Artículo de método

Ensayo continuo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN

DOI:

10.3791/62949

⸱

5 de agosto de 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

En este artículo

Resumen

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Las metiltransferasas de ADN son posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Aquí, se presenta un protocolo para evaluar moléculas pequeñas para la inhibición de la metiltransferasa de ADN. Este ensayo utiliza una endonucleasa para acoplar la metilación del ADN a la generación de fluorescencia y permite monitorear la actividad enzimática en tiempo real.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metilación del ADN, una forma de regulación genética epigenética, es importante para la función celular normal. En las células, las proteínas llamadas metiltransferasas de ADN (DNMT) establecen y mantienen el patrón de metilación del ADN. Los cambios en el patrón normal de metilación del ADN están relacionados con el desarrollo y la progresión del cáncer, lo que hace que los DNMT sean posibles objetivos farmacológicos contra el cáncer. Por lo tanto, la identificación y caracterización de nuevos inhibidores de moléculas pequeñas de estas enzimas es de gran importancia. Este documento presenta un protocolo que se puede utilizar para detectar inhibidores de la metiltransferasa de ADN. El ensayo cinético de acoplamiento continuo permite determinar las velocidades iniciales de metilación del ADN en presencia y ausencia de posibles inhibidores de moléculas pequeñas. El ensayo utiliza la endonucleasa sensible al metilo Gla I para acoplar la metilación de un sustrato de ADN hemimetilado a la generación de fluorescencia.

Este ensayo continuo permite monitorizar la actividad enzimática en tiempo real. La realización del ensayo en pequeños volúmenes en placas de microtitulación reduce el costo de los reactivos. Usando este ensayo, se realizó una pequeña pantalla de ejemplo para inhibidores de DNMT1, la isoenzima DNMT más abundante en humanos. El producto natural de antraquinona altamente sustituido, ácido laccaico A, es un potente inhibidor competitivo del ADN de DNMT1. Aquí, examinamos tres posibles inhibidores de moléculas pequeñas: antraquinonas o moléculas similares a la antraquinona con uno a tres sustituyentes, en dos concentraciones para describir el protocolo de ensayo. Las velocidades iniciales se utilizan para calcular el porcentaje de actividad observado en presencia de cada molécula. Uno de los tres compuestos examinados exhibe inhibición dependiente de la concentración de la actividad de DNMT1, lo que indica que es un inhibidor potencial de DNMT1.

Introducción

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La metilación del ADN es una marca epigenética importante que regula la expresión génica y la estructura de la cromatina. La metilación ocurre predominantemente en los dinucleótidos CpG: citosina seguida de guanosina; El grupo metilo se añade a la posición 5 de la citosina. Los patrones correctos de metilación del ADN y, por lo tanto, la expresión génica adecuada, son necesarios para el desarrollo y la función celular apropiados. Muchos estados de enfermedad se han asociado con cambios en el patrón normal de metilación 1,2,3. Por ejemplo, existe un vínculo entre el inicio y la progresión del cáncer y las alteraciones en el patrón de metilación del ADN. Por lo general, las células cancerosas exhiben niveles generales más bajos de metilcitosina, lo que contribuye a la inestabilidad del genoma. Al mismo tiempo, la metilcitosina que está presente en el genoma se concentra en las regiones promotoras de los genes supresores de tumores, lo que conduce al silenciamiento génico de estas proteínas importantes. En particular, los cambios epigenéticos son dinámicos y reversibles, a diferencia de las mutaciones del ADN asociadas con la tumorigénesis. Esto ha hecho que las proteínas implicadas en la regulación génica epigenética sean interesantes dianas farmacológicas 2,4.

