Preparación de microcápsulas multifuncionales a base de seda cargadas con plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de ARN

Resumen

El protocolo describe la formación de microcápsulas robustas y biocompatibles cargadas de ADN como biosensores in vitro multiplexados capaces de rastrear varios ligandos.

Resumen

Introducimos un protocolo para la preparación de microcápsulas de fibroína de seda cargadas de ADN a través del método de ensamblaje capa por capa (LbL) en núcleos esféricos de sacrificio. Después de la adsorción de una capa primaria y plásmidos de ADN, la formación de microcápsulas robustas se facilitó mediante la inducción de hojas de β en la estructura secundaria de seda durante la deshidratación aguda de una sola capa de seda. Por lo tanto, la estratificación se produjo a través de múltiples enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Tras la adsorción de conchas multicapa, las estructuras núcleo-cáscara se pueden funcionalizar aún más con nanopartículas de oro (AuNP) y / o anticuerpos (IgG) para ser utilizados para la teledetección y / o la entrega dirigida. El ajuste de varios parámetros clave durante la deposición secuencial de macromoléculas clave en núcleos de sílice, como la presencia de un cebador de polímero, la concentración de ADN y proteína de seda, así como una serie de capas adsorbidas, dio como resultado microcápsulas biocompatibles y cargadas de ADN con permeabilidad variable y cargas de ADN. Tras la disolución de los núcleos de sílice, el protocolo demostró la formación de microcápsulas huecas y robustas con plásmidos de ADN inmovilizados a la superficie interna de la membrana de la cápsula. La creación de una membrana biocompatible selectivamente permeable entre los plásmidos de ADN y el entorno externo preservó el ADN durante el almacenamiento a largo plazo y desempeñó un papel importante en la respuesta de salida mejorada de plásmidos confinados espacialmente. La actividad de las plantillas de ADN y su accesibilidad se probaron durante la transcripción in vitro y las reacciones de traducción (sistemas libres de células). Los plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de iluminación de ARN se activaron con éxito con los analitos correspondientes, como se visualizó durante la localización de transcripciones de ARN marcadas con fluorescencia o proteína GFPa1 en las membranas de la cáscara.

Introducción

El campo de la biología sintética ofrece oportunidades únicas para desarrollar capacidades de detección mediante la explotación de mecanismos naturales evolucionados por microorganismos para monitorear su entorno y amenazas potenciales. Es importante destacar que estos mecanismos de detección suelen estar vinculados a una respuesta que protege a estos microorganismos de la exposición dañina, regulando la expresión génica para mitigar los efectos negativos o prevenir la ingesta de materiales tóxicos. Ha habido esfuerzos significativos para diseñar estos microorganismos para crear sensores de células completas aprovechando estas respuestas naturales, pero redirigiéndola....

Protocolo

1. Construcción del vector plásmido.

1. Construir un vector plásmido (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) mediante la amplificación de la secuencia codificante de un riboswitch de teofilina (ThyRS) acoplado con GFPa1 a partir del vector pJ201:23976-RS-GFPa1 (diseñado y creado por DNA2.0) y la inserción en el vector de expresión de E. coli , pSAL¹³. Utilice cebadores hacia adelante (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') e inverso (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') para amplificar la secuencia codificante de ThyRS acoplado con GFPa1 y realizar una reacción de PCR en volumen de 50 μL utilizando ADN polimerasa de acuerdo con el protocolo del....

Resultados

Aquí, el estudio aborda la funcionalidad de las plantillas de ADN que codifican diferentes diseños de sensores (dos tipos de elementos de transcripción / traducción regulados por ARN) después de la encapsulación en cápsulas de proteína de seda. Las microcápsulas se prepararon mediante el ensamblaje capa por capa (LbL) de los componentes clave: una capa principal, plásmidos de ADN que codifican diseños de sensores y biopolímero de fibroína de seda (Figura 2). La deposición de macromoléculas e.......

