Preparación de microcápsulas multifuncionales a base de seda cargadas con plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de ARN

Resumen

El protocolo describe la formación de microcápsulas robustas y biocompatibles cargadas de ADN como biosensores in vitro multiplexados capaces de rastrear varios ligandos.

Resumen

Introducimos un protocolo para la preparación de microcápsulas de fibroína de seda cargadas de ADN a través del método de ensamblaje capa por capa (LbL) en núcleos esféricos de sacrificio. Después de la adsorción de una capa primaria y plásmidos de ADN, la formación de microcápsulas robustas se facilitó mediante la inducción de hojas de β en la estructura secundaria de seda durante la deshidratación aguda de una sola capa de seda. Por lo tanto, la estratificación se produjo a través de múltiples enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Tras la adsorción de conchas multicapa, las estructuras núcleo-cáscara se pueden funcionalizar aún más con nanopartículas de oro (AuNP) y / o anticuerpos (IgG) para ser utilizados para la teledetección y / o la entrega dirigida. El ajuste de varios parámetros clave durante la deposición secuencial de macromoléculas clave en núcleos de sílice, como la presencia de un cebador de polímero, la concentración de ADN y proteína de seda, así como una serie de capas adsorbidas, dio como resultado microcápsulas biocompatibles y cargadas de ADN con permeabilidad variable y cargas de ADN. Tras la disolución de los núcleos de sílice, el protocolo demostró la formación de microcápsulas huecas y robustas con plásmidos de ADN inmovilizados a la superficie interna de la membrana de la cápsula. La creación de una membrana biocompatible selectivamente permeable entre los plásmidos de ADN y el entorno externo preservó el ADN durante el almacenamiento a largo plazo y desempeñó un papel importante en la respuesta de salida mejorada de plásmidos confinados espacialmente. La actividad de las plantillas de ADN y su accesibilidad se probaron durante la transcripción in vitro y las reacciones de traducción (sistemas libres de células). Los plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de iluminación de ARN se activaron con éxito con los analitos correspondientes, como se visualizó durante la localización de transcripciones de ARN marcadas con fluorescencia o proteína GFPa1 en las membranas de la cáscara.

Introducción

El campo de la biología sintética ofrece oportunidades únicas para desarrollar capacidades de detección mediante la explotación de mecanismos naturales evolucionados por microorganismos para monitorear su entorno y amenazas potenciales. Es importante destacar que estos mecanismos de detección suelen estar vinculados a una respuesta que protege a estos microorganismos de la exposición dañina, regulando la expresión génica para mitigar los efectos negativos o prevenir la ingesta de materiales tóxicos. Ha habido esfuerzos significativos para diseñar estos microorganismos para crear sensores de células completas aprovechando estas respuestas naturales, pero redirigiéndolas para reconocer nuevos objetivos y / o producir una señal medible que pueda medirse con fines de cuantificación (típicamente fluorescencia)^1,2. Actualmente, las preocupaciones con el uso de microorganismos genéticamente modificados (OGM), especialmente cuando se liberan en el medio ambiente o en el cuerpo humano, debido a la fuga de células enteras o parte de su material genético, incluso si están encapsulados en una matriz polimérica, sugieren que se necesitan formas alternativas de explotar estos enfoques de detección³.

