La microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) se utiliza para eludir el límite de difracción típico de la microscopía de luz y para ver los exosomas a escala nanométrica. Se puede emplear tanto en dos como en tres dimensiones para caracterizar exosomas.
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Artículo de método
Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa de vesículas extracelulares en tres dimensiones
En este artículo
Resumen
Resumen
Las vesículas extracelulares (EV) son liberadas por todos los tipos de células y desempeñan un papel importante en la señalización celular y la homeostasis. La visualización de los vehículos eléctricos a menudo requiere métodos indirectos debido a su pequeño diámetro (40-250 nm), que está por debajo del límite de difracción de la microscopía de luz típica. Hemos desarrollado una visualización basada en microscopía de superresolución de vehículos eléctricos para evitar el límite de difracción en dos y tres dimensiones. Usando este enfoque, podemos resolver la forma tridimensional de los evs a una resolución de +/- 20 nm en el eje XY y una resolución de +/- 50 nm a lo largo del eje Z. En conclusión, proponemos que la microscopía de superresolución se considere como un método de caracterización de los EV, incluidos los exosomas, así como los virus envueltos.
Introducción
Las vesículas extracelulares (EV) son vesículas unidas a la membrana liberadas por todos los tipos de células. Contienen lípidos, proteínas, metabolitos y ácidos nucleicos y transfieren estos materiales localmente entre las células y distalmente entre los tejidos y órganos. Hay tres subtipos principales de EV: cuerpos apoptóticos, microvesículas y exosomas1,2. Aquí, centramos nuestra discusión en los exosomas y sus proteínas asociadas.
Los exosomas son vesículas secretadas que se originan en la brotación interna de los endosomas tempranos en el cuerpo multivesicular (MVB). El MVB lu....
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Protocolo
1 Propagación y mantenimiento de líneas celulares
- Adquirir células de osteosarcoma humano (U2OS) y colocar las células en el medio de crecimiento suplementado con suero bovino fetal libre de exosomas al 10% y 1 solución de penicilina/ estreptomicina.
NOTA: Se generó suero fetal bovino libre de exosomas siguiendo el protocolo presentado en McNamara et. al.26. - Mantener las células U2OS en una incubadora recubierta de cobre a 37 °C enco2 al 5% y las celdas de paso en matraces T17526,27. Las células deben mantenerse en la fase de crecimiento logarítmico med....
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Resultados
El objetivo de este estudio fue evaluar la efectividad de la microscopía de superresolución en la visualización de EV individuales con resolución nanométrica en tres dimensiones (3-D). Para analizar la forma y el tamaño de los EV individuales, empleamos tinte fotoswitchable e incubamos los EV con un tinte intercalador de membrana de color rojo lejano, y eliminamos el exceso de tinte a través de la cromatografía29. Los vehículos eléctricos anti-CD81 y teñidos de rojo capturados por afinidad se vier.......
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Discusión
Los EV se han convertido en un área de estudio popular debido a su importante papel en muchos procesos intracelulares y señalización de célula a célula1,30. Sin embargo, su visualización resulta difícil ya que su pequeño tamaño cae por debajo del límite de difracción de la microscopía de luz. La microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) es un método directo de visualización que evita el límite de difracción capturando eventos de fotointerr.......
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Divulgaciones
M.G.C. no tiene conflictos de intereses que declarar. R.P.M y D.P.D. reciben apoyo material de Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. y Cytiva Inc. (anteriormente GE Healthcare). R.P.M. y D.P.D. declaran intereses contrapuestos para la posible comercialización de parte de la información presentada. Estos son administrados por la Universidad de Carolina del Norte. Las fuentes de financiación no participaron en las interpretaciones o la redacción de este manuscrito.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Oxford Nanoimaging por sus comentarios constructivos y orientación. Este trabajo fue financiado por el 5UM1CA121947-10 a R.P.M. y el 1R01DA040394 a D.P.D.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 15 µ-Corredera 8 placas de pocillos | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicilina Solución de estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL tubo cónico | Thermo Fisher 339652 | ||
| 500 mL 0,22 µ m aparato de filtración al vacío | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa filtro de corte de cartucho de fibra hueca | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Perlas magnéticas Anti-CD81 | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed | buffer ONI | ||
| CellMask Rojo | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Suero Fetal Bovino | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Colector de fracciones | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glicina pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Columna | Cytiva | 17548151 | |
| Grado de Biología Molecular Corning | 9820003 | ||
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | ||
| personalizado Ciencias de la Microscopía Electrónica | 15710 | ||
| Polietilenglicol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNasa A | Promega | A797C | |
| T175 Frascos | Genesee | 25-211 | |
| Microesferas Tetraspek | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicornio V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
Referencias
- Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <....
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Reimpresiones y permisos
