Fabricación microfluídica de microcápsulas core-shell que transportan esferoides de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Este artículo describe la encapsulación de células madre pluripotentes humanas (hPSC) utilizando un dispositivo de enfoque de flujo coaxial. Demostramos que esta tecnología de encapsulación microfluídica permite la formación eficiente de esferoides hPSC.

Resumen

Los cultivos tridimensionales (3D) o esferoides de células madre pluripotentes humanas (hPSC) ofrecen los beneficios de mejorar los resultados de diferenciación y escalabilidad. En este artículo, describimos una estrategia para la formación robusta y reproducible de esferoides hPSC donde se utiliza un dispositivo de enfoque de flujo coaxial para atrapar hPSC dentro de microcápsulas de núcleo-caparazón. La solución central contenía suspensión unicelular de hPSCs y se hizo viscosa mediante la incorporación de poli(etilenglicol) de alto peso molecular (PEG) y medios de gradiente de densidad. La corriente de concha comprendía PEG-4 brazo-maleimida o PEG-4-Mal y fluía a lo largo de la corriente central hacia dos uniones de petróleo consecutivas. La formación de gotas ocurrió en la primera unión de aceite con una solución de cáscara que se envuelve alrededor del núcleo. La reticulación química de la cáscara se produjo en la segunda unión de aceite mediante la introducción de un reticulador de di-tiol (1,4-ditiotreitol o TDT) a estas gotas. El reticulante reacciona con los grupos funcionales maleimida a través de la química del clic, lo que resulta en la formación de una capa de hidrogel alrededor de las microcápsulas. Nuestra tecnología de encapsulación produjo cápsulas de 400 μm de diámetro a una velocidad de 10 cápsulas por segundo. Las cápsulas resultantes tenían una cubierta de hidrogel y un núcleo acuoso que permitía a las células individuales ensamblarse rápidamente en agregados y formar esferoides. El proceso de encapsulación no afectó negativamente la viabilidad de las hPSC, observándose una viabilidad del >95% 3 días después de la encapsulación. A modo de comparación, las hPSC encapsuladas en micropartículas de gel sólido (sin un núcleo acuoso) no formaron esferoides y tuvieron una viabilidad del <50% 3 días después de la encapsulación. La formación de esferoides de hPSC dentro de las microcápsulas de la cáscara del núcleo ocurrió dentro de las 48 h posteriores a la encapsulación, siendo el diámetro del esferoide una función de la densidad de inoculación celular. En general, la tecnología de encapsulación microfluídica descrita en este protocolo era adecuada para la encapsulación de hPSC y la formación de esferoides.

Introducción

Existe un interés considerable en los cultivos 3D de células madre pluripotentes humanas (hPSC) debido a la mejora de la pluripotencia y el potencial de diferenciación que ofrece este formato de cultivo ^1,2,3. Las hPSC se forman típicamente en esferoides u otros formatos de cultivo 3D por medio de biorreactores, micropocillos, hidrogeles y andamios poliméricos ^4,5,6. La encapsulación ofrece otro medio para organizar hPSC individuales en esferoides. Una vez encapsulados, los esferoides hPSC se pueden manejar con facilidad y transferirse a placas de microtitulación para diferenciación, modelado de enfermedades o experimentos de prueba de drogas. El recubrimiento de hPSCs en una capa de hidrogel también protege las células contra el daño por cizallamiento y permite cultivar esferoides en un biorreactor a altas tasas de agitación⁷.

