Aquí, se presenta un protocolo simple para producir nanopartículas de ARNm basadas en polímeros de poli(beta aminoéster), fáciles de adaptar cambiando el ARNm encapsulado. También se describe el flujo de trabajo para sintetizar los polímeros, las nanopartículas y su caracterización esencial in vitro. También se agrega una prueba de concepto con respecto a la inmunización.
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Artículo de método
Síntesis y caracterización de nanopartículas de poli(beta aminoésteres) cargadas de ARNm con fines de vacunación
En este artículo
Resumen
Resumen
La vacunación ha sido uno de los mayores éxitos de la sociedad moderna y es indispensable para controlar y prevenir enfermedades. Las vacunas tradicionales estaban compuestas por enteros o fracciones del agente infeccioso. Sin embargo, siguen existiendo desafíos y las nuevas tecnologías de vacunación son obligatorias. En este contexto, el uso de ARNm con fines de inmunización ha demostrado un mejor rendimiento, como lo demuestra la rápida aprobación de dos vacunas de ARNm que previenen la infección por SARS-CoV-2. Más allá del éxito en la prevención de infecciones virales, las vacunas de ARNm también se pueden utilizar para aplicaciones terapéuticas contra el cáncer.
Sin embargo, la inestabilidad del ARNm y su rápida eliminación del cuerpo debido a la presencia de nucleasas hace que su entrega desnuda no sea posible. En este contexto, las nanomedicamentos, y específicamente las nanopartículas poliméricas, son sistemas críticos de administración de ARNm. Por lo tanto, el objetivo de este artículo es describir el protocolo para la formulación y prueba de un candidato a vacuna de ARNm basado en las nanopartículas poliméricas patentadas. La síntesis y caracterización química de los polímeros poli(beta aminoésteres) utilizados, su complejación con ARNm para formar nanopartículas y su metodología de liofilización se discutirán aquí. Este es un paso crucial para disminuir los costos de almacenamiento y distribución. Por último, se indicarán las pruebas necesarias para demostrar su capacidad de transfectar in vitro y madurar células dendríticas modelo. Este protocolo beneficiará a la comunidad científica que trabaja en la vacunación debido a su alta versatilidad que permite a estas vacunas prevenir o curar una amplia variedad de enfermedades.
Introducción
Las enfermedades infecciosas han representado una grave amenaza para millones de seres humanos en todo el mundo y siguen siendo una de las principales causas de muerte en algunos países en desarrollo. La vacunación profiláctica ha sido una de las intervenciones más eficaces de la sociedad moderna para prevenir y controlar las enfermedadesinfecciosas1,2. Estos hitos críticos de la ciencia en relevancia del sigloXXhan sido señalados por la reciente pandemia mundial de Covid-19 causada por el virus SARS-CoV-23. Reconociendo la importancia de contar con vacunas eficientes para re....
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Protocolo
1. Síntesis de polímero pBAE con oligopéptidos finales (OM-pBAE)
- Polimerización de C6-pBAE
- Añadir 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103.16 Da) 1-hexilamina (38 mmol; MW = 101,19 Da) en un matraz de vidrio de fondo redondo (100 mL). Luego, agregue diacrilato de 1,4-butanediol (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Precaliente el baño de aceite de silicona a 90 °C, coloque el matraz de fondo redondo en el baño de aceite y revuelva la mezcla con la ayuda de una barra de agitación magnética durante la noche (~ 18 h). Luego, tome el producto del matraz de fondo redondo y colóquelo en el congelador a -20 ° C.
NOTA: El producto tiene la forma de un polvo ....
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Resultados
Síntesis y caracterización de polímeros
El procedimiento de síntesis OM-pBAE se da en la Figura 2. Como muestra la Figura 2A, el primer paso para obtener el OM-pBAE es sintetizar el C6-pBAE añadiendo las aminas (1-hexilamina y 5-amino-1-pentanol, relación 1:1) al diacrilato (diacrilato de 1,4-butanodiol). Esta reacción se lleva a cabo a 90 °C durante 20 h y con agitación constante. Posteriormente, se añade una solución de oligopéptidos a una .......
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Discusión
Después del brote de la pandemia de Covid-19 el año pasado, la importancia de las vacunas en términos de control de enfermedades infecciosas se ha manifestado como un componente crítico8. Los esfuerzos de científicos de todo el mundo han permitido el lanzamiento al mercado de muchas vacunas. Por primera vez en la historia, las vacunas de ARNm han demostrado su éxito previamente hipotético, gracias a su rápido diseño debido a su capacidad para adaptarse a cualquier antígeno nuevo en unos
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar ni ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Se agradece el apoyo financiero del MINECO/FEDER (subvenciones SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 y COV20/01100). CGF reconoció su beca de doctorado IQS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,4-butanodiol diacrilato | Sigma Aldrich | 123048 | |
| 1-hexilamina | Sigma Aldrich | 219703 | |
| 5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
| Acetona | Panreac | 141007 | |
| anticuerpo CD11b | BD 550993 | ||
| anticuerpo CD86 | Bioligendo | 105007 | |
| Cloro hidroxihído | Panreac | 181023 | |
| Cloroformo-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
| Péptido Cys-His-His-His | Ontores | Custom | |
| Cys-Lys-Lys-Lys péptido | Ontores | Custom | |
| D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
| reactivo DEPC para agua libre de Rnasa | Sigma Aldrich | D5758 | Este reactivo es importante para tratar el agua MilliQ para eliminar cualquier RNasas de los tampones |
| Etil eter | Panreac | 212770 | |
| dimetilsulfóxido Sigma | Aldrich | 276855 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
| mRNA OVA | TriLink Tecnologías | L-7610 | |
| Kit RiboGreen | ThermoFisher | R11490 | |
| acetato de sodio | Sigma Aldrich | 71196 | |
| sacarosa | Sigma Aldrich | S0389 | |
| Ácido trifluoroacético | Sigma Aldrich | 302031 | |
| tripsina-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
| α- ratón AlexaFluor488 anticuerpo | Abcam | Ab450105 | |
| Equipment | |||
| nanopartículas | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
| Espectrómetro de resonancia magnética nuclear | Varian | 400 MHz | |
| ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | Para el potencial zeta y determinación del tamaño hidrodinámico |
| Software | |||
| NanoSight Software NTA | Malvern Panalytical | MAN0515-02-ES-00 | |
| Software NovoExpress | Agilent | No especificado | |
| Software ZetaSizer | Malvern Panalytical | DTS | Para analizar la carga superficial y los tamaños hidrodinámicos |
Referencias
- Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. Can existing live vaccines prevent COVID-19. Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).
- Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).
- W....
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Reimpresiones y permisos
