Artículo de método

Fabricación microfluídica de microcápsulas core-shell que transportan esferoides de células madre pluripotentes humanas

DOI:

10.3791/62944

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13 de octubre de 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este artículo describe la encapsulación de células madre pluripotentes humanas (hPSC) utilizando un dispositivo de enfoque de flujo coaxial. Demostramos que esta tecnología de encapsulación microfluídica permite la formación eficiente de esferoides hPSC.

Resumen

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Los cultivos tridimensionales (3D) o esferoides de células madre pluripotentes humanas (hPSC) ofrecen los beneficios de mejorar los resultados de diferenciación y escalabilidad. En este artículo, describimos una estrategia para la formación robusta y reproducible de esferoides hPSC donde se utiliza un dispositivo de enfoque de flujo coaxial para atrapar hPSC dentro de microcápsulas de núcleo-caparazón. La solución central contenía suspensión unicelular de hPSCs y se hizo viscosa mediante la incorporación de poli(etilenglicol) de alto peso molecular (PEG) y medios de gradiente de densidad. La corriente de concha comprendía PEG-4 brazo-maleimida o PEG-4-Mal y fluía a lo largo de la corriente central hacia dos uniones de petróleo consecutivas. La formación de gotas ocurrió en la primera unión de aceite con una solución de cáscara que se envuelve alrededor del núcleo. La reticulación química de la cáscara se produjo en la segunda unión de aceite mediante la introducción de un reticulador de di-tiol (1,4-ditiotreitol o TDT) a estas gotas. El reticulante reacciona con los grupos funcionales maleimida a través de la química del clic, lo que resulta en la formación de una capa de hidrogel alrededor de las microcápsulas. Nuestra tecnología de encapsulación produjo cápsulas de 400 μm de diámetro a una velocidad de 10 cápsulas por segundo. Las cápsulas resultantes tenían una cubierta de hidrogel y un núcleo acuoso que permitía a las células individuales ensamblarse rápidamente en agregados y formar esferoides. El proceso de encapsulación no afectó negativamente la viabilidad de las hPSC, observándose una viabilidad del >95% 3 días después de la encapsulación. A modo de comparación, las hPSC encapsuladas en micropartículas de gel sólido (sin un núcleo acuoso) no formaron esferoides y tuvieron una viabilidad del <50% 3 días después de la encapsulación. La formación de esferoides de hPSC dentro de las microcápsulas de la cáscara del núcleo ocurrió dentro de las 48 h posteriores a la encapsulación, siendo el diámetro del esferoide una función de la densidad de inoculación celular. En general, la tecnología de encapsulación microfluídica descrita en este protocolo era adecuada para la encapsulación de hPSC y la formación de esferoides.

Introducción

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Existe un interés considerable en los cultivos 3D de células madre pluripotentes humanas (hPSC) debido a la mejora de la pluripotencia y el potencial de diferenciación que ofrece este formato de cultivo 1,2,3. Las hPSC se forman típicamente en esferoides u otros formatos de cultivo 3D por medio de biorreactores, micropocillos, hidrogeles y andamios poliméricos 4,5,6. La encapsulación ofrece otro medio para organizar hPSC individuales en esferoides. Una vez encapsulados, los esferoide....

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Protocolo

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1. Fabricación del dispositivo

  1. Realice los diseños para el dispositivo de microencapsulación y el dispositivo de disociación utilizando el software CAD10,11.
  2. Spin-coat las tres capas de fotorresisten SU-8 secuencialmente sobre una oblea de silicio (Figura 2A) para lograr estructuras con las alturas deseadas: 60, 100 y 150 μm.
    NOTA: El proceso para los moldes superior e inferior es idéntico.
    1. Recubre una oblea de silicio limpia de 10 cm con fotorresistencia negativa SU-8 2025 a 1.100 rpm para crear la primera capa de 60 μm. Después de hornear suavement....

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Resultados

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Al seguir el protocolo mencionado anteriormente, el lector podrá fabricar dispositivos microfluídicos y producir microcápsulas portadoras de células. La Figura 3A muestra ejemplos de microcápsulas óptimas y subóptimas fabricadas mediante la generación de gotas microfluídicas. Diferentes formulaciones de PEG-4-Mal dieron como resultado cápsulas de diferentes morfologías: las cápsulas arrugadas se asociaron con una gelificación deficiente, baja integridad mecánica y no resistieron el cultivo e.......