Las metiltransferasas de ADN (DNMT) son las proteínas responsables de generar y mantener los patrones de metilación del ADN. Tres isoenzimas catalíticamente activas, DNMT1, DNMT3a y DNMT3b, existen en humanos. Durante el desarrollo y la diferenciación, las metiltransferasas de novo, DNMT3a y DNMT3b, establecen patrones de metilación. Ambas enzimas pueden unirse a la proteína DNMT3L catalíticamente inactiva para formar complejos que exhiben una mayor actividad 1,5. Después de la división celular, las células hijas contienen ADN hemimetilado (ADN que contiene metilcitosina en una sola hebra del dúplex) porque el ADN recién sintetizado carece de marcas de metilación. La función principal de DNMT1 es metilar este ADN hemimetilado, restableciendo así el patrón de metilación completo 1,5.

Los vínculos entre la actividad de DNMT y el cáncer están bien establecidos. La sobreexpresión de DNMT1, ya sea por mecanismos transcripcionales o postraduccionales, es una consecuencia de varias vías oncogénicas comunes 6,7,8,9. Los enfoques genéticos para disminuir la actividad de DNMT1 utilizando alelos hipomórficos dan como resultado una disminución de la formación de tumores en ratones Apc(Min)10. Los oligonucleótidos antisentido que derriban DNMT1 inhiben la neoplasia en cultivos celulares y modelos tumorales de ratón11,12. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de DNMT1 parece un enfoque prometedor de la terapia contra el cáncer. Sin embargo, los roles que desempeñan las isoenzimas DNMT3 no son tan sencillos. Las mutaciones DNMT3a se encuentran en la leucemia mieloide aguda13 y en el síndrome mielodisplásico14. Se ha demostrado que al menos una de las mutaciones identificadas disminuye la actividad de metilación del ADN de la enzima15. Sin embargo, DNMT3b se sobreexpresa en el cáncer de mama16 y el cáncer colorrectal17. Dado que las diversas isoenzimas DNMT desempeñan diferentes funciones en la carcinogénesis, la identificación de inhibidores específicos de isoenzimas será fundamental. Estos compuestos no solo serán útiles para el desarrollo de terapias, sino que los inhibidores específicos de isoenzimas también serían una herramienta invaluable para diseccionar el papel de cada isoenzima DNMT en la etiología del cáncer.

Varios inhibidores de DNMT han sido reportados en la literatura. Los inhibidores conocidos de DNMT se pueden dividir en dos clases: nucleósidos y no nucleósidos. Los inhibidores de nucleósidos son típicamente análogos de la citidina. Estos compuestos se incorporan al ADN y atrapan covalentemente las DNMT. La 5-azacitidina y la 5-aza-2'-desoxicitidina han sido aprobadas para el tratamiento del síndrome mielodisplásico y la leucemia mieloide aguda 4,18. La alta toxicidad, la baja biodisponibilidad y la inestabilidad química de estos compuestos presentan problemas. El trabajo en curso está examinando la eficacia de la próxima generación de inhibidores de nucleósidos; SGI-110, derivado de 5-aza-2'-desoxicitidina, es un ejemplo 19,20. Los inhibidores de nucleósidos no son isozimas específicos e inactivarán cualquier isoenzima DNMT encontrada. Por lo tanto, el tratamiento con un agente desmetilante de nucleósidos resulta en el agotamiento de todas las isoenzimas DNMT 4,18. Los inhibidores no nucleósidos no necesitan ser incorporados al ADN para ejercer sus efectos inhibitorios. En cambio, estas moléculas se unen directamente a los DNMT, introduciendo la posibilidad de inhibición específica de isoenzimas. Hasta la fecha se han descubierto varios inhibidores no nucleósidos, incluyendo SGI-102721, hidralazina 22, procainamida 23, RG108 y derivados 24, y productos naturales, (-)-epigalocatequina 3-galato (EGCG)25 y ácido laccaico A 26,27. La mayoría de los inhibidores no nucleósidos descubiertos hasta la fecha no son isozimo-selectivos o muestran preferencias débiles por una isoenzima DNMT. Además, la potencia de estas moléculas necesita ser mejorada, especialmente en las células 4,18. Por lo tanto, existe la necesidad de descubrir o desarrollar inhibidores de DNMT más potentes y selectivos de isoenzimas.

