Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

La β-oxidación de ácidos grasos es un proceso esencial en el metabolismo de los lípidos, proporcionando una vía catabólica para equilibrar la síntesis de ácidos grasos y la ingesta de la dieta. Este proceso genera energía para múltiples órganos, incluidos el músculo cardíaco, la corteza renal y el hígado en ayunas, y utiliza ácidos grasos obtenidos de la dieta, la lipólisis del tejido adiposo y las reservas internas de triglicéridos ^1,2.

La oxidación de los ácidos grasos a través de la vía de β-oxidación da como resultado el acortamiento secuencial de la cadena de acilo graso por dos carbonos a la vez, liberados como acetil-CoA, y este proceso ocurre tanto en las mitocondrias como en los peroxisomas. Mientras que la mayoría de los ácidos grasos sufren sólo β-oxidación, algunos se oxidan en diferentes carbonos antes de entrar en esta vía. Por ejemplo, los ácidos grasos sustituidos por 3-metilo, como el ácido fitánico, se someten a la eliminación de un carbono por α-oxidación en los peroxisomas antes de entrar en la vía de β-oxidación. Del mismo modo, algunos ácidos grasos se convierten primero en ácidos grasos dicarboxílicos por oxidación del grupo metilo terminal (ω-oxidación) en el retículo endoplásmico antes de ser oxidados preferentemente en los peroxisomas por β-oxidación³.

Independientemente del orgánulo específico, un ácido graso primero debe convertirse en un tioéster de coenzima A (CoA), o acil-CoA, para oxidarse a través de la vía de β oxidación. β-Oxidación de acil-CoAs de cadena larga en la matriz mitocondrial requiere el transbordador de carnitina para su translocación, donde la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1) cataliza la conversión de acil-CoAs en acilcarnitinas y es la enzima limitante de velocidad en este proceso⁴. Una vez translocados a la matriz mitocondrial, los acil-CoAs se vuelven a formar y sirven como sustratos para la maquinaria mitocondrial de β-oxidación. En el estado de ayuno, el acetil-CoA producido a través de la β-oxidación en las mitocondrias hepáticas se canaliza principalmente a la cetogénesis. Los peroxisomas sirven como el sitio principal para la β-oxidación de los ácidos grasos de cadena muy larga, cadena ramificada y dicarboxílicos. Los peroxisomas no requieren el transbordador de carnitina para importar sustratos de ácidos grasos, sino que importan los correspondientes acilo-CoAs a través de la actividad de los transportadores de casete de unión a ATP (ABC) ABCD1-3⁵. Dentro de los peroxisomas, los acil-CoAs son oxidados por un conjunto dedicado de enzimas, distintas de la maquinaria de β oxidación de ácidos grasos mitocondriales. Tanto las mitocondrias como los peroxisomas también requieren un suministro de NAD ⁺ y CoA libre para oxidar las cadenas de acilo graso. Se ha demostrado que los niveles de CoA en el hígado aumentan en respuesta al ayuno, lo que respalda el aumento de la tasa de oxidación de ácidos grasos que ocurre en este estado⁶. Además, el aumento de la degradación de CoA en los peroxisomas resulta en una disminución selectiva de la oxidación de ácidos grasos peroxisomales⁷. Por lo tanto, el proceso de oxidación de ácidos grasos dentro de la célula está regulado por los niveles de expresión y las actividades de las enzimas involucradas en la activación, transporte y oxidación de los ácidos grasos, así como las concentraciones de cofactores y otros metabolitos a través de múltiples compartimentos subcelulares.

Los procedimientos que utilizan homogeneizados de tejidos para medir la oxidación de ácidos grasos destruyen la arquitectura celular que regula y apoya este proceso, lo que lleva a una recopilación de datos que no reflejan con precisión el metabolismo in vivo. Si bien las técnicas que utilizan hepatocitos primarios chapados preservan este sistema, el cultivo de células aisladas durante largos períodos de tiempo resulta en una pérdida del perfil de expresión génica in vivo que estaba presente en las células cuando todavía vivían dentro del animal ^8,9. El siguiente protocolo describe un método para aislar los hepatocitos primarios y evaluar su capacidad de β-oxidación de ácidos grasos inmediatamente después del aislamiento y en suspensión, utilizando [^1-14C]ácido palmítico. El ensayo se basa en la medición de la radiactividad asociada con los metabolitos solubles en ácido (MAPE) o productos, como el acetil-CoA, producidos por la β-oxidación del ácido palmítico [^1-14C]^10,11.

