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Artículo de método

Ensayo de nucleósidos trifosfato hidrolasas en Toxoplasma gondii y Neospora caninum para el cribado de alto rendimiento utilizando un brazo robótico

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DOI:

10.3791/62874

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22 de julio de 2022

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1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Las infecciones por Toxoplasma gondii y Neospora caninum se encuentran en humanos y animales y provocan graves problemas de salud. Los dos parásitos comparten nucleósidos trifosfato hidrolasas similares y desempeñan un papel importante en la propagación y la supervivencia. Establecimos un ensayo de alto estándar de las enzimas que requieren el uso de brazos robóticos.

Resumen

Los parásitos protozoarios infectan a los humanos y a muchos animales de sangre caliente. El Toxoplasma gondii, uno de los principales parásitos protozoarios, se encuentra comúnmente en pacientes VIH positivos, receptores de trasplantes de órganos y mujeres embarazadas, lo que resulta en una condición de salud grave, Toxoplasmosis. Otro protozoo importante, Neospora caninum, que tiene muchas similitudes con el Toxoplasma gondii, causa enfermedades graves en los animales, al igual que la encefalomielitis y la miositis-polirradiculitis en perros y vacas, lo que da lugar a terneros nacidos muertos. Todos ellos presentaban nucleósidos trifosfato hidrolasas (NTPasa) similares. Neospora caninum tiene una NcNTPasa, mientras que Toxoplasma gondii tiene una TgNTPasa-I. Se cree que las enzimas desempeñan un papel crucial en la propagación y la supervivencia. Con el fin de establecer compuestos y/o extractos que previnieran la infección por protozoos, nos centramos en estas enzimas para el descubrimiento de fármacos. El siguiente paso fue establecer un ensayo novedoso, altamente sensible y altamente preciso mediante la combinación de un ensayo de enzima bioquímica convencional con un ensayo fluorescente para determinar el contenido de ADP. También validamos que el nuevo ensayo cumple con los criterios para llevar a cabo un cribado de alto rendimiento (HTS) en las dos enzimas protozoarias. Realizamos HTS, identificamos 19 compuestos y seis extractos de dos bibliotecas de compuestos sintéticos y una biblioteca de extractos derivados de bacterias marinas, respectivamente. En este estudio, se ha introducido una explicación detallada sobre cómo llevar a cabo el HTS, incluyendo información sobre la preparación de reactivos, dispositivos, brazo robótico, etc.

Introducción

La robótica se ha establecido como herramientas sofisticadas y poderosas para lograr avances significativos en varios campos más allá de la industria y la ingeniería de fabricación, como la bioquímica, la biología molecular y la investigación clínica, y en particular HTS 1,2,3. Toxoplasma gondii es un parásito importante y un eucariota parásito unicelular4 que causa graves problemas de salud en los seres humanos5 y en muchos animales homeotermos4, lo que resulta en infecciones que conducen a la toxoplasmosis, una afección particularmente grave en pacientes con SIDA6, receptores de trasplantes de órganos7 y mujeres embarazadas8. Neospora caninum perteneciente al Filo Apicomplexa9 infecta principalmente a perros y vacas6, lo que resulta en Encefalomielitis y Miositis-Polirradiculitis en perros10,11 y aborto en vacas 12,13. Además, Neospora caninum exhibe similitudes morfológicas y filogenéticas cercanas con Toxoplasma gondii 9,14. Además, tienen un nucleósido trifosfato hidrolasa (NTPasa; EC3.6.1.15)14. Las enzimas son bastante diferentes de la ecto-ATPasa14 convencional. Estos parásitos generan una cantidad considerable de proteínas NTPasa, entre el 2% y el 8% de la proteína total y desempeñan un papel importante como enzimas inactivas en su estadio de taquizoíto15. Cabe señalar que en los gránulos secretores densos, estos se condensan16 y se secretan en la vacuola parasitófora16. Como carácter enzimático bioquímico, la NTPasa es activada por el ditiotreitol17. Se predice que los inductores, como el compuesto ditiol, una enzima no identificada como la ditiol-disulfuro oxidorreductasa, y otra presentan la misma naturaleza. Todavía no se han identificado en los parásitos. Sin embargo, la enzima desempeña un papel importante en la liberación de taquizoíto de las células huésped infectadas17.

