Aquí presentamos un protocolo basado en el sistema de cebo del gusano de la harina (Tenebrio molitor) que se utilizó para aislar y seleccionar hongos entomopatógenos (EPF) a partir de muestras de suelo. Se utiliza una fórmula efectiva de número de conidios (ECN) para seleccionar EPF altamente tolerante al estrés en función de las características fisiológicas para el control microbiano de plagas en el campo.
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Artículo de método
Aislamiento y selección de hongos entomopatógenos a partir de muestras de suelo y evaluación de la virulencia fúngica contra plagas de insectos
En este artículo
Resumen
Resumen
Los hongos entomopatógenos (EPF) son uno de los agentes de control microbiano para el manejo integrado de plagas. Para controlar las plagas locales o invasoras, es importante aislar y seleccionar el EPF autóctono. Por lo tanto, el método de cebo del suelo combinado con el sistema de cebo de insectos (gusano de la harina, Tenebrio molitor) se utilizó en este estudio con algunas modificaciones. Los EPF aislados fueron sometidos a la prueba de virulencia contra la plaga agrícola Spodoptera litura. Además, las cepas potenciales de EPF fueron sometidas a identificaciones morfológicas y moleculares. Además, se realizó el ensayo de producción de conidios y termotolerancia para las cepas EPF prometedoras y se comparó; estos datos se sustituyeron además por la fórmula del número de conidios efectivos (ECN) para la clasificación de laboratorio. El sistema de gusanos de la harina de cebo del suelo y la fórmula ECN se pueden mejorar reemplazando las especies de insectos e integrando más factores de estrés para la evaluación de la comercialización y la aplicación en el campo. Este protocolo proporciona un enfoque rápido y eficiente para la selección de EPF y mejorará la investigación sobre agentes de control biológico.
Introducción
Actualmente, los hongos entomopatógenos (EPF) son ampliamente utilizados en el control microbiano de plagas agrícolas, forestales y hortícolas. Las ventajas de EPF son sus amplias gamas de huéspedes, buena adaptabilidad ambiental, naturaleza ecológica y que se puede utilizar con otros productos químicos para mostrar el efecto sinérgico para el manejo integrado de plagas1,2. Para la aplicación como agente de control de plagas, es necesario aislar una gran cantidad de EPF de insectos enfermos o del entorno natural.
El muestreo de estos organismos de sus huéspedes ayuda a comprender la....
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Protocolo
NOTA: Todo el diagrama de flujo se muestra en la Figura 1.
1. Aislamiento y selección de posibles hongos entomopatógenos (EPF)
- Recoger la muestra de suelo
- Retire 1 cm del suelo de la superficie y luego recoja el suelo dentro de la profundidad de 5-10 cm usando una pala de cada sitio de muestreo.
NOTA: Los sitios de muestreo serían una montaña, un bosque o áreas escasamente pobladas para evitar la contaminación de cepas de EPF rociadas artificialmente. Asegúrese de que las áreas para la recolección de muestras de suelo estén cubiertas con maleza en la superficie. El suelo seco o húmedo no es....
- Retire 1 cm del suelo de la superficie y luego recoja el suelo dentro de la profundidad de 5-10 cm usando una pala de cada sitio de muestreo.
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Resultados
Aislamiento y selección de posibles hongos entomopatógenos (EPF)
Mediante el uso del método de construcción de la biblioteca de hongos entomopatógenos (EPF) mediado por Tenebrio molitor, se excluiría el número de hongos sin actividad de eliminación de insectos; por lo tanto, la eficiencia del aislamiento y la selección de EPF podrían aumentarse en gran medida. Durante la aplicación de este método, se registró la información de los sitios de muestreo, las mues.......
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Discusión
Los hongos entomopatógenos (EPF) se han utilizado para el control de insectos. Existen varios métodos para aislar, seleccionar e identificar EPF30,31,32. Comparando los diferentes tipos de métodos de cebo de insectos, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae se encontraron comúnmente en cebos de insectos6,12,13,14.<.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflicto de intereses involucrado en este trabajo.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por la Subvención 109-2313-B-005 -048 -MY3 del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar Grado bacteriológico | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Adecuado en la mayoría de las aplicaciones de cultivo celular/biología molecular. |
| AGAROSE, grado de biotecnología | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | Para electroforesis de ADN. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Barrenador de corcho de latón | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | Para récord de morfología de colonias de cepas |
| Incubadora de temperatura constante | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD Mantenimiento de | hongos. |
| cubee Mini-Centrífuga | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Sistema de imagen de gel digital | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 a 2 µ L Pipeta | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 a 10 µ L Pipeta | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 a 100 µ L Pipeta | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 a 1000 µ L Pipeta | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 a 20 µ L Pipeta | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 a 200 µ L Pipeta | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR | Kit Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Cilindro graduado personalizado A 100 ml | SIBATA | SAPP-1195906 | Mida el volumen de reactivos. |
| Contador | SDI | NO.1055 | |
| Hemocitómetro | bioman | AP-0650010 | Calcular el número de esporas |
| Asa de inoculación | Tapa Dogger | D8GA-23000 | |
| IDEAHOUSE | RS92004 | ||
| Micro cubreobjetos | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Sistema de imagen para microscopio | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Portaobjetos de microscopio | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electroforesis | ADVANCE | AD110 | |
| Microscopio óptico Nikon | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Vaso de plástico | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Kit de extracción de ADN genómico fúngico |
| Caldo de dextrosa Sabouraud (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Empresa líder en biociencias | M033 | Se utiliza para el cultivo de levaduras, mohos y microorganismos acidúricos. |
| Hoja de bisturí n.º 23 | Swann-Morton | 310 | |
| Mango de bisturí n.º 4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Pala | Save & Seguro | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactante |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrífuga | Thermo Scientific | ||
| SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | ||
| Placa de Petri estéril | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Recipientes cilíndricos poco profundos con tapas ajustadas, específicos para uso en microbiología o cultivo celular. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX-80 | y grados; C muestra almacenada. |
| Gabinete de piso vertical | Chih Chin | BSC-3 | Cultivo de hongos operativos. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Bolsas de almacenamiento con cremallera | Guardar & Seguro | A -1248915 -00 | |
| 100 bp Escalera de ADN | Geneaid | DL007-20 | |
| ° C Congelador | FRIGIDAIRE | Frigidaire | FFFU21M1QW-20° C muestra y reactivos experimentales almacenados. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X Tampón TAE | BIOMAN | TAE501000 |
Referencias
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Flor....
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Reimpresiones y permisos