Un enfoque poderoso para explotar los beneficios de la detección basada en microorganismos sin la preocupación por el despliegue de OMG es el uso de sistemas de transcripción/traducción in vitro (IVTT). Desde una perspectiva práctica, los sistemas IVTT consisten en una mezcla que contiene la mayoría de los componentes celulares en un estado activo que ha sido "extraído" de las células por diferentes medios, incluyendo sonicación, bala u otros⁴. El producto final de este proceso es una mezcla de reacción bioquímica ya optimizada para realizar la transcripción y traducción que se puede utilizar para probar diferentes sensores en un formato de "recipiente abierto", sin las restricciones asociadas con el uso de células enteras (difusión de membrana, eficiencia de transformación, toxicidad celular, etc.). Es importante destacar que se pueden agregar cuantitativamente diferentes componentes del sensor y estudiar su efecto mediante diferentes técnicas ópticas y espectrométricas, como hemos demostrado⁵. Se ha observado que el rendimiento de los sistemas IVTT puede ser inconsistente; Sin embargo, estudios recientes han mostrado enfoques para estandarizar su preparación y caracterización, lo cual es de gran ayuda al estudiar su desempeño en el diseño de sensores⁶. Recientemente, se han demostrado muchos ejemplos de sistemas IVTT utilizados para crear ensayos basados en papel a través de la liofilización de sus componentes en matrices de papel, incluida la detección de iones de metales pesados, medicamentos, elementos de detección de quórum y otros ^7,8,9. Un espacio de aplicación emocionante para los sensores basados en IVTT es su uso en aplicaciones de detección en diferentes tipos de entornos, incluidos el suelo, el agua y el cuerpo humano. Para implementar estos sistemas IVTT en estos entornos desafiantes, se debe implementar un enfoque de encapsulación para contener los componentes IVTT y protegerlos de la degradación.

Los enfoques de encapsulación más comunes para los sistemas IVTT incluyen el uso de cápsulas lipídicas, micelas, polimerosomas y otros microcontenedores estrechamente cerrados^10,11,12. Una desventaja de este enfoque es la necesidad de incorporar mecanismos pasivos o activos para transportar materiales dentro y fuera de los contenedores para permitir la comunicación con el entorno externo y proporcionar capacidades de detección. Para superar algunos de estos problemas, el estudio aquí informa un método que proporciona un enfoque simple pero efectivo para encapsular los materiales de codificación para diferentes diseños de sensores que se expresarán en sistemas IVTT. Este enfoque se basa en el uso de la deposición capa por capa (LbL) de un biopolímero en presencia de los plásmidos de interés para crear microcápsulas huecas con alta porosidad, lo que permite que el material genético protegido interactúe con los diferentes componentes del IVTT de elección. El estudio demostró que los plásmidos encapsulados podían dirigir la transcripción y la traducción cuando se activan dentro de esta matriz polimérica, como se muestra con la respuesta de un aptámero codificado por plásmidos y un riboswitch a sus objetivos correspondientes. Además, este recubrimiento LbL protege los plásmidos durante meses sin condiciones especiales de almacenamiento.