Toxoplasma gondii tiene dos isoformas de NTPasa18: la enzima tipo I TgNTPasa-I y la enzima tipo II TgNTPasa-II18. El primero utiliza preferentemente nucleósidos de trifosfato como sustrato18. Este último hidroliza nucleósidos de trifosfato y difosfato18. La homología es del 97% en los niveles de aminoácidos18. Neospora caninum también tiene un ortólogo de TgNTPasa-I llamado NcNTPasa19. La homología es del 73% en los niveles de aminoácidos19. El Prof. Asai y el Prof. Harada generaron recombinantes de ambas NTPasa utilizando E. coli y cambiaron los mutantes constitutivamente activos de estos como se informó anteriormente20. Amablemente obsequiaron a los dos mutantes activos. Ambas enzimas pueden convertir ATP en ADP in vitro20. Muy recientemente, medimos la actividad de la NTPasa utilizando el contenido de ADP hidrolizado por las enzimas. Finalmente, logramos establecer el ensayo de alto estándar a través del proceso de determinación del contenido de ADP con una combinación de fluorescencia y reacción enzimática como se informó anteriormente21,22. También realizamos cribado de alto rendimiento (HTS)22.

Este estudio presenta procedimientos detallados de un nuevo ensayo de alta precisión y rango dinámico21 y una explicación detallada sobre cómo preparar reactivos para medir la actividad enzimática y desarrollar la intensidad fluorescente utilizando un brazo robótico para HTS.

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Protocolo

1. Expresión y purificación de TgNTPasa-I y NcNTPasa recombinantes

  1. Preparar el plásmido de expresión e introducirlo a la E. coli. cepa BL21.
    NOTA: En un informe anterior se muestra información detallada sobre constructos y procedimientos14. En este estudio, tanto los mutantes constitutivamente activos TgNTPasa-I como los mutantes constitutivamente activos de NcNTPasa fueron amablemente obsequiados por el Prof. Asai y el Prof. Harada.

2. Preparación y colocación de la solución de reacción biofluorescente en la placa

  1. Prepare 2 soluciones de reacción biofluorescentes como se describe en la Tabla 1 para 2 mL de mezcla maestra para un ensayo de 400 pocillos en formato de 384 pocillos.
  2. Prepare las soluciones madre utilizando agua destilada (DW) para cada concentración indicada, con la excepción de la resazurina y la N-etilmaleimida. Disuelva los dos reactivos restantes con DMSO en la concentración adecuada. A continuación, almacene los reactivos a -30 °C hasta el momento de realizar los experimentos.
  3. Agregue 15 μL de solución de reacción biofluorescente 2x a cada uno de los 368 pocillos (formato de 384 pocillos).
    NOTA: La primera placa sirve como depósito para tener suficiente reactivo para realizar experimentos dos veces.

3. Coloque los compuestos o extractos de prueba en el fondo de cada pocillo en la placa de ensayo

  1. Coloque 0,5 μL de cada compuesto en la parte inferior de la placa utilizando un brazo robótico de la placa madre de la biblioteca, incluidos los compuestos de prueba.
  2. Añada 0,5 μL de DMSO tanto para el control negativo como para el positivo.

4. Preparación de la mezcla de reacción enzimática y comienzo de la reacción

  1. Prepare la solución de reacción enzimática como se indica en la Tabla 2.
  2. Agregue NTPasa (la concentración final es de 0,0002 μg/mL) a 50 mL de la mezcla de reacción enzimática, mezcle rápidamente y transfiera a un depósito de plástico.
  3. Proceda a inyectar simultáneamente 4,5 μL en cada pocillo, excepto en la línea de control negativo, utilizando el brazo del robot.
  4. Agregue la misma cantidad de la mezcla de reacción enzimática con PBS en lugar de la enzima precedida por la inyección simultánea.
  5. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 10 min.