Discusión

Las microcápsulas de hidrogel selectivamente permeables cargadas con varios tipos de diseños de sensores codificados por ADN se pueden preparar siguiendo este protocolo. Una de las características distintivas del enfoque LbL es la capacidad de adaptar la complejidad de las microcápsulas durante el ensamblaje ascendente, que generalmente comienza con la adsorción de especies moleculares en plantillas de sacrificio. Ajustando cuidadosamente las concentraciones de los componentes iniciales, las condiciones de pH y el número.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno)-2-metil-1-(2,2,2-trifluoroetil)-1H-imidazol-5(4 H)-ona (DFHBI-1T)	Lucerna	DFHBI-1T
5x T4 T4 Tampón de ADN ligasa	ThermoFisher Scientific	46300-018
6x Tinte de carga de gel azul	New England BioLabs	B7021S
, negro circular	Corning	3601
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539	BioReactivo, para biología molecular, baja EEO
Sal sódica de ampicilina	Sigma-Aldrich	A0166	en polvo o cristales, BioReactivo, adecuado para cultivo celular
Enzimas de restricción de BlpI	New England BioLabs	R0585S
Corning Sistemas de almacenamiento/filtro de vacío desechables	FisherScientific	09-761-1
Dimetilsulfóxido, DMSO	Sigma-Aldrich	472301	reactivo ACS, ≥ 99.9%
Plásmido de ADN, pET28c-F30-2x Brócoli (5.4 kb), BrocApt.		Plásmido Addgene #66788
DyLightTM550 Kit de etiquetado de anticuerpos (Invitrogen)	ThermoFisher Scientific	84530
Sistema de extracto de E. coli S30 para ADN circular	Promega	L1020
Falcon, 15 mL	FisherScientific	14-959-53A
Tubos de centrífuga cónicos Falcon, 50 mL		14-432-22
Tubos de microcentrífuga Fisherbrand, 1,5 mL	FisherScientific	05-408-129
Ácido fluorhídrico, HF	Sigma-Aldrich	695068	reactivo ACS, 48 %
Sulfato de kanamicina	Sigma-Aldrich	60615	mezcla de Kanamicina A (componente principal) y Kanamicina B y C
Enzimas de restricción KpnI	Nueva Inglaterra BioLabs	R0142S
Placa de agar LB suplementada con 100 µ g/mL de ampicilina	Sigma-Aldrich	L5667	placas de agar prevertidas con 100 µ g/mL de ampicilina
LB placa de agar suplementada con 50 µ g/mL de kanamicina	Sigma-Aldrich	L0543	placas de agar prevertidas con 50 µ g/mL de caldo de kanamicina
LB (grado Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
Bromuro de litio, LiBr	Sigma-Aldrich	213225	ReagentPlus, ≥ 99%
Eficiencia máxima DH5-α cepa de E. coli competente	ThermoFisher Scientific	18258012
Metanol	MilliporeSigma	322415	anhidro, 99,8%
MilliQ-water	EMD MilliPore		Milli-Q Sistema de purificación de agua de referencia
MinElute PCR Kit de purificación	Qiagen	28004
Clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropilo)-N′-etilcarbodiimida, EDC	Sigma-Aldrich	E1769
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	ThermoFisher Scientific	10010023	1x PBS, pH 7.4
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	New England Biolabs	M0530S
Polietilenimina,	Sigma-Aldrich	408727	Mw promedio ~ 25,000
Kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress	New England BioLabs	E6800S
QIAEX II Kit de extracción de gel	Qiagen	20021
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
Escalera de ADN de 2 registros de carga rápida (0.1-10.0 kb)	New England BioLabs	N0469S
SiO? microesferas de sílice, 4.0 y micro; m	Policiencias, Inc.	24331-15	Solución acuosa al 10%
Casetes de diálisis Slide-A-Lyzer G2, 3.5K MWCO, 15 mL	ThermoFisher Scientific	87724
Carbonato de sodio, Na?CO?	Sigma-Aldrich	222321	reactivo ACS, anhidro, ≥ 99,5%, polvo
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dispositivos de diálisis	FisherScientific	08-607-008	Spectrum G235058
SYBR Tinción de gel de ADN segura	ThermoFisher Scientific	S33102
T4 ADN ligasa (5 U/µ L)	ThermoFisher Scientific	EL0011
Teofilina	Sigma-Aldrich	T1633	anhidro, ≥ 99%,
tampón de acetato de tris-EDTA en polvo (tampón TAE)	Sigma-Aldrich	T6025	Contiene 40 mM de tris-acetato y 1 mM de EDTA, pH 8,3.
Agua destilada ultrapura sin DNasa/RNasa	FisherScientific	10-977-023
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit	ZymoResearch	D4202

Placas de 96 pocillos Tubos de centrífuga cónicos ramificada