Protocolo

1. Construcción del vector plásmido.

1. Construir un vector plásmido (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) mediante la amplificación de la secuencia codificante de un riboswitch de teofilina (ThyRS) acoplado con GFPa1 a partir del vector pJ201:23976-RS-GFPa1 (diseñado y creado por DNA2.0) y la inserción en el vector de expresión de E. coli , pSAL¹³. Utilice cebadores hacia adelante (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') e inverso (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') para amplificar la secuencia codificante de ThyRS acoplado con GFPa1 y realizar una reacción de PCR en volumen de 50 μL utilizando ADN polimerasa de acuerdo con el protocolo del fabricante¹⁴.
2. Prepare un gel de agarosa al 1% a partir de 0,5 g de agarosa, 50 ml de tampón TAE (40 mM de acetato de Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) y 3 μL de tinción de ADN.
3. Mezclar 5 μL de alícuota del producto amplificado por PCR con 5 μL de agua libre de RNasa/DNasa y 2 μL de 6x colorante de carga de gel y analizar mediante electroforesis en gel de agarosa. Cargue una escalera de ADN (0.1-10.0 kb) como referencia. Pase el gel a 120 V hasta que la línea de tinte casi haya llegado al fondo del gel.
4. Visualice los fragmentos de ADN utilizando un sistema de imágenes de transiluminador UV para verificar el tamaño correcto del ADN¹⁵.
5. Purificar el producto de PCR utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante¹⁶.
6. Digerir el producto de PCR y el vector de expresión de pSAL con enzimas de restricción KpnI y BlpI en una reacción de 15 μL, que contenga 10 μL de producto de PCR o vector plásmido (concentración 20-50 ng/μL), 1,5 μL de tampón enzimático 10x, 1 μL de cada enzima y 1,5 μL de agua libre de RNasa/DNasa, a 37 °C durante 2 h.
7. Agregue 3 μL de colorante de carga de gel 6x a la mezcla de reacción y separe los fragmentos digeridos en un gel de agarosa al 1% como se describe en los pasos 1.3-1.5.
8. Purificar los fragmentos de ADN utilizando un kit de extracción en gel según el protocolo del fabricante¹⁶.
9. Ligue el producto de PCR digerido en un vector plásmido linealizado digerido, pSAL, utilizando ADN ligasa T4 y tampón ligasa suplementado en una reacción de 10 μL que contiene 3-20 fmol del vector digerido, 9-60 fmol del producto de PCR digerido, 2 μL de tampón ligasa, 1 μL (1 unidad) de ADN ligasa T4 y agua libre de DNasa/RNasa. Incubar la reacción de ligadura a 25 °C durante 3 h.
   NOTA: Asegúrese de que el contenido total de ADN en la mezcla de reacción sea de 0,01-0,1 μg.
10. Transformar E. coli DH5α células competentes con 10 ng de la mezcla de reacción de ligadura de acuerdo con el protocolo del fabricante¹⁷.
11. Cultivar las células transformadas a 37 °C durante la noche en placas de LB-agar suplementadas con ampicilina (100 μg/ml).
12. Recoger 3-4 colonias bacterianas de la placa y transferir asépticamente cada una de ellas a 5 ml de medios LB suplementados con ampicilina (100 μg/mL). Cultivar los cultivos durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora a 225 rpm.
13. Granular los cultivos nocturnos por centrifugación a 11 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
14. Utilice un kit de purificación para purificar los plásmidos de acuerdo con el protocolo del fabricante¹⁶.
15. Verificar las secuencias de los plásmidos purificados mediante secuenciación de ADN. El mapa plásmido y la secuencia del constructo resultante (pSALv-RS-GFPa1) se muestran en la Figura 1.

2. Purificación de ADN a gran escala.

1. Transformar el vector plásmido pSALv-RS-GFPa1 (3,4 kb) (codificando el riboswitch teofilina acoplado con el gen informador GFPa1) o pET28c-F30-2xBrócoli (5,4 kb) (codificando el aptámero de brócoli) en células competentes de E. coli DH5α según el protocolo del fabricante¹⁷.
2. Cultivar las células transformadas a 37 °C durante la noche en placas de LB-agar suplementadas con ampicilina (100 μg/ml) para células transformadas con pSALv-RS-GFPa1 o kanamicina (50 μg/ml) para células transformadas con brócoli pET28c-F30-2x.
3. Recoger 3-4 colonias bacterianas de la placa y transferir asépticamente cada colonia a 5 ml de medios LB suplementados con antibiótico apropiado (100 μg/ml de ampicilina o 50 μg/ml de kanamicina). Cultivar los cultivos durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora a 225 rpm.
4. Use 3 ml del cultivo nocturno para inocular en 150 ml de LB suplementado con antibiótico apropiado (100 μg/ml de ampicilina o 50 μg/ml de kanamicina) y cultive los cultivos durante la noche a 37 °C en una incubadora agitadora a 225 rpm.
5. Granular las células por centrifugación a ≥3400 x g durante 10 min a 4 °C.
6. Utilice un kit de purificación para purificar los plásmidos de acuerdo con el protocolo del fabricante¹⁶.
7. Eluya el ADN con 0,5 ml de agua pura libre de DNasa/RNasa. Mida la concentración de ADN y prepare 1 ml de soluciones madre de ADN (100 ng/μL). Conservar los tubos con ADN a 4 °C hasta su uso posterior.