5. Realizar mediciones en tiempo real de las actividades enzimáticas utilizando un lector de microplacas

  1. Después de 10 minutos de incubación, agregue simultáneamente 5 μL de solución de reacción biofluorescente 2x a cada pocillo inmediatamente usando el brazo del robot.
  2. Detenga temporalmente el brazo del robot para sostener la solución en cada punta sobre el lugar donde se colocará la placa.
  3. Una vez que la placa de ensayo esté en su lugar, reinicie el brazo del robot.
    NOTA: Para evitar la saturación del ADP generado, mida inmediatamente la intensidad fluorescente.
  4. Gire rápidamente hacia abajo (200 x g durante 1 min) el plato y colóquelo en el lector de platos.
  5. Inicie la medición en tiempo real de la fluorescencia a 540 nm/590 nm (excitación/emisión) cada minuto durante 1 h.

6. Análisis de resultados

  1. Calcular los valores como la media ± el error estándar de la media (SEM) a partir de las muestras indicadas y replicadas en cada grupo experimental; Replique los experimentos para garantizar la coherencia.
  2. Realizar la significación estadística utilizando una prueba t de Student.
  3. Calcule los valores como estadísticamente significativos si los valores P son P < 0,05.
  4. Calcule la relación señal-fondo (S/B), la relación señal-ruido (S/N) y el factor Z' utilizando las siguientes fórmulas:
    S/B = Ligando promedio/Vehículo promedio
    S/N = (ligando promedio - vehículo promedio)/vehículo de desviación estándar
    Factor Z' = 1 - (3 x ligando de desviación estándar + vehículo de desviación estándar)/(ligando promedio - vehículo promedio)
  5. Asegúrese de que los factores S/B, S/N y Z' sean superiores a 3, 10 y 0,5, respectivamente.
    NOTA: Confirme si cada experimento cumple con el criterio general suficiente para realizar HTS como se indicó en informes anteriores 23,24.

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Resultados

Un principio del ensayo se resume en la Figura Suplementaria 1 y se basa en un informe previo12,18. El ensayo se diseñó en un formato de 384 pocillos, como se muestra en la Figura 1. Se evitaron las líneas de extrema derecha e izquierda en el plato. Las dos líneas junto a las líneas de extremo izquierdo y derecho se utilizaron como control negativo y control positivo con o sin la enzima, respectivamente (n = 16). Est...

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Discusión

Logramos establecer un nuevo ensayo de alto rango dinámico y precisión con una combinación de un ensayo de enzima clásico y un ensayo fluorescente para ADP, que es el producto final a través de la ATPasa, incluidas Tg y Nc ATPasa22. Para llevar a cabo la HTS, es importante que el ensayo tenga mejores valores de factor S/B, S/N y Z' que un ensayo enzimático clásico15,22. Además, omitir el paso de detener la...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún interés financiero en este estudio.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por la Plataforma para el Descubrimiento de Fármacos, Informática y Ciencias de la Vida Estructural, una subvención para la investigación científica (C) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS-21K06566). Los autores agradecen sinceramente a Asai (Facultad de Medicina de la Universidad de Keio) y Harada (Instituto de Tecnología de Kioto) y a Stephen Stratton por regalar dos mutantes activos NTPasa recombinantes y su contribución en la preparación de este manuscrito, respectivamente.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Estación de trabajo de 12 etapas EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXBrazo robótico Sistema de pipeteo
384 puntas de pozosBiotech Co., Ltd.Hecho a medida
ADP-hexoquinasaAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPLevadura Oriental, Co, Ltd.45140000
BSAWako Industrias Químicas Puras, Ltd.011-15144
Diaphorase-IUnitika Ltd.Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P deshidrogenasaLevadura oriental, Co, Ltd.306-50143
GlucosaWako Industrias Químicas Puras, Ltd.049-31165
Greiner 384 pocillo microplaca no vinculante pozo poco profundo Negro#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPLevadura Oriental, Co, Ltd.44332000
N-etilmaleimidaWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPÓN L.t.d.Lector de microplacas multimodoPHERAstar FS
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 Pozo Reservorios deS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Tritón X-100Nacalai Tesch, Inc.35501-02
perfil bajo

Referencias

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