Reprogramación directa de fibroblastos de ratón en melanocitos

Resumen

Aquí, describimos un sistema de reprogramación directa optimizado para melanocitos y un sistema de empaquetado de virus concentrado de alta eficiencia que garantiza una reprogramación directa sin problemas.

Resumen

La pérdida de función de los melanocitos conduce al vitiligo, que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Actualmente, no existe un tratamiento efectivo a largo plazo para el vitiligo. Por lo tanto, es imperativo desarrollar un tratamiento conveniente y efectivo para el vitiligo. La tecnología de medicina regenerativa para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos parece ser un nuevo tratamiento prometedor para el vitiligo. Esto implica la reprogramación directa de las células de la piel del paciente en melanocitos funcionales para ayudar a mejorar la pérdida de melanocitos en pacientes con vitiligo. Sin embargo, este método debe probarse primero en ratones. Aunque la reprogramación directa es ampliamente utilizada, no existe un protocolo claro para la reprogramación directa en melanocitos. Además, el número de factores de transcripción disponibles es abrumador.

Aquí, se presenta un protocolo de sistema de empaquetado de lentivirus concentrados para producir factores de transcripción seleccionados para reprogramar células de la piel a melanocitos, incluidos Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 y Snai2. Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) se infectaron con el lentivirus concentrado para todos estos factores de transcripción para la reprogramación directa de los MEF en melanocitos inducidos (iMels) in vitro. Además, se examinaron estos factores de transcripción y se optimizó el sistema para la reprogramación directa a los melanocitos. La expresión de los marcadores característicos de melanina en iMels a nivel de gen o proteína aumentó significativamente. Estos resultados sugieren que la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos podría ser una nueva estrategia terapéutica exitosa para el vitiligo y confirmar el mecanismo de desarrollo de melanocitos, que proporcionará la base para una mayor reprogramación directa de fibroblastos en melanocitos in vivo.

Introducción

El vitiligo es una enfermedad de la piel que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Por diversas razones, incluyendo anomalías metabólicas, estrés oxidativo, generación de mediadores inflamatorios, desprendimiento celular y respuesta autoinmune, los melanocitos funcionales se pierden y se detiene la secreción de melanina, lo que lleva al desarrollo de vitiligo ^1,2. Esta condición ocurre ampliamente y es particularmente problemática en la cara. El tratamiento principal es el uso sistémico de corticosteroides e inmunomoduladores. La fototerapia se puede utilizar para enfermedades....

Protocolo

Este trabajo fue aprobado por el Comité de Manejo y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Los experimentos se realizaron en estricta conformidad con los estándares establecidos por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). No hubo experimentos con humanos, por lo que este trabajo no necesitó la aprobación del comité de ética de investigación humana. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los reactivos.

1. Construcción de un sistema concentrado de envasado de lentivirus para factores de ....

Resultados

Este artículo incluye los protocolos de un sistema concentrado de empaquetado de lentivirus para producir lentivirus de factores de transcripción para la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos y protocolos para la detección de factores de transcripción y reprogramación directa de melanocitos a partir de MEFs.

El éxito de la producción concentrada de lentivirus se evaluó observando la intensidad de fluorescencia de GFP (Figura 1A) o por citometría de .......

Discusión

La calidad del virus es crucial para el éxito de la reprogramación directa a los melanocitos en este protocolo. El método de envasado y concentración de virus en este protocolo es simple y fácil de repetir y no depende de ningún otro reactivo concentrado auxiliar. Este protocolo se puede seguir con éxito en la mayoría de los laboratorios. Para garantizar la calidad del virus concentrado, los siguientes puntos necesitan una atención especial. Uno es el estado celular de HEK-293T. Aunque las células HEK-293T son células in.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-062	almacenado a -20 ° C
0,45 μ Filtro	M Millipore	SLHVR33RB
5 mL poliestireno tubo de fondo redondo	Falcon	352052
95%/100% etanol	LANBAO	210106	Almacenado en RT
Adenina	Sigma	A2786	Concentración de existencias 40 mg/mL Concentración final 24 µ g/mL
Alexa Fluor 555 Cabra anti-Ratón IgG2a	Invitrogen	A21137	Dilución de 1:500 para usar
Antibióticos(Pluma/Estreptococo)	Gibco	15140-122	Almacenado a -20 ° C
Anticuerpo anti-TRP1/TYRP1	Millipore	MABC592	Huésped/Isotipo: Ratón IgG2a Reactividad de la especie: Ratón/Humano Dilución de 1:200 para utilizar
Anticuerpo Anti-TRP2/DCT	Abcam	ab74073	Huésped/Isotipo: Conejo IgG Reactividad de la especie: Ratón/Humano Dilución de 1:200 para utilizar
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Concentración de stock 10 mM Final concentración 3 μ M
Toxina del cólera	Sigma	C8052	Concentración de existencias 0,3 mg/mL Concentración final 20 pM
Cy3 Cabra anti-Conejo IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	111-165-144	Dilución de 1:500 para usar
DMEM (Alta glucosa)	HyClone	SH30243.01	Almacenado a 4 & grados; C
DMSO	Sigma	D2650	almacenado en RT
FBS	Gibco	10270-106	almacenado a -20 ° C Inactivado por calor antes de usar
Gelatina	Sigma	G9391	almacenada en
plásmidos RT GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 y Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Almacenado a -20 ° C
Hematoxilina	Abcam	ab220365	Almacenado en RT
Human EDN3	Péptido americano	88-5-10A	Concentración de existencias 100 μ M Concentración final 0,1 μ M
Hidrocortisona	Sigma	H0888	Concentración de existencias 100 µ g/mL Concentración final 0,5 y micro; g/mL
L-DOPA	Sigma	D9628	almacenado en RT
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Reactivo de transfección, almacenado a 4 & deg; C
Kit de tinción Masson-Fontana	Solarbio	G2032	Almacenado a 4 & grados; C
Bálsamo neutro	Solarbio	G8590	Almacenado a 4 & grados; C
Paraformaldehído	Sigma	P6148	Almacenado en RT
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Almacenado en RT
Phorbol 12-miristato 13-acetato (TPA)	Sigma	P8139	Concentración de stock 1 mM Concentración final 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	reactivo de transfección polimérica catiónica; Concentración de existencias 8 μ g/µ L Concentración final 4 ng/µ L
Puromicina	Gibco	A11138-03	Almacenado a -20 ° C
BFGF humano recombinante	Invitrogen	13256-029 Concentración de	existencias 4 μ g/mL Concentración final 10 ng/
mL Insulina humana recombinante	Sigma	I3536	Concentración de existencias 10 mg/mL Concentración final 5 µ g/mL
SCF humano recombinante	R& D	255-SC-010 Concentración de	existencias 200 μ g/mL Concentración final 100 ng/mL
RPMI-1640	Gibco	11875-093	Almacenado a 4 & grados; C
Xileno	Sigma	1330-20-7	almacenado en RT