Un obstáculo para descubrir nuevos inhibidores de moléculas pequeñas de DNMTs son los laboriosos ensayos tradicionalmente utilizados para examinar la actividad de DNMT28. Los ensayos suelen ser discontinuos con múltiples pasos. La actividad enzimática de las DNMT todavía se ensaya rutinariamente utilizando S-adenosil metionina radiactiva (SAM)29,30,31,32,33,34. También se han desarrollado ensayos no radiactivos para la metilación del ADN. Por ejemplo, se han descrito ensayos que utilizan endonucleasas de restricción sensibles al metilo y electroforesis para separar los productos de digestión35,36. Estos tipos de ensayos discontinuos de varios pasos no son fácilmente susceptibles de descubrimiento de fármacos. Desde mediados de la década de 2000, se han desarrollado varios ensayos de metilación del ADN con un mayor rendimiento28. Se utilizó un ensayo de proximidad de centelleo para detectar inhibidores de DNMT137. Otro ensayo que utilizó una endonucleasa de restricción sensible al metilo se utilizó para detectar inhibidores de DNMT3a25,38. Si bien ambos ensayos permitieron un mayor rendimiento que los ensayos tradicionales de metilación del ADN, los ensayos requieren múltiples pasos y no permiten la observación de la actividad de metilación en tiempo real. Más recientemente, se ha descrito un ensayo cinético continuo que acopla la formación de S-adenosilhomocisteína (SAH), un producto de la reacción de metilación, al cambio espectroscópico a 340 nm asociado con la oxidación de NADPH39. Este ensayo utiliza tres enzimas de acoplamiento para generar una señal espectroscópica.

Desarrollamos un ensayo de metilación del ADN acoplado a endonucleasa basado en fluorescencia que utiliza una sola enzima de acoplamiento disponible comercialmente y puede generar datos en tiempo real (Figura 1). Un oligonucleótido de horquilla que contiene tres metilcitosinas se utiliza como sustrato. El ADN del sustrato contiene un fluoróforo en el extremo 5' y un quencher en el extremo 3'. La metilación del sitio CpG hemimetilado genera el sitio de escisión para la endonucleasa Gla I - GCGC completamente metilado. La escisión Gla I del oligonucleótido producto libera el fluoróforo del exprimidor y genera fluorescencia en tiempo real. El ensayo se puede utilizar para examinar la actividad de cualquier isoforma de DNMT; sin embargo, se observa una mayor actividad con DNMT1 ya que esta isoenzima metila preferentemente el ADN hemimetilado 1,5. Se observa una actividad aún más robusta si el dominio autoinhibitorio Replication Foci Targeting Sequence (RFTS) se elimina de DNMT1. Este dominio, que se encuentra en la región reguladora N-terminal, se une al sitio catalítico y evita la unión del ADN. La eliminación de los primeros ~600 aminoácidos da como resultado una enzima truncada que es significativamente más activa que la enzima de longitud completa (aumento de ~640 veces en kcat / Km)40. Esta forma activada de la enzima, conocida como DNMT1 que carece de RFTS (aminoácidos 621-1616), permite la identificación más fácil de los inhibidores debido a su mayor poder catalítico. Este documento presenta un protocolo para utilizar DNMT1 que carece de RFTS en ensayos para detectar posibles inhibidores de moléculas pequeñas. Usando el ensayo continuo acoplado a endonucleasa, la velocidad inicial se determina en presencia y ausencia de unas pocas moléculas pequeñas. Cada inhibidor potencial se examina en dos concentraciones para buscar la inhibición de DNMT1 dependiente de la concentración. El porcentaje de actividad observado en presencia de las moléculas pequeñas se calculó en cada caso.