3. Extracción de fibroína de seda y preparación de materiales iniciales.

1. Preparar una solución acuosa de proteína de fibroína de seda (SF) reconstituida de capullos de gusanos de seda Bombyx mori de acuerdo con el procedimiento descrito en detalle en otra parte para representar el 10% de la solución de Silk-LiBr¹⁸.
2. Determinar la concentración final de la solución acuosa de SF. Pipetear 0,5 ml de solución de seda a una placa de Petri de 60 mm, dejar secar a 60 °C y medir el peso de la película de seda seca. Divida el peso seco entre 0,5 ml para calcular el porcentaje de peso por volumen.
3. Diluir la solución de seda concentrada con agua destilada libre de DNasa/RNasa añadiendo lentamente agua mediante pipeta serológica para obtener una concentración final de 1 mg/ml. Conservar la solución a 4 °C para utilizarla en el futuro.
4. Prepare fibroína de seda marcada con fluorescencia usando un kit de etiquetado de anticuerpos. Use 1 ml de solución de fibroína de seda de 2 mg / ml para acoplar los grupos N-terminal α-amino de la proteína con un colorante derivado activado por éster NHS de acuerdo con el protocolo del fabricante¹⁹.
5. Preparar 50 ml de solución acuosa de polietileneimina (PEI) con una concentración de 6 mg/ml, ajustar el pH a 4 con HCl (1 M). Filtrar la solución a través de una membrana estéril de 0,2 μm. El almacenamiento es posible en condiciones ambientales durante meses.
6. Preparar núcleos de SiO₂ . Pipetear 300 μL de partículas de_SiO2 en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Lave las micropartículas dos veces con 1 ml de agua libre de DNasa/RNasa por centrifugación a 0,2 x g durante 1 minuto.

4. Realice la deposición capa por capa de una capa prima, plásmidos de ADN y capas de seda.

1. Para depositar la capa principal de PEI en las micropartículas de SiO₂ , agregue 1 ml de solución de PEI al pellet hilado del paso 3.6 y agite la mezcla en condiciones ambientales en un termomezclador a 800 rpm durante 15 min. Lave las partículas cuatro veces con 1 ml de agua desionizada libre de DNasa/RNasa por centrifugación a 0,2 x g durante 1 min.
2. Para realizar la deposición de la capa de ADN, añadir 1 ml de la solución acuosa de plásmidos de ADN del paso 2.7 a las micropartículas cebadas con PEI y agitar suavemente la mezcla a 4 °C en un termomezclador a 800 rpm durante 15 min. Para preparar microcápsulas con diferentes cargas de ADN, ajustar la concentración de plásmidos de ADN de 50-200 ng/μL usando agua destilada libre de DNasa/RNasa y usar 1 ml de estas soluciones para depositar el ADN. Recoger las micropartículas por centrifugación a 0,2 x g durante 1 min.
3. Marque los tubos para los plásmidos de ADN que codifican el ribointerruptor teofilina junto con GFPa1 como ThyRS-GFPa1, y los plásmidos de ADN que codifican el aptámero de brócoli como BrocApt.
   NOTA: Mantenga los tubos de microcentrífuga con ADN en hielo.
4. Retire cuidadosamente el sobrenadante y lave las micropartículas cuatro veces con 1 ml de agua destilada libre de DNasa/RNasa, desechando cada vez el sobrenadante después de la centrifugación a 0,2 x g durante 1 minuto. Realice todos los experimentos a temperatura ambiente (RT) a menos que se especifique lo contrario.
5. Para realizar la deposición de la capa de fibroína de seda, agregue 1 ml de la solución acuosa de SF reconstituida del paso 3.3 a las micropartículas adsorbidas por ADN, voltee suavemente y agite la mezcla a 10 °C en el termomezclador a 750 rpm durante 15 min. Recoger las micropartículas por centrifugación a 0,2 x g durante 1 minuto a 4 °C, retirar el sobrenadante y, a continuación, lavarlas una vez con 1 ml de agua destilada libre de DNasa/RNasa. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante.
   NOTA: Durante el experimento, mantenga la solución de seda en hielo para evitar la gelificación inducida por la temperatura.
6. Trate gradualmente las partículas con metanol para inducir la formación de β láminas en la estructura de la proteína de seda. Primero, agregue 0.5 ml de agua destilada DNasa / RNasa, haga un vórtice en el tubo de microcentrífuga y luego agregue 0.5 ml de metanol al 100%. Agitar suavemente las partículas del termomezclador a 10 °C durante 5 min. Recoger las partículas por centrifugación a 0,2 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante.
7. Trate las partículas con metanol para promover la formación de hojas de β y asegurar una fuerte adsorción física de la capa de seda. Agregue 1 ml de metanol al 100%. Agitar suavemente las partículas del termomezclador a 750 rpm durante 10 min a 10 °C.
8. Recoger las partículas por centrifugación a 0,2 x g durante 1 min a 4 °C y lavarlas dos veces con 1 ml de agua destilada libre de DNasa/RNasa cada vez, desechando el sobrenadante y vórtice suavemente antes de la siguiente centrifugación.
9. Repita los pasos 4.5-4.8 20 veces para obtener estructuras de concha de núcleo multicapa de seda. Para el último paso de deposición, utilice seda etiquetada con fluorescencia del paso 3.4 (Silk-DyLight550, 1 ml).
10. Realice el último paso de lavado y mantenga las micropartículas en 1 ml de agua destilada libre de DNasa/RNasa en condiciones ambientales.
    NOTA: Para evitar la agregación de partículas durante la deposición de capas de seda, realice una inspección visual de la suspensión de partículas y pipetearla hacia arriba y hacia abajo utilizando una punta de pipeta de 1 ml para promover una distribución homogénea de partículas.
11. Calcule el número de copias de plásmidos de ADN encapsuladas en cada microcápsula, N_ADN usando la Ecuación 1:
    (1)
    Donde N = 6.769 × 10¹¹ - el número de núcleos de SiO₂ utilizados para la encapsulación. Calcularlo a partir de una curva estándar para concentraciones conocidas de partículas de sílice utilizando diluciones seriadas y absorción A 320 a λ =₃₂₀ nm;
    C- concentración inicial de ADN utilizado para la adsorción
    V- el volumen de ADN utilizado para la adsorción
    0.8- Eficiencia de adsorción de ADN en los núcleos
    M_w- Peso molecular del plásmido de ADN
    N_A- Número de Avogadro (6.022 × 10²³)