Todos los procedimientos experimentales en ratones (C57BL / 6J, machos, 9-11 semanas de edad) fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia Occidental.

1. Aislamiento de hepatocitos

1. Preparación
   1. En los días previos al aislamiento de hepatocitos, preparar los tampones y medios de cultivo celular enumerados en la Tabla 1. Configure un baño de agua con la temperatura establecida a 37 ° C cerca de donde se realizará la cirugía.
   2. El día del aislamiento de hepatocitos, bajo una campana de flujo laminar, transfiera 35 ml de Buffer 1 a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml y 70 ml de tampón 2 a un vaso de precipitados o botella estéril de 100 ml.
   3. Añadir antibióticos gentamicina (50 μg/ml) y penicilina/estreptomicina (1x) a ambos tampones.
   4. Transfiera 20 ml de Buffer 2 como se preparó en el paso 1.1.3 a una placa de cultivo celular de 100 mm y colóquela en hielo.
   5. Transfiera los 50 ml restantes de Buffer 2 a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml. Coloque los tubos de 50 ml que contienen los Tampones 1 y 2 suplementados con antibióticos en un baño de agua a 37 ° C y déjelos calentarse durante al menos 15 minutos antes de comenzar la perfusión.
      NOTA: Si realiza múltiples aislamientos de hepatocitos en una sesión, aumente el número de alícuotas suplementadas con antibióticos de Buffers 1 y 2 para prepararse en consecuencia.
   6. Descongele una alícuota de solución de colagenasa y manténgala en hielo.
      NOTA: Si se almacena adecuadamente, no hay una pérdida significativa de la actividad enzimática en las soluciones de colagenasa congeladas y descongeladas hasta 3 veces y utilizadas dentro de las 3 semanas posteriores a la preparación.
   7. Preparar el instrumental quirúrgico y la bomba peristáltica. Esterilizar las líneas de la bomba peristáltica haciendo circular 15 mL de etanol al 70%, seguido de 15 mL de agua estéril.
   8. Conecte una aguja de 22 G a la línea de salida (Figura 1A). El filtro ahuecado de un catéter funciona bien como conector. Llene las líneas con Buffer 1 e inspeccione las líneas, el conector y la aguja para asegurarse de que no queden atrapadas las burbujas de aire.

