láser.

6 Modificación posterior a la adquisición y rastreo de EV

  1. Después de la adquisición de la imagen, cambie a la ventana Analizar visualización. Realice la corrección de deriva en la imagen sin filtrar y, a continuación, active los filtros. Ajuste el recuento de fotones, la precisión de localización, los sigmas y el índice de fotogramas de acuerdo con la Tabla 1.
  2. Superponga una herramienta de vista de plano XYZ a lo largo del eje X de vehículos eléctricos individuales desde el campo de visión y exporte. Archivos CSV de eventos de photoswitching.
  3. Diviecte evs individuales en el eje XY en un campo de visión X por Y utilizando una herramienta de histograma de línea, que agrupa los eventos de fotointerruptor en grupos de distancia establecidos.
  4. Tome imágenes de vehículos eléctricos individuales y guárdelas como archivos .tiff.
  5. Cree videos en 3D de vehículos eléctricos individuales utilizando una herramienta de visualización 3D y coloree de acuerdo con la ubicación a lo largo del eje Z.

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Resultados

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El objetivo de este estudio fue evaluar la efectividad de la microscopía de superresolución en la visualización de EV individuales con resolución nanométrica en tres dimensiones (3-D). Para analizar la forma y el tamaño de los EV individuales, empleamos tinte fotoswitchable e incubamos los EV con un tinte intercalador de membrana de color rojo lejano, y eliminamos el exceso de tinte a través de la cromatografía29. Los vehículos eléctricos anti-CD81 y teñidos de rojo capturados por afinidad se vier...

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Discusión

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Los EV se han convertido en un área de estudio popular debido a su importante papel en muchos procesos intracelulares y señalización de célula a célula1,30. Sin embargo, su visualización resulta difícil ya que su pequeño tamaño cae por debajo del límite de difracción de la microscopía de luz. La microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) es un método directo de visualización que evita el límite de difracción capturando eventos de fotointerr...

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Divulgaciones

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M.G.C. no tiene conflictos de intereses que declarar. R.P.M y D.P.D. reciben apoyo material de Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. y Cytiva Inc. (anteriormente GE Healthcare). R.P.M. y D.P.D. declaran intereses contrapuestos para la posible comercialización de parte de la información presentada. Estos son administrados por la Universidad de Carolina del Norte. Las fuentes de financiación no participaron en las interpretaciones o la redacción de este manuscrito.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer a Oxford Nanoimaging por sus comentarios constructivos y orientación. Este trabajo fue financiado por el 5UM1CA121947-10 a R.P.M. y el 1R01DA040394 a D.P.D.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
15 µ-Corredera 8 placas de pocillosIbidi80827
1X PBSGibco14190-144
1X Penicilina Solución de estreptomicinaGibco15140-122
50 mL tubo cónicoThermo Fisher 339652
500 mL 0,22 µ m aparato de filtración al vacíoGenesee25-227
750 kDa filtro de corte de cartucho de fibra huecaCytiva29-0142-95
AKTA Flux SCytiva29-0384-37
AKTA StartCytiva29022094-ECOMINSSW
Perlas magnéticas Anti-CD81Thermo Fisher10616D
B-cubedbuffer ONI 
CellMask RojoThermo FisherC10046
Dubelco's Modified Eagle MediumThermo Fisher10566016
Suero Fetal BovinoVWR97068-085
Frac 30 Colector de fraccionesCytiva29022094-ECOMINSSW
Glicina pH=2.0Thermo FisherBP381-5
HiTrap CaptoCore 700 ColumnaCytiva17548151
Grado de Biología Molecular Corning9820003
NanoimagerOxford Nanoimaging
personalizado Ciencias de la Microscopía Electrónica15710
PolietilenglicolThermo FisherBP233-1
RNasa APromegaA797C
T175 FrascosGenesee25-211
Microesferas TetraspekInvitrogenT7279
Tris- HCl pH=7.5Thermo FisherBP153-1
Unicornio VCytiva29022094-ECOMINSSW
BCA0017 Paraformaldehhyde

Referencias

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