5. Disolución de núcleos para obtener microcápsulas de seda.

1. Preparar una solución de ácido fluorhídrico (HF) al 8%, pH 5,5, diluyendo la solución madre (48%) con agua destilada. Adquiera un tubo de centrífuga de 50 ml. Pipetear cuidadosamente 5 ml de HF y añadir 25 ml de agua destilada para obtener una solución de HF al 8%.
   PRECAUCIÓN: HF es un ácido altamente corrosivo y puede causar quemaduras graves en los tejidos. Se debe tener extrema precaución durante la manipulación y el uso de HF para los experimentos. Adherirse al Procedimiento Operativo Estándar (SOP) para el uso y manejo adecuado de HF desarrollado por la organización para evitar accidentes de derrame indeseables. No utilice recipientes de vidrio para diluir el ácido HF. Utilice la campana química para realizar este paso del protocolo.
2. Disuelva los núcleos de SiO₂ añadiendo 1,5 ml de solución de HF al 8% a las micropartículas granuladas de núcleo a partir del paso 4.10. Realice un vórtice suave y deje que los núcleos se disuelvan durante la noche en condiciones ambientales con una agitación suave a 450 rpm.
   NOTA: Para evitar derrames de HF, use cinta de injerto para sellar el tubo de microcentrífuga. Utilice una campana química para realizar este paso del protocolo.
3. Prepare un vaso de precipitados de vidrio de 2 L lleno de 2 L de agua desionizada. Transfiera la solución de microcápsulas a dispositivos de diálisis (MWCO de 50 kDa) y dialícelos contra agua desionizada con un cambio repetido del agua cada 3 h durante los próximos 3 días.
   NOTA: Recoja el sobrenadante durante los tres primeros intercambios de agua y deseche la solución de acuerdo con el protocolo establecido para materiales de desecho peligrosos.
4. Use una pipeta de 1 ml para transferir la suspensión de los dispositivos de diálisis a nuevos tubos de microcentrífuga de 2 ml para recoger las microcápsulas.
   NOTA: Almacenar las soluciones acuosas de microcápsulas en condiciones ambientales durante varios años.