Nuestra metodología para la encapsulación de células madre evolucionó con el tiempo. En primer lugar, nos centramos en micropartículas sólidas de hidrogel y demostramos la encapsulación y el cultivo exitosos de células madre embrionarias de ratón (mESCs)⁸. Sin embargo, se observó que las células madre embrionarias humanas (hESC) tenían baja viabilidad cuando se encapsulaban en tales micropartículas de hidrogel, presumiblemente debido a la mayor necesidad de que estas células restablecieran los contactos célula-célula después de la encapsulación. Razonamos que la microcápsula heterogénea, que posee un núcleo acuoso, puede ser más adecuada para la encapsulación de células que dependen del rápido restablecimiento de los contactos célula-célula. El concepto de dispositivo microfluídico de enfoque de flujo coaxial para hacer microcápsulas de núcleo acuoso / cubierta de hidrogel se adaptó de He et ^al.9, pero en lugar de alginato empleado en el enfoque original, se incorporó un hidrogel basado en PEG en la cáscara. Primero demostramos la encapsulación exitosa y la formación de esferoides de hepatocitos primarios en microcápsulas núcleo-cáscara¹⁰ y, más recientemente, describimos la encapsulación de células hES e iPS⁷. Como se describe en la Figura 1A, las cápsulas se fabrican en un dispositivo de enfoque de flujo donde las corrientes de flujo de la cáscara y el núcleo pasan de lado a lado al flujo coaxial antes de la eyección a la fase de aceite. El flujo central contiene células y aditivos que aumentan la viscosidad de la solución (PEG MW 35kD no reactivo e iodixanol - nombre comercial OptiPrep) mientras que el flujo de la cáscara contiene moléculas reactivas (PEG-4-Mal). El flujo de flujo coaxial continuo se discretiza en gotas que conservan la arquitectura core-shell. La estructura núcleo-cáscara se hace permanente por la exposición al reticulador de di-tiol (TDT), que reacciona con PEG-4-Mal a través de la química del clic y da como resultado la formación de una piel o cáscara de hidrogel delgada (~ 10 μm). Después de que la emulsión se rompe y las cápsulas se transfieren a una fase acuosa, las moléculas de PEG se difunden desde el núcleo y son reemplazadas por moléculas de agua. Esto da como resultado microcápsulas de núcleo acuoso y cáscara de hidrogel.

A continuación se proporcionan instrucciones paso a paso sobre cómo hacer dispositivos microfluídicos, cómo preparar células y cómo llevar a cabo la encapsulación de hPSC.