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Figura 1: Ensayo de metilación del ADN. Se utiliza como sustrato un ADN de horquilla hemimetilada con un fluoróforo en el extremo 5' y un quencher en el extremo 3'. DNMT1 cataliza la transferencia del grupo metilo de S-adenosilmetionina al sitio CpG no metilado, generando S-adenosilhomocisteína y ADN completamente metilado. El producto de ADN contiene el sitio de escisión de la endonucleasa Gla I, que escinde los sitios GCGC completamente metilados. La escisión del ADN del producto libera el fluoróforo 5' del enfriador 3', generando fluorescencia. Abreviaturas: Fl = fluoróforo; Q = enfriador; DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; SAM = S-adenosilmetionina; HSA = S-adenosilhomocisteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

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1. Prepare soluciones de ensayo para la pantalla

NOTA: Las concentraciones de sustratos utilizados en este ensayo pueden ser adaptadas. Para DNMT1 que carece de RFTS, los valores de Km determinados experimentalmente para el sustrato de ADN de horquilla y SAM son 1–2 nM y 2 μM, respectivamente26,40.

  1. Preparar 600 μL de cada condición de ensayo que se esté probando en tubos de microcentrífuga sobre hielo.
    NOTA: El volumen total de solución de ensayo necesaria depende del número de réplicas que se realicen. Cada condición de ensayo se ejecutó por triplicado para este protocolo.
    1. Agregue ddH 2O y tampón de metilación 5x (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutamato de potasio, 5 mM de ditiothreitol (DTT), 25% de glicerol) a cada tubo para lograr una concentración final de 1x tampón. Para los ensayos que contengan 20 μM de compuesto, añadir 472 μL deddH2Oy 120 μL de tampón 5x. Para los ensayos que contengan un compuesto de 50 μM, añadir 470 μL deddH2Oy 120 μL de tampón 5x.
    2. Añadir 3,15 μL de 20 mg/ml de albúmina sérica bovina (ASC) a cada muestra.
    3. Añadir 2 μL de sustrato de ADN de horquilla de 3,15 μM y 1,33 μL de SAM de 4,75 mM a cada muestra.
      NOTA: La concentración de sustratos en la mezcla de solución de ensayo es 1,05 veces las concentraciones finales deseadas.
    4. Añadir inhibidor a una concentración final de 21 μM (1,26 μL de 10 mM) o 52,5 μM (3,15 μL de 10 mM) a las muestras apropiadas. Agregue una cantidad equivalente de dimetilsulfóxido (DMSO) a una muestra de control.
      NOTA: La concentración del inhibidor utilizado en la pantalla puede variar. La concentración final máxima de DMSO debe ser del ≤5% (v/v). Las concentraciones de DMSO de hasta 5% (v/v) no tienen efecto sobre la actividad observada en el ensayo26.
  2. Mezclar las soluciones por vórtice (3.000 rpm) durante 3 s. Girar las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  3. Alícuota 95 μL de cada solución de ensayo en 6 pocillos consecutivos en una placa negra de 96 pocillos de media área (figura 2).
    NOTA: Estos ensayos de selección se realizaron en dos lotes. Primero, se examinaron muestras de inhibidores de 20 μM (4 condiciones totales), seguidas de las muestras de inhibidores de 50 μM (4 condiciones totales).

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Figura 2: Configuración de la placa de ensayo. Cada solución de ensayo se alicita en seis pocillos en la placa negra de 96 pocillos: control DMSO (azul), compuesto 1 (verde), compuesto 2 (rojo) y compuesto 3 (amarillo). Tanto DNMT1 como Gla I, que carecen de RFTS, se agregarán a tres pozos. Como control, solo Gla I se agregará a los otros tres pozos. Abreviaturas: RFTS = Replication Foci Targeting Sequence; DNMT1 = ADN metiltransferasa 1; DMSO = dimetilsulfóxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparar soluciones enzimáticas para la detección

NOTA: DNMT1 que carece de RFTS puede expresarse en E. coli y purificarse a homogeneidad. Los procedimientos de expresión y purificación para DNMT1 que carece de RFTS se han descrito previamente41. El volumen de enzima necesario depende del número de ensayos que se realizan. Aquí, se realizan cuatro ensayos diferentes en cada conjunto; Cada ensayo se completa por triplicado.