6. Obtención de imágenes de microcápsulas de fibroína de seda utilizando microscopio de barrido láser confocal (CLSM).

1. Realice la tinción de ADN con un tinte de ADN.
   1. Transfiera 300 μL de microcápsulas huecas de fibroína de seda a un tubo de microcentrífuga fresco de 1 ml. Añadir 500 μL de agua destilada libre de RNasa/DNasa.
   2. Añadir 5 μL del colorante de tinción de ADN, vórtice brevemente e incubar a RT durante 2 h protegido de la luz.
   3. Realizar cuatro pasos de lavado por centrifugación a 0,1 x g durante 20 min a 4 °C cada vez, retirando cuidadosamente 400 μL del sobrenadante y reponiéndolo con 400 μL de agua destilada libre de RNasa/DNasa.
2. Realice la obtención de imágenes de cápsulas de seda en sistemas confocales invertidos equipados con tres láseres principales (405 nm, 488 nm, 561 nm) utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x (NA 1.49). Transfiera 100 μL de la muestra de la cápsula a un solo pocillo de portaobjetos de vidrio con cámara de 8 pocillos, permita que las cápsulas sedimenten durante 20-30 minutos antes de la obtención de imágenes.
   NOTA: Los tintes son muy sensibles al fotoblanqueo. Proteja las muestras cubriendo los portaobjetos con papel de aluminio.

7. Estimación de la permeabilidad de microcápsulas huecas mediante el método de corte de peso molecular (MWCO).

1. Prepare 2 ml de cada una de las soluciones fluoróforas de dextrano marcadas con FITC (20 μM,_diH2O) de diferentes M_w (4 kDa, 20 kDa, 40 kDa, 70 kDa, 150 kDa, 250 kDa, 500 kDa y 2 MDa).
2. Pipetear 100 μL de la suspensión de cápsulas en un solo pocillo de un portaobjetos de vidrio con cámara. Analice cada diseño de microcápsula (concentración de PEI, número de carga de plásmidos de ADN, concentración de fibroína de seda y número de capas) por separado.
3. A cada pocillo, agregue 300 μL de la solución fluorófora específica desde el M_w más bajo hasta el más alto, de modo que cada pocillo corresponda a la solución fluorófora específica. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo y dejar que la mezcla se incube durante 1 h a RT hasta que la difusión de las soluciones fluoróforas alcance el equilibrio.
4. Transfiera el portaobjetos a un microscopio de barrido láser confocal (CLSM) e imagine la imagen de cada pocillo utilizando un objetivo de inmersión en aceite 100x en excitación λ = 488 nm.
   1. Identifique el área de interés ajustando el plano focal para asegurarse de que las cápsulas aparezcan en forma de círculos del mayor diámetro. Esto suele suceder cuando se ven las muestras más cerca del fondo del pozo cuando las cápsulas sedimentan debido a la gravedad.
   2. Recoja varias imágenes de muestras de microcápsulas moviendo el portaobjetos en dirección XY. Capture imágenes para dar cuenta de hasta 100-150 cápsulas para cada muestra.
   3. Utilice el software ImageJ para analizar la permeabilidad de la membrana de la cápsula en cada solución de fluoróforo M_w comparando las intensidades de fluorescencia dentro y fuera de las cápsulas. Para eso, dibuje una región de interés (ROI) en forma de círculo para delinear la circunferencia de la cápsula y haga clic en Analizar / Medir para medir la intensidad de fluorescencia en el interior. Tabula los datos en una hoja de cálculo. Realice esta operación para cada microcápsula para un total de 200-300 cápsulas.
   4. Evalúe la intensidad de fluorescencia exterior de la misma manera delineando el ROI y midiendo la intensidad lejos de las cápsulas. Realizar 3-5 mediciones para análisis estadístico.
   5. Para realizar el análisis estadístico, comparar las intensidades de fluorescencia dentro y fuera de las cápsulas utilizando la prueba t pareada (p < 0,05).
   6. Utilice la tabla de conversión 2 para estimar la permeabilidad de las microcápsulas en función de los radios hidrodinámicos para FITC-Dextrano con la variable M_w.