Protocolo

1. Fabricación del dispositivo

1. Realice los diseños para el dispositivo de microencapsulación y el dispositivo de disociación utilizando el software CAD^10,11.
2. Spin-coat las tres capas de fotorresisten SU-8 secuencialmente sobre una oblea de silicio (Figura 2A) para lograr estructuras con las alturas deseadas: 60, 100 y 150 μm.
   NOTA: El proceso para los moldes superior e inferior es idéntico.
   1. Recubre una oblea de silicio limpia de 10 cm con fotorresistencia negativa SU-8 2025 a 1.100 rpm para crear la primera capa de 60 μm. Después de hornear suavemente a 65 °C durante 3 min y 95 °C durante 10 min en una placa caliente, exponga el molde usando un alineador sin máscara cargando el archivo de diseño del patrón de canal central en el PC μPG 101. Luego, proceda con el horneado posterior a la exposición a 65 ° C durante 3 min y a 95 ° C durante 10 min.
   2. Cubra la segunda capa SU-8 2025 (40 μm) a 1.500 rpm y expóngala cargando el archivo CAD apropiado para el patrón de canal de shell.
      NOTA: Los horneados suaves y posteriores a la exposición fueron similares al paso anterior.
   3. Recubrimiento de centrifugado de la tercera capa SU-8 2025 a 1.400 rpm para alcanzar una altura de 50 μm y repetir el proceso anterior pero exponer las estructuras para la fase de aceite.
   4. Desarrolle el molde con las tres capas en un solo paso por inmersión en el revelador SU-8 hasta que se elimine toda la fotorresistente no expuesta.
   5. Hornea duro el molde en una placa caliente a 160 °C durante 10 min para mejorar la adherencia y sellar las grietas menores que podrían aparecer después del desarrollo.
   6. Exponga el molde al clorotrimetilsilano para evitar la unión del elastómero en el siguiente paso y colóquelo en placas de Petri de 15 cm hasta su uso.
3. Prepare el molde del dispositivo de disociación de la misma manera, como se describe en la Figura 1D y la Figura 2B. Haga girar una capa de fotorresistencia SU-8 sobre una oblea de silicio, como se describió anteriormente en el paso 1.2.3, para lograr estructuras con la altura deseada: 50 μm. Realice el horneado suave y posterior a la exposición, el desarrollo y el horneado duro de manera similar al paso anterior.
   NOTA: Una serie de postes de forma triangular cubría toda la cámara, con un espaciado entre los postes que disminuía a medida que el ancho de la cámara disminuía hacia la salida. Los postes triangulares eran de 200 μm por lado con un paso que oscilaba entre 400 μm (en la entrada) y 30 μm (en la salida).
4. Preparar los moldes mediante litografía blanda utilizando polidimetilsiloxano (PDMS).
   1. Mezcle la base de elastómero PDMS y el agente de curado de elastómero en una proporción de 10:1 w/w en una centrífuga planetaria. Vierta la mezcla tanto en moldes maestros de microencapsulación como en moldes maestros de disociación para crear una capa de 3-4 mm.
      NOTA: Una mezcla de 50 g de base de elastómero con 5 g de agente de curado es suficiente para cubrir un molde maestro con 3 mm de espesor.
   2. Coloque las placas de Petri que contienen los moldes en un desecador al vacío durante 15 minutos para desgasificar el PDMS sin curar.
   3. Mueva las placas de Petri a un horno y hornee a 80 °C durante un mínimo de 60 min.
   4. Retire los moldes maestros del horno y deje que se enfríen. Con un cuchillo de precisión, corte cuidadosamente el PDMS siguiendo la forma de la oblea y despegue las piezas pdmS del molde maestro.
   5. Recorte las losas PDMS recortando los bordes de cada dispositivo con un bisturí, luego perfore los puertos fluídicos de entrada / salida en el dispositivo de disociación y solo en el dispositivo microfluídico superior con agujas de acero inoxidable. Cubra los dispositivos con cinta adhesiva mágica para evitar la contaminación.
      NOTA: El medidor de aguja es de 14 G y 15 G para los puertos de entrada y salida, respectivamente.
   6. Para la unión, trate los lados estampados de las piezas PDMS superior e inferior con plasma O₂ en un grabador de plasma durante 2 minutos.
   7. Alinee ambas partes de PDMS bajo un estereoscopio después de agregar una capa de separación delgada de agua destilada directamente en los microcanales (2 μL).
   8. Coloque el dispositivo PDMS alineado en el horno a 80 °C durante la noche para completar la unión y restaurar el PDMS a su estado hidrófobo original. Guarde los dispositivos hasta su uso posterior.
      NOTA: Esto da como resultado un dispositivo de enfoque de flujo coaxial con tres alturas diferentes de 120 μm para el núcleo, 200 μm para la carcasa y 300 μm para los canales de aceite.
   9. Para usar el dispositivo justo después de la unión de plasma, inyecte cuidadosa pero firmemente 30 μL de solución de recubrimiento hidrófobo en los canales fluídicos para lograr un recubrimiento hidrófobo. Luego, purgue inmediatamente el aire en los canales hasta que no se observen residuos de la solución de recubrimiento hidrófobo en el dispositivo.
   10. Unir el dispositivo de disociación tratando primero el lado estampado del dispositivo y un vaso de diapositiva limpiado con plasma O_{2 durante 2} minutos, y luego ensamblándolos para su posterior curado en el horno a 80 ° C durante la noche.
       NOTA: Los dispositivos se pueden almacenar hasta su uso posterior.

