La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica esencial responsable de generar energía en muchos tipos de células diferentes, incluidos los hepatocitos. Aquí, describimos un método para medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios recién aislados utilizando ácido palmítico marcado con 14C.
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Artículo de método
Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados
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En este artículo
Resumen
Resumen
La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica clave para satisfacer las demandas de energía del hígado y proporcionar sustratos y cofactores para procesos adicionales, como la cetogénesis y la gluconeogénesis, que son esenciales para mantener la homeostasis de la glucosa de todo el cuerpo y apoyar la función de los órganos extrahepáticos en el estado de ayuno. La β oxidación de ácidos grasos ocurre dentro de las mitocondrias y los peroxisomas y se regula a través de múltiples mecanismos, incluida la absorción y activación de ácidos grasos, los niveles de expresión enzimática y la disponibilidad de cofactores como la coenzima A y NAD +. En los ensayos que miden la β oxidación de ácidos grasos en homogeneizados hepáticos, la lisis celular y la adición común de niveles suprafisiológicos de cofactores enmascaran los efectos de estos mecanismos reguladores. Además, la integridad de los orgánulos en los homogeneizados es difícil de controlar y puede variar significativamente entre preparaciones. La medición de la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios intactos supera las trampas anteriores. Este protocolo describe un método para la medición de la β oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos primarios de ratón recién aislados incubados con ácido palmítico marcado con 14C. Al evitar horas o días de cultivo, este método tiene la ventaja de preservar mejor los niveles de expresión de proteínas y la actividad de la vía metabólica del hígado original, incluida la activación de la β oxidación de ácidos grasos observada en hepatocitos aislados de ratones en ayunas en comparación con ratones alimentados.
Introducción
La β-oxidación de ácidos grasos es un proceso esencial en el metabolismo de los lípidos, proporcionando una vía catabólica para equilibrar la síntesis de ácidos grasos y la ingesta de la dieta. Este proceso genera energía para múltiples órganos, incluidos el músculo cardíaco, la corteza renal y el hígado en ayunas, y utiliza ácidos grasos obtenidos de la dieta, la lipólisis del tejido adiposo y las reservas internas de triglicéridos 1,2.
La oxidación de los ácidos grasos a través de la vía de β-oxidación da como resultado el acortamiento secuencial de la cadena de acilo graso por do....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales en ratones (C57BL / 6J, machos, 9-11 semanas de edad) fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia Occidental.
1. Aislamiento de hepatocitos
- Preparación
- En los días previos al aislamiento de hepatocitos, preparar los tampones y medios de cultivo celular enumerados en la Tabla 1. Configure un baño de agua con la temperatura establecida a 37 ° C cerca de donde se realizará la cirugía.
- El día del aislamiento de hepatocitos, bajo una campana de flujo laminar, transfiera 35 ml de Buffer 1 a ....
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Resultados
La perfusión hepática descrita aquí típicamente produce 30-40 millones de células / hígado con una viabilidad promedio del 80%, según lo estimado por la exclusión del azul de tripano (Figura 2). La concentración típica de glucosa en el tampón Krebs-Henseleit (KHB), que se utiliza para preparar los tampones de perfusión 1 y 2, es de 11 mM. Al medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos aislados de ratones en ayunas, la concentración de glucosa en el KHB se puede reducir para represen.......
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Discusión
Durante la perfusión hepática, es fundamental evitar la introducción de burbujas de aire, ya que bloquean los microcapilarios en el hígado, impidiendo o restringiendo la circulación tampón y disminuyendo en general el rendimiento y la viabilidad de los hepatocitos20,21. Las precauciones, como inspeccionar de cerca la línea de entrada llena de tampón antes de la canulación del IVC y evitar levantar la línea de entrada del tubo que contiene el tampón 1 para cambiar.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención R35GM119528 de los Institutos Nacionales de Salud a Roberta Leonardi.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (R)-(+)-Sal sódica de Etomoxir | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Ácido palmítico, 50– 60 mCi/mmol, 0,5 mCi/mL | Productos químicos radiomarcados americanos | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, estériles | Corning | 25060CI | |
| 10 y micro; L capilares/pistones desechables para pipeta de desplazamiento positivo | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µ L, 200 y micro; L, y 10 y micro; L pipetas y puntas | |||
| mL, 10 mL y 25 mL pipetas serológicas | |||
| 50 mL tubos de centrífuga estériles | CellTreat | 229421 | |
| 70% Ácido perclórico | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, sin ácidos grasos | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihidratado | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucosa | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Sistema de filtro, 0.22 μ m Filtro PES, 500 mL, CellTreat estéril | 229707 | ||
| sulfato de gentamicina | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, viales de centelleo de 6,5 mL | Hemocitómetro | ||
| Agujas hipodérmicas 22 G, 1,5 en | BD Biosciences | 305156 | |
| KCl Fisher | Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Grado de investigación | MilliporeSigma | 5401119001 | Mezcla definida de colagenasa purificada I y II con una concentración media de termolisina |
| M199 medio | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahidratado | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrífuga | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Tijeras de microdisección | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | ||
| Ácido palmítico | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicilina/estreptomicina (100x) | Gibco | 15140122 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Pipeta de desplazamiento positivo MR-10, 10 y micro; L | Mettler Toledo 17008575 | ||
| Centrífuga refrigerada con insertos para tubos cónicos de 50 mL | Eppendorf | 5810 R | |
| Fondo redondo, 14 mL, tubos de ensayo para cultivo de polipropileno | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Contador de centelleo | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| Cóctel ScintiVerse BD | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Baño de agua agitado, 30 L de capacidad | New Brunswick Scientific | Modelo G76 | |
| Filtros de células estériles, 100 y micro; m | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Pinzas de vendaje para el pulgar | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Bomba peristáltica de flujo variable | Fisher Scientific | 138762 | |
| Baños de agua, 2– Capacidad de |
Referencias
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (....
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Reimpresiones y permisos