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Discusión

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El proceso de encapsulación descrito aquí da como resultado la formación reproducible de esferoides hPSC. El formato de microcápsula facilita la dispensación de esferoides en pozos de una placa de microtitulación para experimentos destinados a mejorar / optimizar los protocolos de diferenciación o probar terapias. Los esferoides de células madre encapsuladas también se pueden usar en cultivos en suspensiones donde la cubierta de hidrogel protege las células contra el daño inducido por el cizallamiento7<.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado en parte por las subvenciones del Centro de Medicina Regenerativa de Mayo Clinic, la Fundación J. W. Kieckhefer, la Fundación Al Nahyan, Medicina Regenerativa de Minnesota (RMM 101617 TR 004) y los NIH (DK107255).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,22 y micro; m Filtros de jeringaGenesee Scientific25-244
Jeringa de 1 ml punta Luer-LockBD 309628
1x DPBSCorning23220003
maleimida PEG de 4 brazos, 10kDaLaysan Inc.164-68
Jeringa de 5 ml punta Luer-LockBD309646
6 POCILLOS PLACA NO TRATADAEE. UU. ScientificCC7672-7506
Paquete Aplicador Aquapel Tratamientode vidrio Aquapel47100
Software CADAutodesk AutoCADv2020
CELL STRAINER 100 µ m tamaño de porocardinal335583
ClorotrimetilsilanoAldrich386529-100mL
Countess II FL Contador de células automatizadoTecnología LifeA27974
Placa calefactora digital Placadatos
Mezclador de vórtice digitalFisher Scientific215370
Agua destiladaGibco15230-162
Ditiotheritol (DTT)SigmaD0632-10G
DMEM/F12 mediagibco11320-033
Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicosFisher scientific14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrífugaen vivo13-100-675
HERACELL VIOS 160i Incubadora de CO2Thermo Scientific50144906
Microscopio Motorizado de Fluorescencia InvertidaOlympusOlympus IX83
Laurell SpinCoaters Laurell TechnologiesWS-650MZ-23NPPB
Kit de tinción de mamíferos vivos/muertosFisherL3224
Grapas decinta mágica483535
Micro Tubos médicos (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)Scientific Commodities, IncBB31695-PE/2
Micro barra agitadoraDaigger ScientificEF3288E
MilliporePinzas de filtro SigmaFisher scientificXX6200006P
Aceite mineralSigmaM8410-1L
mTeSR 1 Medio basalTECNOLOGÍA DE CÉLULAS MADRE85850
Agujas-Acero inoxidable  Calibre 14Suministro de CML901-14-025
Agujas-Acero inoxidable   Calibre 15Suministro de CML901-15-050
OptiPrepTECNOLOGÍA STEMCELL7820
HornoThermo ScientificHERA THERM Horno
Penicilina: Estreptomicina (10,000 U/mL de Penicilina G, 10 mg/mL de estreptomicina)Gemini400-109
Petri Plato 150X20 Ventilación estérilSarstedt, Inc.82.1184.500
Sistema de limpieza por plasmaYield Engineering System, Inc.YES-G500
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
Poli(etilenglicol) 35kDaSigma94646-250G-F
Aguja PrecisionGlide 27GBD 305109
Inhibidor de rocas Y-27632 dihidrocloruroSELLECK CHEMS1049-10mg
Oblea de silicio 100mmOblea Universitaria452
Vidrio deslizante (75 mm y agudo; 25 mm)CardinalHealthM6146
Span 80SigmaS6760-250ML
SpeedMixerThinkyARE-310
Spin-X Filtro de tubo de centrífuga (0.22 y micro; m)Costar8160
SU-8 2025Kayaku Advanced MaterialsY111069 0500L1GL
SU-8 desarrolladorKayaku Advanced MaterialsY020100 4000L1PE
Diseño quirúrgico Royaltek Cuchillas de bisturí quirúrgico de acero inoxidablefisher scientific22-079-684
SYLGARD TM 184 Kit de elastómero de silicona (PDMS)Dow Corning2065622
Bomba de jeringaNew Era Pump System, IncNE-4000
TrietanolaminaSigma-aldrichT58300-25G
TrypLE ExpressGibco12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)Cole-Parmer06419-01
Tubo Tygon (0.04" de diámetro interno x 0.07" de diámetro exterior)Cole-Parmer06419-04
Limpiador ultrasónico FS20DFisher ScientificCPN-962-152R
Desecador de vacíoBel-ArtF42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Microscopio estereoscópico 8x-32xZEISS435421-0000-000
μ PG 101 escritor láserHeidelberg InstrumentsHI 1128
de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
  2. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history,....

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