Artículo de método

Aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas primarias utilizando Y-27632

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DOI:

10.3791/62978

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6 de noviembre de 2021

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1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un método modificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas mediante la adición del inhibidor de Rock, Y-27632, al método tradicional. Este método es más fácil, consume menos tiempo, mejora las propiedades de las células madre y produce un mayor número de células epiteliales de alto potencial tanto para el laboratorio como para aplicaciones clínicas.

Resumen

El tejido gingival es la primera estructura que protege los tejidos periodontales y desempeña un papel significativo en muchas funciones orales. El epitelio gingival es una estructura importante del tejido gingival, especialmente en la reparación y regeneración del tejido periodontal. El estudio de las funciones de las células epiteliales gingivales tiene un valor científico crucial, como la reparación de defectos orales y la detección de la compatibilidad de los biomateriales. Como las células epiteliales gingivales humanas son células queratinizadas altamente diferenciadas, su vida útil es corta y son difíciles de pasar. Hasta ahora, solo hay dos formas de aislar y cultivar células epiteliales gingivales, un método de explante directo y un método enzimático. Sin embargo, el tiempo requerido para obtener células epiteliales utilizando el método de explante directo es más largo, y la tasa de supervivencia celular del método enzimático es menor. Clínicamente, la adquisición de tejido gingival es limitada, por lo que se necesita un sistema de aislamiento y cultivo in vitro estable, eficiente y simple. Mejoramos el método enzimático tradicional agregando Y-27632, un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK), que puede promover selectivamente el crecimiento de las células epiteliales. Nuestro método enzimático modificado simplifica los pasos del método enzimático tradicional y aumenta la eficiencia del cultivo de células epiteliales, lo que tiene ventajas significativas sobre el método de explante directo y el método enzimático.

Introducción

La encía humana, la estructura de defensa de primera línea que protege el tejido periodontal, no solo es una barrera física y química1,sino que también segrega diferentes clases de mediadores inflamatorios que participan en las respuestas inmunes y constituyen una barrera inmune2,3. El epitelio gingival juega un papel importante en la reparación y regeneración del tejido periodontal. Por lo tanto, estudiar la defensa y la inmunidad del epitelio gingival es de gran importancia para comprender la aparición, el diagnóstico y el tratamiento de la periodontitis. El aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales a partir de tejido gingival humano es el primer paso requerido para estudiar el epitelio gingival. Tal procedimiento requiere operaciones básicas como la producción de células de semillas para la ingeniería de tejidos, modelos in vitro de enfermedades periodontales asociadas y materiales para reparar defectos periodontales.

Las células epiteliales gingivales primarias se caracterizan por una baja tasa de división in vitro4,los investigadores han estado buscando un método óptimo de aislamiento y cultivo durante décadas. Hasta la fecha, dos técnicas diferentes, un método de explante directo y un método enzimático, se utilizan comúnmente en los laboratorios para obtener células primarias del epitelio gingival in vitro4,5. El método de explante directo tiene ventajas como el requisito de una menor cantidad de muestras de tejido y un procedimiento de aislamiento simple, pero tiene las desventajas de un mayor tiempo de cultivo y susceptibilidad a lacontaminación 5. Aunque el método enzimático acorta el tiempo de cultivo requerido, la eficiencia es relativamente baja y varía dependiendo de las enzimas y el medio utilizado. Kedjarune et al.6 mostraron que el método de explante directo, que requiere más tiempo antes del subcultivo (2 semanas), pareció ser más exitoso para el cultivo de células epiteliales gingivales en comparación con el método enzimático. Sin embargo, comparando estos dos métodos, Klingbeil et al.7 encontraron que el método enzimático tuvo los mejores resultados para los cultivos primarios de células epiteliales orales, y fue posible obtener el rendimiento celular óptimo en el período de tiempo más corto (11,9 días frente a 14,2 días).

