Preparación de muestras y cuantificación relativa mediante metilación reductiva de aminas para estudios de peptidómica

Summary

Este artículo describe un método de preparación de muestras basado en la inactivación por calor para preservar los péptidos endógenos evitando la degradación post mortem, seguido de una cuantificación relativa utilizando el etiquetado isotópico más LC-MS.

Abstract

La peptidómica se puede definir como el análisis cualitativo y cuantitativo de péptidos en una muestra biológica. Sus principales aplicaciones incluyen la identificación de los biomarcadores peptídicos de la enfermedad o el estrés ambiental, la identificación de neuropéptidos, hormonas y péptidos intracelulares bioactivos, el descubrimiento de péptidos antimicrobianos y nutracéuticos a partir de hidrolizados de proteínas, y se puede utilizar en estudios para comprender los procesos proteolíticos. El reciente avance en la preparación de muestras, métodos de separación, técnicas de espectrometría de masas y herramientas computacionales relacionadas con la secuenciación de proteínas ha contribuido al aumento del número de péptidos identificados y peptidos caracterizados. Los estudios peptidómicos analizan con frecuencia péptidos que se generan naturalmente en las células. Aquí, se describe un protocolo de preparación de muestras basado en la inactivación por calor, que elimina la actividad de la proteasa, y la extracción con condiciones suaves, por lo que no hay escisión de enlaces peptídicos. Además, también se muestra la cuantificación relativa de péptidos utilizando el etiquetado de isótopos estables por metilación reductiva de aminas. Este método de etiquetado tiene algunas ventajas ya que los reactivos están disponibles comercialmente, son baratos en comparación con otros, químicamente estables y permiten el análisis de hasta cinco muestras en una sola ejecución LC-MS.

Introduction

Las ciencias "ómicas" se caracterizan por el análisis profundo de un conjunto de moléculas, como ADN, ARN, proteínas, péptidos, metabolitos, etc. Estos conjuntos de datos generados a gran escala (genómica, transcriptómica, proteómica, peptidómica, metabolómica, etc.) han revolucionado la biología y han llevado a una comprensión avanzada de los procesos ^biológicos1. El término peptidómica comenzó a introducirse a principios del ^siglo 20, y algunos autores se han referido a él como una rama de la ^proteómica2. Sin embargo, la peptidómica tiene distintas particularidades, donde el interés principal es investigar e....

Protocol

El siguiente procedimiento para la extracción de péptidos y la metilación reductiva se adaptó de procedimientos publicados anteriormente24,25,26,27. Este protocolo siguió los lineamientos del Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA) y fue aprobado por la Comisión de Ética para el Uso Animal (CEUA) del Instituto de Biociencias de la Universidad Estatal de Sao Paulo. Los pasos del protocolo se muestran en la Figura 1.

NOTA: Prepare todas las soluciones acuo....

Results

Los resultados obtenidos de las ejecuciones realizadas en el espectrómetro de masas se almacenan en archivos de datos sin procesar que se pueden abrir en el software del espectrómetro de masas. En los espectros MS, es posible observar grupos máximos que representan péptidos marcados de acuerdo con el esquema de etiquetado utilizado, que van desde 2-5 etiquetas. Por ejemplo, en la Figura 2, los pares de picos detectados en un tiempo cromatográfico se representan en un experimento en el que so.......

Discussion

En la mayoría de los estudios de peptidómica, uno de los pasos críticos es, sin duda, la preparación de la muestra que debe realizarse cuidadosamente para evitar la presencia de fragmentos peptídicos generados por las proteasas después de unos minutos post mortem. Los estudios iniciales sobre extractos cerebrales preparados a partir de muestras no microondas mostraron un gran número de fragmentos de proteínas presentes en los microfiltratos de 10 kDa. Se han descrito diferentes enfoques para evitar espectros peptídicos d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtros de corte de 10 kDa	Merck Millipore	UFC801024	Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membrana, 10 kDa
Acetona	Sigma-Aldrich	179124
Acetonitrilo	Sigma-Aldrich	1000291000
Bicarbonato de amonio	Sigma-Aldrich	11213
columna analítica (EASY-Column)	EASY-Column	(SC200)	10 cm, ID75 y micro; m, 3 y micro; m, C18-A2
Etil 3-aminobenzoato metanosulfonato	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Fluorescamina	Sigma-Aldrich	F9015
Solución de formaldehído	Sigma-Aldrich 252549
Formaldehído-13C, d2, solución	Sigma-Aldrich	596388
formaldehído-d2 solución	Sigma-Aldrich	492620
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	33015
Campana extractora	Quimis	Q216
Ácido clorhídrico - HCl	Sigma-Aldrich	258148
LoBind-Tubos de retención de proteínas	Eppendorf	EP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific	LTQ Velos
Horno microondas	Panasonic	NN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLC	Thermo Fisher Scientific	LC140
PEAKS Studio	Bioinformatics Solutions Inc.	VERSIÓN 8.5
Solución salina tamponada con fosfato	Invitrogen	3002	comprimidos
precolumna (EASY-Column)	Thermo Fisher Scientific	(SC001)	2 cm, ID100 µ m, 5 y micro; m, C18-A1
Centrífuga refrigerada	Hermle	Z326K	para tubos cónicos
Centrífuga refrigerada	Vision	VS15000CFNII	para microtubos
Columnas de limpieza de fase reversa    (Cartucho Oasis HLB 1 cc)	Waters		186000383 Oasis HLB 1 cc Cartucho
Cianoborodeuteruro de sodio - NaBD3CN	Sigma-Aldrich	190020
Cianoborohidruro de sodio - NaBH3CN	Sigma-Aldrich	156159
Fosfato de sodio dibásico	Sigma-Aldrich	S9763	NOTA: 0,2 M PB= 0,1 M de tampón de fosfato pH 6,8 (26,85 mL de Na2HPO3 1M) más 0,1 M de tampón de fosfato pH 6,8 (23,15 mL de NaH2PO3 1M) a 250 ml de agua
Fosfato de sodio monobásico	Sigma-Aldrich	S3139
Sonicator	Qsonica	Q55-110
Péptido estándar Secuencia	Proteimax		: LTLRTKL
Tampón de trietilamonio - TEAB 1 M	Sigma-Aldrich	T7408
Ácido trifluoroacético - TFA	Sigma-Aldrich	T6508
Agua ultrapurificada	Milli-Q	Direct-Q 3UV
Centrífuga de vacío	GeneVac	Concentrador
Baño de agua	Cientec	266
Xcalibur Software	ThermoFisher Scientific	OPTON-30965