Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

Resumen

Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Resumen

La metilación del ADN, una forma de regulación genética epigenética, es importante para la función celular normal. En las células, las proteínas llamadas metiltransferasas de ADN (DNMT) establecen y mantienen el patrón de metilación del ADN. Los cambios en el patrón normal de metilación del ADN están relacionados con el desarrollo y la progresión del cáncer, lo que hace que los DNMT sean posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Por lo tanto, la identificación y caracterización de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas de estas enzimas es de gran importancia. Este documento presenta un protocolo que se puede utilizar para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN. El ensayo cinético de acoplamiento continuo permite determinar las velocidades iniciales de metilación del ADN en presencia y ausencia de posibles inhibidores de moléculas pequeñas. El ensayo utiliza la endonucleasa sensible al metilo Gla I para acoplar la metilación de un sustrato de ADN hemimetilado a la generación de fluorescencia.

Este ensayo continuo permite monitorizar la actividad enzimática en tiempo real. La realización del ensayo en pequeños volúmenes en placas de microtitulación reduce el costo de los reactivos. Usando este ensayo, se realizó una pequeña pantalla de ejemplo para inhibidores de DNMT1, la isoenzima DNMT más abundante en humanos. El producto natural de antraquinona altamente sustituido, ácido laccaico A, es un potente inhibidor competitivo del ADN de DNMT1. Aquí, examinamos tres posibles inhibidores de moléculas pequeñas: antraquinonas o moléculas similares a la antraquinona con uno a tres sustituyentes, en dos concentraciones para describir el protocolo de ensayo. Las velocidades iniciales se utilizan para calcular el porcentaje de actividad observado en presencia de cada molécula. Uno de los tres compuestos examinados exhibe inhibición dependiente de la concentración de la actividad de DNMT1, lo que indica que es un inhibidor potencial de DNMT1.

Introducción

La metilación del ADN es una marca epigenética importante que regula la expresión génica y la estructura de la cromatina. La metilación ocurre predominantemente en los dinucleótidos CpG: citosina seguida de guanosina; El grupo metilo se añade a la posición 5 de la citosina. Los patrones correctos de metilación del ADN y, por lo tanto, la expresión génica adecuada, son necesarios para el desarrollo y la función celular apropiados. Muchos estados de enfermedad se han asociado con cambios en el patrón normal de metilación ^1,2,3. Por ejemplo, existe un vínculo entre el inicio y l....

Protocolo

1. Prepare soluciones de ensayo para la pantalla

NOTA: Las concentraciones de sustratos utilizados en este ensayo pueden ser adaptadas. Para DNMT1 que carece de RFTS, los valores de K_m determinados experimentalmente para el sustrato de ADN de horquilla y SAM son 1–2 nM y 2 μM, respectivamente^26,40.

1. Preparar 600 μL de cada condición de ensayo que se esté probando en tubos de microcentrífuga sobre hielo.
   NOTA: El volumen total de solución de ensayo necesaria depende del número de réplicas que se realicen. Cada condición de ensayo se ejecutó por....

Resultados

DNMT1 activo es un requisito previo para este análisis. La DNMT1 que carece de RFTS se expresó en E. coli y se purificó a homogeneidad siguiendo procedimientos previamente publicados⁴¹. Para asegurar que la enzima purificada estaba activa, se utilizó un ensayo discontinuo acoplado a endonucleasa para examinar la actividad de metilación del ADN³⁶. Este ensayo utiliza un ADN dúplex de 32 pares de bases con una sola CpG hemimetilada posicionada en un sitio de escisión.......

Discusión

Para identificar y caracterizar los inhibidores de las metiltransferasas del ADN, se debe medir la actividad de la enzima. Existen varios métodos para examinar la actividad de la metiltransferasa del ADN. La actividad se controla comúnmente mediante radiactividad; La transferencia del grupo metilo marcado de SAM se puede cuantificar 29,30,31,32,33,34

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microplaca de poliestireno negro de fondo plano de media área de 96 pocillos sin tratar	Corning	3694
Placas de fondo cónico de poliestireno de 96 pocillos	ThermoFisher	249570
Albúmina sérica bovina	NEB	B9000S
compuesto 1	ChemBridge	5812086	compuesto de cribado; resuspendido en DMSO a 10 mM
compuesto 2	ChemBridge	6722175	compuesto de cribado; resuspendido en DMSO a 10 mM
compuesto	ChemBridge	5249376	compuesto de cribado; resuspendido en DMSO a 10 mM
Dithiothreitol	Sigma	D0632
Gla I	SibEnzima	E494	endonucleasa sensible a metilo
Glicerol	RPI	G22025
Cloruro de magnesio	Sigma	M0250
Oligonucleótido (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)	IDT	de horquilla templado internamente sintetizado a medida (sustrato)
Glutamato de potasio	Sigma	G1501
S-adenosilmetionina	Sigma	A4377	cofactor donante de metilo (sustrato)
Tris Base	RPI	T60040

de cribado 3 ADN