2. Preparación de soluciones

1. Soluciones de stock. Primero, prepare soluciones madre (soluciones concentradas) que se diluirán a concentraciones más bajas para su uso real.
   NOTA: Las soluciones de stock se utilizan para ahorrar tiempo de preparación, conservar materiales, reducir el espacio de almacenamiento y mejorar la precisión al preparar una solución de trabajo en concentraciones más bajas.
   1. Preparar 30 mL de solución de núcleo 2x (16% PEG y 34% de medios de gradiente de densidad): mezclar 4,8 g de 35 kDa DE PEG, 10,2 mL de medios de gradiente de densidad y 19,8 mL de medios DMEM/F12. Filtre esta solución central con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
   2. Preparar 50 mL de aceite mineral con 3% de surfactante: mezclar 48,5 mL de aceite mineral y 1,5 mL de surfactante. Mantener en estado estéril después de la filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
   3. Preparar 50 mL de aceite mineral con 0.5% de surfactante: mezclar 49.75 mL de aceite mineral y 0.25 mL de surfactante. Mantener en condición estéril.
   4. Preparar 1 M de Ditiotheritol (TDT): disolver 1,5425 g de TDT en 10 mL de agua destilada. Mantener en condición estéril.
   5. Preparar 1 M de trietanolamina (TEA): añadir 66,4 μL de TEA en 433,6 μL de agua destilada. Mantener en condición estéril.
   6. Preparar 1% Pluronic F127 (PF127): disolver 100 mg de PF127 en 10 mL de agua destilada. Mantener en condición estéril.
2. Soluciones de trabajo
   1. Preparar una emulsión reticulante mezclando 4,5 mL de aceite mineral con 3% de surfactante y 300 μL de 1 M de TDT (proporción 1:15). Vórtice la solución durante 2 min y sonicate durante 45-60 min en un baño ultrasónico a 20 °C. Cargue esta solución en una jeringa de 5 ml con una aguja de 27 G.
      NOTA: La emulsión se genera al sonicar la mezcla de aceite / agua.
   2. Prepare la solución de aceite de protección cargando el aceite mineral con surfactante al 0,5% en una jeringa de 5 ml con una aguja de 27 G.
   3. Preparar la solución de cáscara (8% p/v PEG-4-Mal y 15 mM TEA) añadiendo 32 mg de PEG-4-Mal en 400 μL de 1x DPBS para formar 8% p/v solución, y vórtice la solución durante 2 min. A continuación, añadir 6 μL de 1 M TEA (concentración final 15 mM TEA). Finalmente, centrifuga a 13.000 x g durante 5 min a través de un filtro de centrifugado y manténgalo en la oscuridad en el balancín durante 30 min. Luego, cargue esta solución en una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G.
      NOTA: Deje que el recipiente PEG-4-Mal permanezca a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de abrir la tapa, y sople el gas N₂ para reemplazar el O₂ con N₂ antes de cerrar la tapa. Vortex TEA antes de añadir a la solución.
3. Preparar la suspensión celular en la solución central
   1. Trate las hPSC con tripsina durante 5 a 10 min a 37 °C. Luego, recógelos de los platos. Apague la tripsina con el medio después del desprendimiento celular y luego transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml.
   2. Centrifugar la suspensión de células a granel (400 x g, 5 min). Aspire cuidadosamente el sobrenadante y luego resuspenda el pellet celular utilizando un volumen mínimo de medio de crecimiento. Cuente las celdas mediante un contador de celdas automatizado.
      NOTA: Las alícuotas celulares típicas contienen 12-20 x 10⁶ células y son suficientes para producir 400 μL de la solución central.
   3. Tome 12-20 x 10⁶ células de la suspensión de células a granel y centrifugue la suspensión de células / medios (400 x g, 5 min).
   4. Aspire cuidadosamente los medios de la bolita celular. Luego, agregue 200 μL de medio y 200 μL de 2x solución de PEG (concentración final 30-50 x 10⁶ celdas / ml) y mezcle suavemente.
      NOTA: Las bajas concentraciones celulares (menos de 20 x 10⁶ células/ml) dieron lugar a muchas cápsulas vacías.
   5. Añadir 30 μL de PF127 al 1% a la solución.
   6. Inserte una barra de micro agitador (2 mm x 7 mm) en una jeringa de 1 ml y luego cargue la celda que contiene la solución central a la jeringa con una aguja de 27 G. Mantenga la solución fría con hielo durante todo el proceso de encapsulación.