Figura 1: Aparato de perfusión e hígado perfundido. (A) Bomba peristáltica con línea de salida conectada a la aguja utilizada para cannular y perfundir el hígado. (B) La canulación exitosa está indicada por el blanqueamiento inmediato y homogéneo del hígado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Perfusión hepática y disociación
   1. Anestesiar a un ratón a través de la inhalación de isoflurano con aire de grado médico como gas portador, utilizando 4% de isoflurano para la inducción y 1,5% de isoflurano para mantener la anestesia. Verificar la profundidad de la anestesia evaluando la pérdida del reflejo del pedal.
   2. Cuando no haya respuesta al pellizco del dedo del pie, coloque al ratón en posición supina sobre una tabla de cirugía, extienda las extremidades y asegúrelas a la tabla con alfileres.
   3. Rocíe generosamente el abdomen y el pecho del ratón con etanol al 70%.
   4. Usando fórceps, levante la piel y la pared abdominal cerca de la base del abdomen y corte lateralmente, a cada lado de la línea media y hasta el diafragma, para exponer los órganos.
   5. Exponga la vena cava inferior (IVC) moviendo los intestinos hacia el lado derecho y volteando suavemente los lóbulos del hígado hacia arriba. Inserte un pequeño objeto cilíndrico, como una tapa de aguja, debajo de la parte posterior del ratón para inclinar ligeramente el IVC y facilitar su canulación (Figura 1B).
   6. Arranque la bomba a la velocidad más baja y, con buffer 1 fluyendo, inserte la aguja en el IVC.
   7. Corte la vena porta para aliviar la presión y permitir el drenaje de sangre y los tampones de perfusión, luego aumente inmediatamente la tasa de flujo a 7 ml / min. Si se hace correctamente, el hígado se blanqueará uniformemente en unos pocos segundos (Figura 1B).
   8. Para obtener resultados más consistentes, mantenga la aguja en posición con la mano durante toda la duración de la perfusión.
   9. Perfundir el hígado con Tampón caliente 1. Para evitar la introducción de burbujas de aire, asegúrese de que la línea insertada en el tubo que contiene Buffer 1 permanezca continuamente sumergida.
   10. Mientras se produce la perfusión, agregue 130 μL de solución de colagenasa a Buffer 2 y mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo o revolviendo con una pipeta serológica de 5 ml o 10 ml.
   11. A medida que el volumen en el tubo que contiene buffer 1 disminuye a aproximadamente 5 mL, agregue lentamente 5 mL de Buffer 2 a Buffer 1 mediante pipeteo en el costado del tubo. El objetivo es evitar la introducción de burbujas de aire en la línea mientras se cambia de Buffer 1 a Buffer 2.
   12. Espere hasta que el volumen disminuya nuevamente a 5 ml y agregue lentamente otros 5 ml de buffer 2. Repite una vez más. A medida que el Buffer 2 reemplaza al Buffer 1 y comienza la disociación, el hígado se hinchará.
   13. Agregue el Buffer 2 restante al tubo que originalmente contenía el Buffer 1. Detenga la perfusión cuando queden aproximadamente 5-10 ml de Buffer 2 en el tubo.
       NOTA: Mientras que Buffer 2 está perfundiendo el hígado, la vena porta se puede sujetar intermitentemente con fórceps durante 5 s. Este paso es opcional, pero el aumento resultante de la presión en todo el hígado puede mejorar su disociación y, por lo tanto, el rendimiento final de los hepatocitos.
   14. Extirpe cuidadosamente el hígado y transfiéralo al plato de cultivo de 100 mm que contiene los 20 ml de Buffer 2 helado reservados en el paso 1.1.4.
   15. Debajo de la capucha de flujo laminar, rompa suavemente el hígado con tijeras quirúrgicas y pinzas.
   16. Agregue aproximadamente 20 ml de M199 helado a la suspensión de hepatocitos y filtre a través de un colador de células de 100 μm utilizando el émbolo de una jeringa para promover suavemente la liberación de hepatocitos adicionales de piezas hepáticas más grandes.
   17. Lave la placa de cultivo de 100 mm y el colador celular con M199 adicional hasta que el tubo de recolección esté lleno.
   18. Centrifugar la suspensión a 50 x g durante 2 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet de hepatocitos en 30 ml de frío M199 girando.
   19. Pellet los hepatocitos como se menciona en el paso 1.2.18. Repita el lavado una vez más.
   20. Resuspend los hepatocitos en 10 mL de M199 caliente y determinar la viabilidad y el rendimiento utilizando el método de exclusión de azul tripano y un hemocitómetro¹².
   21. Diluir las células en M199 calentadas a 37 ºC a una concentración final de 1,0 x 10⁶ células viables/ml e iniciar inmediatamente el ensayo.

2. Ensayo de β oxidación de ácidos grasos

NOTA: El ensayo se realiza por triplicado, y cada mezcla de reacción contiene 750.000 células, 1,35 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), 100 μM de ácido palmítico y 0,4 μCi [^1-14C]de ácido palmítico en un volumen final de 2 ml.
PRECAUCIÓN: Los compuestos radiactivos son peligrosos. Comprar, manipular, almacenar y desechar material radiactivo de acuerdo con las regulaciones institucionales, estatales y federales.

