Producción de ratón humanizado mediante injerto de cápsula renal tímica, inyección de células CD34+ y administración de citocinas

Summary

Los modelos de ratón humanizados proporcionan una representación más precisa del microambiente inmunitario humano. Este manuscrito describe el proceso en el que se crean estos modelos a través de un injerto renal de timo humano, la inyección de células CD34⁺ humanas y la administración dirigida de transgenes de citocinas humanas para promover la proliferación y diferenciación de células CD34⁺ .

Abstract

Los modelos animales proporcionan una traducción vital entre la investigación biomédica in vitro e in vivo . Los modelos de ratón humanizados proporcionan un puente en la representación de los sistemas humanos, lo que permite un estudio más preciso de la patogénesis, los biomarcadores y muchas otras preguntas científicas. En este método descrito, a los ratones inmunodeficientes NOD-scid IL2Rγnull (NSG) se les implanta timo autólogo, se les inyectan células CD34⁺ derivadas del hígado seguidas de una serie de entregas de citocinas inyectadas. A diferencia de otros modelos de naturaleza similar, el modelo descrito aquí promueve una mejor reconstitución de las células inmunitarias mediante la administración de citocinas y factores de crecimiento a través de transgenes codificados en vectores basados en ADN AAV8 o pMV101. Además, ofrece estabilidad a largo plazo con ratones reconstituidos que tienen una vida media de 30 semanas después de las inyecciones de CD34⁺ . A través de este modelo, esperamos proporcionar un método estable e impactante para estudiar la inmunoterapia y la enfermedad humana en un modelo murino, demostrando así la necesidad de modelos preclínicos predictivos.

Introduction

Si bien los modelos animales han creado una comprensión más profunda de los sistemas celulares y moleculares, el desafío sigue siendo dilucidar las complejidades de los sistemas específicos de la especie, como la inmunidad, la fisiología y otras áreas de patología. Los primates no humanos (NHP), como los chimpancés, se han utilizado históricamente para compensar las lagunas en la investigación de modelos; sin embargo, el modelo NHP puede ser bastante costoso e inaccesible, sobre todo porque su uso ha sido prohibido en Europa¹.

Después de un procedimiento de injerto exitoso, el sistem....

Protocol

Todos los protocolos que involucran el uso de animales son monitoreados de cerca por el Comité Institucional de Usuarios y Cuidado de Animales (IACUC) del Instituto Wistar. El laboratorio se adhiere a las pautas establecidas por este comité y el veterinario tratante para garantizar la salud, la seguridad y el bienestar de los animales involucrados. Antes de seguir este protocolo, se requiere la aprobación del veterinario y de la IACUC, y las personas pueden tener variaciones en las técnicas quirúrgicas específicas y el manejo de los animales en comparación con el protocolo según el consejo de las partes involucradas en el bienestar an....

Results

Después de una cirugía exitosa y las inyecciones postoperatorias adecuadas, la diferenciación de CD34⁺ se puede confirmar mediante citometría de flujo. Aproximadamente 8 semanas después de la cirugía, los ratones se desangran en preparación para el FACS, que se repite cada 2 semanas hasta que se alcanza un umbral específico de células inmunitarias humanas, como se describió anteriormente¹⁰. En resumen, se recolectaron 100 mL de sangre en tubos de recolección de sangre recubiertos con li.......

Discussion

En este manuscrito se describe la generación de ratones humanizados mediante timo fetal humano injertado bajo la cápsula renal y la posterior inyección de CD34⁺ para recrear un sistema inmunitario humano.

Si bien el protocolo funciona para crear el mejor modelo posible, ciertos pasos son esenciales para la viabilidad. Por ejemplo, durante el aislamiento de CD34⁺ , es esencial que alguien que mire a través del microscopio pueda identificar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampón de lisis ACK	Life Technologies Corporation
BD Microcontenedor	BD		de extracción de sangre
Busulfan	Sigma	B2635-25g	Fármaco irradiante; sensible a la luz
Microperlas CD34	Miltenyi Biotec	130-046-702	kit de perlas de anticuerpos; almacenado a 4 & grados; C
Citocina personalizada CKIT	Aldevron		; almacenada a -20 ° C
Colagenasa/Dispasa	Roche Diagnostics 11097113001		almacenado a 4 & grados; C
FcR Reactivo bloqueante	Miltenyi Biotec	130-046-702 kit de	perlas de anticuerpos; almacenado a 4 & grados; C
Tejido fetal (hígado y timo)	Recursos		Entregado el mismo día o toda la noche
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	Almacenado a temperatura ambiente
Citocina de 125964 FLT3	Aldevron		; almacenado a -20 °C; C
Pinzas	Varios	Varios Aguja
jeringa Hamilton	Varios	Varios	22 G; 3 puntos; 2"
de longitud Hemostáticos	Varios	Varios
MS	Miltenyi Biotec	130-042-201	separador magnético
PBS	Gibco	14190-136	Almacenado a temperatura ambiente
Primocin	Antibiótico Invivogen	amt-pm1	; almacenado a 4 & grados; C
RPMI	Corning	10-040-CM	Almacenado a 4 ° C
SCF	Aldevron	125962	citocina; almacenada a -20 &° C
Tijeras quirúrgicas	Varios	Varios
THPO	Aldevron	125963	citocinas; almacenado a -20 & grados; C
Placa de Petri tratada con tejido	Corning	430167
VetBond pegamento	3M	1469SB	Pegamento
Visorb Sutura	Stoelting Co	5046	tamaño 4, corte de 19 mm