3. Configuración experimental

1. Coloque el dispositivo de gotas PDMS adherido, cuatro piezas de 20 cm de largo y una pieza de microtubos de entrada de 5 cm de largo (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), una pieza de tubo de salida de 10 cm (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.) y seis piezas de tubos de conexión de 0,5 cm (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) debajo de una fuente de luz germicida (normalmente integrada en gabinetes de seguridad biológica) y esterilice durante 30 min.
2. Use fórceps para colocar el tubo en los puertos de entrada fluídicos y los puertos de disociación.
3. Utilice las tres piezas de microtubos de entrada de 20 cm de largo para la carcasa, el aceite, las entradas de emulsión de reticulación y una pieza para la entrada del dispositivo de disociación. Luego, inserte el extremo opuesto de los tubos a la aguja de la jeringa con la solución correspondiente. Mientras tanto, conecte la entrada central del dispositivo microfluídico y la salida del dispositivo de disociación con un microtubo de 5 cm (Figura 1C).
   NOTA: Los microtubos de entrada deben estar bien asegurados dentro de los tubos de conexión, que se insertaron en el último paso.
4. Inserte un tubo de salida en el puerto de salida fluídico y coloque el extremo opuesto en un depósito de recolección.
5. Coloque el dispositivo en un escenario de microscopio y conecte el tubo para evitar que se mueva. Alinee y enfoque el microscopio en la boquilla del dispositivo para la inspección de flujo.
6. Coloque cada jeringa en diferentes bombas de jeringa y asegúrela correctamente (Figura 1B). Programe cada bomba de acuerdo con los protocolos del fabricante a los siguientes caudales: núcleo (3-5 μL/min), carcasa (3-5 μL/min), aceite de blindaje (20-80 μL/min) y aceite de reticulación (40-60 μL/min). Inicie el flujo en todas las bombas.
7. Espere a que cada fluido ingrese al dispositivo y llene los canales mientras expulsa el aire restante.
   NOTA: Si hay una gran cantidad de aire en el tubo de entrada, aumente temporalmente cada caudal hasta que el aire se elimine por completo. Tenga en cuenta que el caudal excesivo podría provocar la falla del enlace de PDMS a PDMS.
8. Cuando la formación de la cápsula se estabilice (Figura 3), coloque el extremo opuesto del tubo de recolección en un nuevo tubo cónico con 5 ml de medios mTeSR.
   NOTA: El medio contiene 10 μM de inhibidor de ROCK, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina.
9. Después de recolectar un número suficiente de cápsulas, incubar a 37 °C con 5% de CO₂ durante 10 min. Las cápsulas que residen en la fase de aceite estarán en la parte superior del tubo (ver Figura 4A). Golpear suavemente el tubo hace que las cápsulas se sedimenten en el fondo. Después de esto, la mayor parte del aceite y los medios pueden ser aspirados.
10. Recoja las cápsulas de la parte inferior del tubo cónico, colóquelas en un colador celular (tamaño de poro de 100 μm) y lávelas con grandes cantidades de medios. Luego, recolecte microcápsulas usando medios de 2 ml en una placa de cultivo de 6 pocillos pasando el medio a través del filtro a medida que se invierte en la parte superior de la placa del pozo (consulte la Figura 4A).

4. Cultivo y análisis de hPSC en microcápsulas

1. Cultura básica
   1. Incubar las cápsulas de células madre en una placa de cultivo de 6 pocillos a 37 °C con un 5% de CO₂.
   2. Cambie los medios cada dos días recolectando las cápsulas en un filtro colador celular, lavándolas con exceso de medios y resuspiéndolas a un nuevo pozo en placas de 6 pocillos con medios de 2 ml como se hizo en el paso 3.10.
   3. Cultive las cápsulas durante al menos 10 días.
2. Realizar el ensayo vivo/muerto para determinar la viabilidad de las células madre encapsuladas.
   1. Descongelar soluciones de ensayo vivas/muertas (homodímero de etidio-1 y calceína AM).
   2. Añadir 4 μL de las soluciones de 2 μM de etidio homodímero-1 y 1 μL de las soluciones de calceína AM de 4 μM a 2 ml de DPBS estéril. Vórtice para asegurar una mezcla completa.
   3. Recolecte aproximadamente 100 microcápsulas en un colador celular y enjuáguelas con DPBS estériles para permitir la difusión del medio fuera de las cápsulas.
   4. Recójalos de nuevo en una placa de cultivo de 12 pocillos utilizando 1 ml de la solución preparada en el paso 4.2.2. Incubar a 37 °C durante 20 min.
   5. Visualice las células bajo un microscopio de fluorescencia.
      NOTA: La viabilidad celular se cuantifica calculando el porcentaje de células vivas, que se visualizan como verdes, entre el número total de células.
3. Caracterización del tamaño de los esferoides.
   1. Cuando lo desee, coloque la placa del pozo con microcápsulas bajo el microscopio y mida el diámetro de los esferoides que se muestran en el software relacionado con barras de escala adecuadas.
   2. Medir y analizar el tamaño de los esferoides.