1. Preparación
   1. En los días previos al ensayo, preparar las soluciones de ácido palmítico y BSA (Tabla 1) y almacenarlas a -20 °C.
   2. El día del ensayo, complete los pasos 2.1.3-2.1.9 antes de comenzar la perfusión hepática.
   3. Descongele las soluciones de ácido palmítico y BSA. Prepare la mezcla de sustrato para múltiples reacciones más un exceso del 20% al 30%, con una configuración de ensayo típica que se muestra en la Tabla 2.
   4. Alícuota de 13,5 μL de solución de BSA por reacción en un tubo de microcentrífuga y caliente a 41 °C, luego agregue 1 μL de la solución de ácido palmítico de 200 mM (BSA: relación molar de ácido palmítico = 1:5) por reacción.
      NOTA: Es preferible dispensar soluciones preparadas con disolventes orgánicos, como las soluciones de ácido palmítico radiactivo y no radiactivo, con una pipeta de desplazamiento positivo y puntas apropiadas.
   5. Vórtice vigorosamente e incube a 41 °C para facilitar la formación del ácido palmítico soluble: complejo BSA. Vórtice ocasionalmente durante el período de incubación.
   6. La mezcla aparecerá inicialmente turbia, pero se aclarará por completo después de 20-30 min de incubación a 41 °C. Manténgalo a 41 °C hasta que esté listo para iniciar las reacciones.
   7. Alícuota de 133 μL de ácido perclórico 1 M en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para detener las reacciones.
      PRECAUCIÓN: El ácido perclórico es un ácido fuerte y un oxidante fuerte. Se requiere un equipo de protección adecuado para manejar este compuesto.
   8. Alícuota 485,5 μL de M199 por reacción en un tubo y manténgala a 37 °C para diluir el BSA radiactivo: complejo de ácido palmítico preparado en los pasos 2.1.4-2.1.6 antes de iniciar las reacciones.
   9. Dispensar 750 μL de M199 en tantos tubos de fondo redondo de 14 ml como las muestras. Si lo desea, agregue inhibidores de la β oxidación de ácidos grasos, como etomoxir, rotenona y antimicina, incluido un control vehicular (Tabla 2).
   10. Durante los pasos de lavado de hepatocitos, 10-15 min antes de comenzar las reacciones, transfiera los tubos preparados en el paso 2.1.9 a un baño de agua agitado a 37 ° C y agitando a 180-200 rpm.
2. Iniciar, detener y analizar las reacciones de β oxidación de ácidos grasos
   1. Si la viabilidad de los hepatocitos es aceptable (típicamente ≥ 75%, Figura 2), para cada reacción, transfiera 0,8 μL de [1-14 C]ácido palmítico (0,5 mCi/mL) al tubo de la microcentrífuga que contiene el BSA clarificado: solución de ácido palmítico (pasos 2.1.4-2.1.6). Vórtice y vuelva al baño de agua a 41 °C.
   2. Para equilibrar los hepatocitos a 37 °C y preincubarlos con inhibidores (si están presentes), inmediatamente después de la resuspensión final de hepatocitos (paso 1.2.21), transfiera 750 μL de la suspensión de hepatocitos con una pipeta de 1 ml a cada uno de los tubos de fondo redondo de 14 ml en el baño de agua agitadora (pasos 2.1.9-2.1.10) y vórtice brevemente a baja velocidad para mezclar.
   3. Escalona cada adición por 30 s e incuba durante 15 min. Para guardar una muestra para la determinación de proteínas, transfiera otra alícuota de hepatocitos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y gire a 3.000 x g durante 5 min.
      NOTA: Durante la dispensación, la suspensión de hepatocitos debe girarse continuamente o agitarse suavemente con la pipeta dispensadora de 1 ml para evitar la sedimentación y la gran variabilidad en el número de células entre las muestras.
   4. Retire el sobrenadante y guarde el pellet a -80 °C hasta que esté listo para medir la cantidad total de proteína en la muestra para normalizar los resultados (Figura 3).
   5. Mientras los hepatocitos están en preincubación a 37 °C, agregue el complejo radiactivo BSA: ácido palmítico al medio caliente en 2.1.8, y manténgase a 37 ° C hasta que esté listo para comenzar las reacciones. Esta es la mezcla final de sustrato.
   6. Para iniciar las reacciones, retire los hepatocitos del baño de agua y agregue 500 μL de mezcla de sustrato.
   7. Vórtice a baja velocidad durante 5 s para resuspendir completamente las células y volver al baño de agua. Repetir con todas las muestras, escalonando por 30 s.
   8. Incubar durante 15 min. Inicie un conjunto de reacciones y deténgase inmediatamente (consulte los pasos 2.2.10-2.2.11) para determinar la radiactividad de fondo (Tabla 2).
   9. Transfiera las alícuotas duplicadas (200-250 μL) de la mezcla de sustrato sobrante a viales de centelleo de 6 ml y reservar para contar. Utilice estos recuentos para calcular la radiactividad correspondiente al total de nmoles de ácido palmítico disponibles para la oxidación en 500 μL de mezcla de sustrato.
   10. Para detener las reacciones, retire los hepatocitos del baño de agua, resuspenda los hepatocitos por vórtice a velocidad moderada y luego transfiera 400 μL de la suspensión de hepatocitos a los tubos de microcentrífuga que contienen ácido perclórico.
   11. Tapa inmediatamente los tubos. Repita esta secuencia para todas las muestras, escalonando en 30 s.
   12. Vórtice vigorosamente los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y hágalos girar por los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 13.000 x g durante 10 minutos.
   13. Transfiera 300 μL del sobrenadante a un vial de centelleo de 6 ml, agregue 4 ml de líquido de centelleo y cuente la radiactividad en las muestras y las alícuotas de la mezcla de sustrato (paso 2.2.9) en un contador de centelleo.
       PRECAUCIÓN: Después de la centrifugación, abra los tubos bajo una campana de humos para evitar respirar los ¹⁴C-CO₂ producidos por la oxidación completa de ¹⁴C-acetil-CoA generados por el ácido graso β-oxidación y liberados por las condiciones ácidas.