8. Activación in vitro del riboswitch de teofilina sintética en microcápsulas de seda

1. Preparar 1 ml de solución madre de teofilina (100 mM, DMSO). Prepare el sistema de extracto de E. coli S30 para el ADN circular descongelando los componentes en hielo durante 40 minutos.
2. Obtenga un tubo de microcentrífuga libre de DNasa/RNasa de 0,5 ml. Realizar reacción de transcripción/traducción in vitro , combinar los componentes libres de células con una muestra de microcápsulas en el siguiente orden (volumen total de 50 μL): Premezcla S30 sin aminoácidos (20 μL); Extracto de S30, circular (15 μL); mezcla completa de aminoácidos (5 μL); microcápsulas huecas que contengan plásmidos ThyRS-GFPa1 del paso 4.10 (9 μL); y teofilina, 100 mM DMSO (1 μL).
   NOTA: Después de agregar todos los componentes, haga un breve vórtice del tubo y recoja la muestra durante una breve centrifugación a 0,2 × g durante un par de segundos.
3. Incubar el tubo a 30 °C durante 4 h y comprobar la fluorescencia en un lector de placas utilizando excitación a λ = 488 nm y emisión para filtro GFP/FITC (510 nm ± 20 nm).
4. Imagen de las cápsulas en cualquier sistema LCSM utilizando láseres de 488 nm y 561 nm. Obtenga imágenes de la mejor calidad utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x y diapositivas con cámara de 8 pocillos.

9. Activación in vitro del aptámero de brócoli en microcápsulas de seda

1. Preparar 1 ml de solución madre de colorante DFHBI-1T (30 μM,_diH2O). Prepare el kit de reacción del sistema libre de células PURE (síntesis de proteínas utilizando elementos recombinantes) descongelando los componentes en hielo durante 40 minutos.
2. Obtenga un tubo de microcentrífuga libre de DNasa/RNasa de 0,5 ml. Realizar una reacción de transcripción in vitro combinando componentes de reacción libres de células con una muestra de microcápsulas en el siguiente orden (volumen total de 50 μL): solución A (20 μL); solución B (15 μL); microcápsulas huecas que contengan plásmidos BrocApt del paso 4.10 (14 μL); y colorante DFHBI-1T (1 μL).
   NOTA: Después de agregar todos los componentes, haga un breve vórtice del tubo y recoja la muestra durante una breve centrifugación a 0,2 × g durante un par de segundos.
3. Incubar el tubo a 37 °C durante 6 h y comprobar la fluorescencia en un lector de placas utilizando excitación a λ_ex = 470 nm y emisión a λ_em = 510 nm ± 20 nm.
4. Imagen de las cápsulas en cualquier sistema LCSM utilizando láseres de 488 nm y 561 nm. Obtenga imágenes de la mejor calidad utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100x y diapositivas con cámara de vidrio de cubierta de 8 pocillos.

Resultados

Aquí, el estudio aborda la funcionalidad de las plantillas de ADN que codifican diferentes diseños de sensores (dos tipos de elementos de transcripción / traducción regulados por ARN) después de la encapsulación en cápsulas de proteína de seda. Las microcápsulas se prepararon mediante el ensamblaje capa por capa (LbL) de los componentes clave: una capa principal, plásmidos de ADN que codifican diseños de sensores y biopolímero de fibroína de seda (Figura 2). La deposición de macromoléculas e...