Por lo tanto, era importante desarrollar un método más conveniente y efectivo para el aislamiento y cultivo de células epiteliales orales4. Anteriormente informamos que la adición de Y-27632, un inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK), simplifica el procedimiento de aislamiento de células epidérmicas primarias humanas y queratinocitos de tejidos de piel adultos8,9,10. Desarrollamos G-medium, un nuevo medio de inoculación condicionado que separa espontáneamente las células epidérmicas de las dérmicas y apoya el crecimiento y el rendimiento de las células epidérmicas primarias8,9,10. En el presente estudio, desarrollamos una nueva técnica de aislamiento y cultivo sin suero para células epiteliales gingivales mediante la combinación de G-medium con Y-27632. En esencia, nuestro método se basa en una simplificación del método enzimático tradicional de dos pasos, por lo que comparamos nuestro nuevo método con el método de explante directo. Este método enzimático modificado acorta significativamente el tiempo necesario para separar las células epiteliales gingivales del tejido gingival y aumenta la eficiencia del cultivo de las células epiteliales gingivales.

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Protocolo

Los tejidos humanos utilizados en este protocolo son tejidos gingivales adultos frescos descartados de las extracciones de dientes impactados en el Departamento de Cirugía Maxilofacial de acuerdo con las directrices del Comité de Ética en Investigación Humana de la Institución (Protocolo No. GR201711, Fecha: 27-02-2017).

1. Preparativos

  1. Recolectar tejidos gingivales adultos frescos en tubos de 15 ml que contengan 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con penicilina/estreptomicina al 3% (P/S) y mantener los tejidos a 4 °C.
    NOTA: Trate los tejidos como se detalla a continuación dentro de las 24 h posteriores a la escisión.

2. Preparar reactivos y medio de cultivo

  1. Preparar la solución de lavado: 3% P/S. Mezclar 50 mL de PBS con 1,5 mL de penicilina (100 U/mL) y 1,5 mL de estreptomicina (100 mg/L).
  2. Prepare 500 ml de medio que contenga factor de crecimiento (llamado medio G): medio DMEM / F12 (3: 1) que contenga 1% P / S, suplemento de B27 al 2%, 20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 40 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) y 40 μg / ml de fungizona.
  3. Prepare soluciones de digestión enzimática para el nuevo método: Disuelva 125 mg de polvo de Dispasa y 125 mg de polvo de colagenasa tipo I en 50 ml de DMEM.
    NOTA: Filtrar todas las soluciones enzimáticas a través de un colador de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
  4. Preparar 500 mL del medio para neutralizar la digestión enzimática: 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de P/S en el medio DMEM.

3. Método de explantación directa

  1. Pretratamiento del tejido gingival
    1. Lavar el tejido gingival con 5 mL de etanol al 75% durante 30 s. Luego, enjuague dos veces con 5 ml de la solución de lavado (paso 2.1) durante 5 min.
      NOTA: Realizar todos los lavados en platos de cultivo celular con un diámetro de 50 mm.
  2. Cultivo de células epiteliales gingivales
    1. Cortar el tejido gingival en trozos de 1 mm3 y esparcirlos en una placa de cultivo celular de 100 mm. Use fórceps puntiagudos finos y tijeras oftálmicas para las operaciones de corte.
    2. Agregue el medio G (paso 2.2) al plato de cultivo. Luego, incuba el plato de cultivo en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Use un microscopio invertido (40x) para examinar los tejidos cada 24 h.
    3. Retire las piezas de tejido gingival cuando las células epiteliales se hayan propagado a un diámetro de 2-5 mm alrededor de las piezas de tejido. Cambie el medio G cada 2-4 días.

4. El nuevo método enzimático modificado

  1. Pretratamiento del tejido gingival
    1. Para ello, siga los mismos pasos descritos para el método de explante directo, paso 3.1.1.
  2. Digestión del tejido gingival
    1. Cortar el tejido gingival en trozos diminutos, de aproximadamente <1 mm de tamaño, con dos cuchillas esterilizadas. Repita el proceso de trituración con dos cuchillas quirúrgicas.
    2. Agregue 1 ml de 2,5 mg/ml de dispasa + solución de colagenasa a un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga las piezas de tejido gingival, y luego incube el tubo durante 15-20 min en una incubadora a 37 °C.
    3. Cuando el tejido se vuelva transparente y floculante, agregue 1 ml de la solución de neutralización para terminar la digestión. Mezcle bien la solución mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces. Pase la solución a través de un filtro de malla de 100 μm.
    4. Centrifugadora a 200 x g durante 5 min.
    5. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el gránulo celular en la parte inferior en 10 ml de medio que contenga factor de crecimiento (paso 2.2). Transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo celular de 100 mm. Añadir 10 μM de Y-27632 a la placa de cultivo celular.
    6. Culta las células a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%. Reemplace el G-medium antiguo con el G-medium fresco cada 2 días. Observe las celdas el día 1 y el día 3.