Tabla 1: Tampones, medios y otras soluciones necesarias para el aislamiento de hepatocitos y el ensayo de β oxidación de ácidos grasos

Tabla 2: Ejemplo de la configuración experimental para una suspensión de hepatocitos ensayada por triplicado en presencia y ausencia de etomoxir.

La perfusión hepática descrita aquí típicamente produce 30-40 millones de células / hígado con una viabilidad promedio del 80%, según lo estimado por la exclusión del azul de tripano (Figura 2). La concentración típica de glucosa en el tampón Krebs-Henseleit (KHB), que se utiliza para preparar los tampones de perfusión 1 y 2, es de 11 mM. Al medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos aislados de ratones en ayunas, la concentración de glucosa en el KHB se puede reducir para representar mejor el estado de ayuno. Como se muestra en la Figura 2, la reducción de la concentración de glucosa a 5,6 mM no tiene ningún efecto negativo en el rendimiento o la viabilidad de los hepatocitos.

La Tabla 2 muestra una configuración experimental típica para una suspensión de hepatocitos ensayada por triplicado en presencia y ausencia de etomoxir, un potente inhibidor de CPT1 y, por lo tanto, oxidación de ácidos grasos mitocondriales10,13. En presencia de este u otros inhibidores de la oxidación de ácidos grasos mitocondriales, cualquier producto residual marcado con 14C generado por la oxidación del ácido palmítico [1-14C] se puede atribuir al primer ciclo de β-oxidación en los peroxisomas. Así, la contribución de la oxidación de ácidos grasos mitocondriales a la β-oxidación total de ácidos grasos puede calcularse como la diferencia entre la oxidación total (-etomoxir) y peroxisomal (+ etomoxir) de ácidos grasos 7,14,15 (Figura 3).

Para los hepatocitos, más del 95% de la radiactividad asociada con los productos de la β-oxidación del ácido [1-14C]palmítico se encuentra en la MAPE, y el resto se libera como 14C-CO210. Los recuentos por minuto (CPM) asociados con la radiactividad de fondo varían con el lote de [1-14C]ácido palmítico. Sin embargo, siguen siendo significativamente más bajos que el CPM obtenido en muestras permitidas para incubar con la mezcla de sustrato durante 15 min (Figura 3A). Como era de esperar, los hepatocitos aislados de ratones en ayunas muestran un aumento robusto en las tasas de β-oxidación de ácidos grasos mitocondriales y peroxisomales, consistente con la activación conocida de estas vías 16,17,18,19.

Figura 2: Viabilidad y rendimiento de los hepatocitos aislados mediante el procedimiento aquí descrito. Los hepatocitos se aislaron de ratones machos alimentados ad libitum o ayunados durante la noche durante 16-18 h, con libre acceso al agua. (A) Viabilidad de los hepatocitos y (B) rendimiento por hígado. Los datos se informan como la media (barras) de las mediciones en preparaciones de hepatocitos individuales (círculos) ± SEM. Los hepatocitos aislados de ratones alimentados y en ayunas se compararon utilizando una prueba t de Student de dos colas no apareadas. * p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Capacidad de β-oxidación de ácidos grasos en hepatocitos aislados de ratones machos alimentados y en ayunas y ensayados en suspensión. Los hepatocitos recién aislados fueron preincubados con etomoxir (45 μM, +Eto) o DMSO (vehículo, -Eto) antes de la adición de la mezcla de sustrato. (A) CPM total introducido en cada ensayo y recuperado en la fracción ASM de reacciones establecidas para estimar la radiactividad de fondo, total (-Eto), peroxisomal (+Eto) y ácido graso mitocondrial β-oxidación. Estos datos se muestran antes de que se aplicara cualquier corrección (para el fondo, el número de células o los niveles de proteínas) o cualquier otro cálculo. (B) Datos en (A) corregidos para el fondo, el volumen total del ensayo, normalizado a 1 millón de células viables y expresado como la velocidad a la que el ácido palmítico se oxida en hepatocitos aislados de ratones alimentados y en ayunas. (C) Proteína total correspondiente a los 750.000 hepatocitos/ensayo estimados utilizados. (D) Datos en (A) corregidos como en (B) pero normalizados a mg de proteína. Los datos se informan como la media (barras) de las mediciones en preparaciones de hepatocitos individuales (círculos) ± SEM. Los hepatocitos aislados de ratones alimentados y en ayunas se compararon utilizando una prueba t de Student de dos colas no apareadas. * p < 0,05; ** p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.