Discusión

Las microcápsulas de hidrogel selectivamente permeables cargadas con varios tipos de diseños de sensores codificados por ADN se pueden preparar siguiendo este protocolo. Una de las características distintivas del enfoque LbL es la capacidad de adaptar la complejidad de las microcápsulas durante el ensamblaje ascendente, que generalmente comienza con la adsorción de especies moleculares en plantillas de sacrificio. Ajustando cuidadosamente las concentraciones de los componentes iniciales, las condiciones de pH y el número...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno)-2-metil-1-(2,2,2-trifluoroetil)-1H-imidazol-5(4 H)-ona (DFHBI-1T)	Lucerna	DFHBI-1T
5x T4 T4 Tampón de ADN ligasa	ThermoFisher Scientific	46300-018
6x Tinte de carga de gel azul	New England BioLabs	B7021S
, negro circular	Corning	3601
Agarosa	Sigma-Aldrich	A9539	BioReactivo, para biología molecular, baja EEO
Sal sódica de ampicilina	Sigma-Aldrich	A0166	en polvo o cristales, BioReactivo, adecuado para cultivo celular
Enzimas de restricción de BlpI	New England BioLabs	R0585S
Corning Sistemas de almacenamiento/filtro de vacío desechables	FisherScientific	09-761-1
Dimetilsulfóxido, DMSO	Sigma-Aldrich	472301	reactivo ACS, ≥ 99.9%
Plásmido de ADN, pET28c-F30-2x Brócoli (5.4 kb), BrocApt.		Plásmido Addgene #66788
DyLightTM550 Kit de etiquetado de anticuerpos (Invitrogen)	ThermoFisher Scientific	84530
Sistema de extracto de E. coli S30 para ADN circular	Promega	L1020
Falcon, 15 mL	FisherScientific	14-959-53A
Tubos de centrífuga cónicos Falcon, 50 mL		14-432-22
Tubos de microcentrífuga Fisherbrand, 1,5 mL	FisherScientific	05-408-129
Ácido fluorhídrico, HF	Sigma-Aldrich	695068	reactivo ACS, 48 %
Sulfato de kanamicina	Sigma-Aldrich	60615	mezcla de Kanamicina A (componente principal) y Kanamicina B y C
Enzimas de restricción KpnI	Nueva Inglaterra BioLabs	R0142S
Placa de agar LB suplementada con 100 µ g/mL de ampicilina	Sigma-Aldrich	L5667	placas de agar prevertidas con 100 µ g/mL de ampicilina
LB placa de agar suplementada con 50 µ g/mL de kanamicina	Sigma-Aldrich	L0543	placas de agar prevertidas con 50 µ g/mL de caldo de kanamicina
LB (grado Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
Bromuro de litio, LiBr	Sigma-Aldrich	213225	ReagentPlus, ≥ 99%
Eficiencia máxima DH5-α cepa de E. coli competente	ThermoFisher Scientific	18258012
Metanol	MilliporeSigma	322415	anhidro, 99,8%
MilliQ-water	EMD MilliPore		Milli-Q Sistema de purificación de agua de referencia
MinElute PCR Kit de purificación	Qiagen	28004
Clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropilo)-N′-etilcarbodiimida, EDC	Sigma-Aldrich	E1769
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	ThermoFisher Scientific	10010023	1x PBS, pH 7.4
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	New England Biolabs	M0530S
Polietilenimina,	Sigma-Aldrich	408727	Mw promedio ~ 25,000
Kit de síntesis de proteínas in vitro PURExpress	New England BioLabs	E6800S
QIAEX II Kit de extracción de gel	Qiagen	20021
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
Escalera de ADN de 2 registros de carga rápida (0.1-10.0 kb)	New England BioLabs	N0469S
SiO? microesferas de sílice, 4.0 y micro; m	Policiencias, Inc.	24331-15	Solución acuosa al 10%
Casetes de diálisis Slide-A-Lyzer G2, 3.5K MWCO, 15 mL	ThermoFisher Scientific	87724
Carbonato de sodio, Na?CO?	Sigma-Aldrich	222321	reactivo ACS, anhidro, ≥ 99,5%, polvo
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dispositivos de diálisis	FisherScientific	08-607-008	Spectrum G235058
SYBR Tinción de gel de ADN segura	ThermoFisher Scientific	S33102
T4 ADN ligasa (5 U/µ L)	ThermoFisher Scientific	EL0011
Teofilina	Sigma-Aldrich	T1633	anhidro, ≥ 99%,
tampón de acetato de tris-EDTA en polvo (tampón TAE)	Sigma-Aldrich	T6025	Contiene 40 mM de tris-acetato y 1 mM de EDTA, pH 8,3.
Agua destilada ultrapura sin DNasa/RNasa	FisherScientific	10-977-023
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit	ZymoResearch	D4202