  1. Preparar 75 μL de cada solución enzimática en tubos de microcentrífuga sobre hielo.
    NOTA: Se necesitarán dos soluciones enzimáticas. Una solución contendrá DNMT1 y Gla I; el otro contendrá solo Gla I.
    1. Agregue ddH 2O y tampón de metilación 5x (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 500 mM glutamato de potasio, 5 mM DTT, 25% glicerol) a cada tubo para lograr una concentración final de 1x tampón. Para la solución enzimática Gla I, añadir 15 μL de tampón 5x y 58,8 μLddH2O. Para la solución enzimática DNMT1+Gla I, añadir 15 μL de tampón 5x y 58,2 μLddH2O.
    2. Añadir 1,2 μL de 10 U/μL Gla I a cada solución para obtener una concentración final de 0,16 U/μL.
    3. Agregue 0.6 μL de DNMT1 que carece de RFTS de 5 μM para una concentración final de 40 nM a la solución DNMT1 + Gla I.
  2. Golpee suavemente para mezclar las soluciones. Gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  3. Alícuota 12 μL de cada solución enzimática en 6 pocillos en una placa de fondo cónico de 96 pocillos (Figura 3).

figure-protocol-2
Figura 3: Configuración de la placa enzimática. Las soluciones Gla I (gris) y DNMT1+Gla I (azul) se alicitan en seis pocillos en la placa de 96 pocillos. Usando una pipeta multicanal, la enzima se puede agregar a una fila de soluciones de ensayo simultáneamente. Para cada condición de ensayo (seis pozos), tres pozos recibirán DNMT1 + Gla I, y tres pozos recibirán Gla I solo. Abreviatura: DNMT1 = ADN metiltransferasa 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Ejecute el ensayo y analice los datos.

  1. Precaliente el lector de placas a 37 °C. Inserte la placa negra que contiene las soluciones de ensayo. Agitar la placa (doble orbital a 425 cpm durante 5 s) y leer la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm. Incubar la placa a 37 °C durante 5 min.
    NOTA: Alternativamente, se pueden usar filtros con cortes de longitud de onda adecuados para las lecturas de fluorescencia.
  2. Retire la placa de ensayo. Añadir 5 μL de solución enzimática a cada pocillo y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Utilice pipetas multicanal para que se pueda iniciar simultáneamente una fila de muestras.
  3. Inserte la placa en el lector de placas. Registre fluorescencia cada 53 s durante 30 min. Agitar la placa (orbital doble a 425 cpm durante 4 s) antes de cada lectura.
  4. Promedio triplicado de ensayos de control de Gla I para cada condición. Reste la traza de reacción de control promedio que contiene Gla I de las trazas triplicadas obtenidas en presencia de DNMT1 que carece de RFTS. Determine el error promedio y estándar de la media para las réplicas corregidas.
  5. Trazar la traza de reacción corregida promedio y ajustar la porción lineal inicial a una línea para determinar la velocidad inicial.
  6. Determine el porcentaje de actividad dividiendo la velocidad observada en presencia de un compuesto por la velocidad observada en la reacción de control que contiene DMSO y multiplicando por 100.