Resultados

Al seguir el protocolo mencionado anteriormente, el lector podrá fabricar dispositivos microfluídicos y producir microcápsulas portadoras de células. La Figura 3A muestra ejemplos de microcápsulas óptimas y subóptimas fabricadas mediante la generación de gotas microfluídicas. Diferentes formulaciones de PEG-4-Mal dieron como resultado cápsulas de diferentes morfologías: las cápsulas arrugadas se asociaron con una gelificación deficiente, baja integridad mecánica y no resistieron el cultivo e...

Discusión

El proceso de encapsulación descrito aquí da como resultado la formación reproducible de esferoides hPSC. El formato de microcápsula facilita la dispensación de esferoides en pozos de una placa de microtitulación para experimentos destinados a mejorar / optimizar los protocolos de diferenciación o probar terapias. Los esferoides de células madre encapsuladas también se pueden usar en cultivos en suspensiones donde la cubierta de hidrogel protege las células contra el daño inducido por el cizallamiento^7<...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y micro; m Filtros de jeringa	Genesee Scientific	25-244
Jeringa de 1 ml punta Luer-Lock	BD 309628
1x DPBS	Corning	23220003
maleimida PEG de 4 brazos, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
Jeringa de 5 ml punta Luer-Lock	BD	309646
6 POCILLOS PLACA NO TRATADA	EE. UU. Scientific	CC7672-7506
Paquete Aplicador Aquapel Tratamiento	de vidrio Aquapel	47100
Software CAD	Autodesk AutoCAD	v2020
CELL STRAINER 100 µ m tamaño de poro	cardinal	335583
Clorotrimetilsilano	Aldrich	386529-100mL
Countess II FL Contador de células automatizado	Tecnología Life	A27974
Placa calefactora digital Placa			datos
Mezclador de vórtice digital	Fisher Scientific	215370
Agua destilada	Gibco	15230-162
Ditiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM/F12 media	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrífuga	en vivo	13-100-675
HERACELL VIOS 160i Incubadora de CO2	Thermo Scientific	50144906
Microscopio Motorizado de Fluorescencia Invertida	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin	Coaters Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Kit de tinción de mamíferos vivos/muertos	Fisher	L3224
Grapas de	cinta mágica	483535
Micro Tubos médicos (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE/2
Micro barra agitadora	Daigger Scientific	EF3288E
MilliporePinzas de filtro Sigma	Fisher scientific	XX6200006P
Aceite mineral	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Medio basal	TECNOLOGÍA DE CÉLULAS MADRE	85850
Agujas-Acero inoxidable  Calibre 14	Suministro de CML	901-14-025
Agujas-Acero inoxidable   Calibre 15	Suministro de CML	901-15-050
OptiPrep	TECNOLOGÍA STEMCELL	7820
Horno	Thermo Scientific	HERA THERM Horno
Penicilina: Estreptomicina (10,000 U/mL de Penicilina G, 10 mg/mL de estreptomicina)	Gemini	400-109
Petri Plato 150X20 Ventilación estéril	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Sistema de limpieza por plasma	Yield Engineering System, Inc.	YES-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poli(etilenglicol) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
Aguja PrecisionGlide 27G	BD 305109
Inhibidor de rocas Y-27632 dihidrocloruro	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Oblea de silicio 100mm	Oblea Universitaria	452
Vidrio deslizante (75 mm y agudo; 25 mm)	CardinalHealth	M6146
Span 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Filtro de tubo de centrífuga (0.22 y micro; m)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku Advanced Materials	Y111069 0500L1GL
SU-8 desarrollador	Kayaku Advanced Materials	Y020100 4000L1PE
Diseño quirúrgico Royaltek Cuchillas de bisturí quirúrgico de acero inoxidable	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Kit de elastómero de silicona (PDMS)	Dow Corning	2065622
Bomba de jeringa	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Trietanolamina	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)	Cole-Parmer	06419-01
Tubo Tygon (0.04" de diámetro interno x 0.07" de diámetro exterior)	Cole-Parmer	06419-04
Limpiador ultrasónico FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Desecador de vacío	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Microscopio estereoscópico 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
μ PG 101 escritor láser	Heidelberg Instruments	HI 1128