4. Control adicional del ensayo: adición secuencial de enzimas

  1. Preparar 550 μL de solución de ensayo en un tubo de microcentrífuga sobre hielo. Agregue 110 μL de tampón de metilación 5x, 3.88 μL de sustrato de ADN de horquilla de 3.15 μM, 6.43 μL de SAM de 47.5 mM, 3.06 μL de BSA de 20 mg / ml y 426.6 μL de ddH2O.
  2. Mezclar la solución por vórtice (3.000 rpm) durante 3 s. Gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  3. Alícuota 90 μL de la solución de ensayo en 6 pocillos consecutivos en una placa negra de 96 pocillos de media área.
  4. Prepare las soluciones enzimáticas DNMT1 en hielo. Agregue 4 μL de tampón de metilación 5x, 0.76 μL de 5 μM que carecen de DNMT1 y 15.24 μL de ddH2O a un tubo. Añadir 4 μL de tampón de metilación 5x y 16 μL deddH2Oa otro tubo.
  5. Golpee suavemente para mezclar las soluciones. Gire las muestras durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  6. Agregue 5 μL de la solución que contiene DNMT1 a tres pocillos en la placa negra de 96 pocillos de media área. Añadir 5 μL de la solución de control tampón a los otros tres pocillos.
  7. Coloque la placa de microtitulación en el lector de placas precalentado a 37 °C. Agitar la placa (orbital doble a 425 cpm durante 3 s) y leer la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 528 nm. Repetir el batido y leer cada 60 s durante 30 min.
  8. Mientras la placa de ensayo está en el lector de placas, prepare la solución de Gla I en hielo. Añadir 8 μL de tampón de metilación 5x, 0,64 μL de 10 U/μL Gla I y 31,4 μL deddH2Oa un tubo de microcentrífuga. Golpee suavemente para mezclar la solución. Gire la muestra durante unos segundos en una mini centrífuga de mesa (1.200 × g) para asegurarse de que la solución se recoge en el fondo del tubo.
  9. Alícuota 6 μL de la solución de Gla I en 6 pocillos en una placa de 96 pocillos de fondo cónico.
  10. Después de la lectura inicial de 30 minutos, retire la placa negra del lector de placas. Agregue 5 μL de solución de Gla I a los 6 pocillos y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Utilice una pipeta multicanal para que todos los pozos puedan iniciarse simultáneamente.
  11. Vuelva a colocar la placa negra en el lector de placas. Registre fluorescencia cada 35 s durante 35 min. Agitar la placa (orbital doble a 425 cpm durante 3 s) antes de cada lectura.

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Resultados

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DNMT1 activo es un requisito previo para este análisis. La DNMT1 que carece de RFTS se expresó en E. coli y se purificó a homogeneidad siguiendo procedimientos previamente publicados41. Para asegurar que la enzima purificada estaba activa, se utilizó un ensayo discontinuo acoplado a endonucleasa para examinar la actividad de metilación del ADN36. Este ensayo utiliza un ADN dúplex de 32 pares de bases con una sola CpG hemimetilada posicionada en un sitio de escisión...

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Discusión

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Para identificar y caracterizar los inhibidores de las metiltransferasas del ADN, se debe medir la actividad de la enzima. Existen varios métodos para examinar la actividad de la metiltransferasa del ADN. La actividad se controla comúnmente mediante radiactividad; La transferencia del grupo metilo marcado de SAM se puede cuantificar 29,30,31,32,33,34

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a la Universidad de Bucknell y al Departamento de Química por su apoyo a este trabajo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microplaca de poliestireno negro de fondo plano de media área de 96 pocillos sin tratarCorning3694
Placas de fondo cónico de poliestireno de 96 pocillosThermoFisher249570
Albúmina sérica bovinaNEBB9000S
compuesto 1ChemBridge5812086compuesto de cribado; resuspendido en DMSO a 10 mM
compuesto 2ChemBridge6722175compuesto de cribado; resuspendido en DMSO a 10 mM
compuestoChemBridge5249376compuesto de cribado; resuspendido en DMSO a 10 mM
DithiothreitolSigmaD0632
Gla ISibEnzimaE494endonucleasa sensible a metilo
GlicerolRPIG22025
Cloruro de magnesioSigmaM0250
Oligonucleótido (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Black Quencher)IDTde horquilla templado internamente sintetizado a medida (sustrato)
Glutamato de potasioSigmaG1501
S-adenosilmetioninaSigmaA4377cofactor donante de metilo (sustrato)
Tris BaseRPIT60040
de cribado 3 ADN

Referencias

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