5. Paso celular

  1. Saque el plato de la incubadora, retire el medio gastado y lávelo dos veces con PBS. Añadir 2 ml de tripsina al 0,05% por cada plato de 100 mm.
    NOTA: Agite el plato para asegurarse de que haya suficiente contacto entre la solución de tripsina y el fondo del plato.
  2. Deje el plato en una incubadora alrededor de 5 min a 37 ° C para el proceso de digestión.
  3. Use un microscopio (40x) para examinar las células y asegúrese de que la mayoría de las células se hayan separado del fondo del plato.
  4. Agregue 2 ml de la solución de neutralización para detener la digestión y transferir las células a un tubo de 15 ml. Pipeta hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min.
  5. Retire el sobrenadante lentamente. Resuspend las células con 10 mL de G-medio y cuenta el número de células.
  6. Agregue aproximadamente 1 x 106 celdas en 10 ml de G-medium y 10 μM Y-27632 a cada plato de 100 mm.
  7. Renueve el G-medium y el Y-27632 cada 2 días. Vea las celdas en el día 1 y el día 5.

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Resultados

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del método de explantación directa y el método enzimático modificado. El método de explante directo no necesita ninguna enzima digestiva durante todo el proceso. En contraste, el método enzimático tradicional generalmente necesita dos conjuntos de enzimas digestivas, dispasa y colagenasa, para separar la lámina epitelial de la capa de fibroblastos subyacente, y luego tripsina para liberar las células epiteliales en suspensión. Nuestro nuevo método ...

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Discusión

El tejido gingival es una estructura clave que mantiene la integridad periodontal y la salud. Las células epiteliales gingivales tienen un papel importante en la reparación y regeneración del tejido periodontal y se pueden utilizar en la investigación científica y las aplicaciones clínicas y campos relacionados, incluida la biología oral, la farmacología, la toxicología y las deficiencias de la mucosa oral18. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método estable y eficiente para cosechar célula...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2019ZD36) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shandong (2019GSF108107) a X.W.; el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shandong (2018GSF118240) a J.G.; Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la Provincia de Shandong (2018WS163) a Z.X., y el Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la Provincia de Shandong (2019WS045) a J.S.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
NombresAbreviaturas & Comentarios
Contador de células automatizado CountessShanghai Ruiyu Bio-science& La tecnología Co.Ltd.BBA0218ACRecuento automático de células
Incubadora de CO2Thermo Scientific51026333para la incubación de células
Centrífuga Sorvall ST 16R CentrífugaThermo Scientific75004380Cell
plato de cultivo celularEppendorf30702115para cultivo celular
Tubo de centrífuga de 50 mlKIRGEN171003Para centrifugación celular
Microcentrífuga de 1,5 ml TubosKIRGEN190691JPara la digestión celular
Filtro de célulasCorning incorporado431792Filtración celular
Solución tamponada de fosfatoSolarbio Life ScienceP1020-500Solución de lavado
DMEMThermo ScientificC11995500Componente del medio de neutralización
Vida K-SFMdefinida Tecnologías10785-012Medio de cultivo de células epiteliales gingivales
Penicilina EstreptomicinaThermo Scientific15140-122Antibióticos
Suero Fetal BovinoIndustrias Biológicas04-001-1AC5Componente del medio de neutralización
0.05% TripsinaLife Technologies25300-062dilución de disociación de HGGEPCs
Life Technologies50-9701Para la matriz de recubrimiento
DispasaGibco17105-041Para el aislamiento de HGGEPCs
Colagenasa Tipo ILife Technologies17100-017Para el aislamiento de HGGEPCs
F12 Nutrient Mix, HamsLife Technologies31765035componente del medio G
B27 SuplementoLife Technologies17504044Factor de crecimiento en medio G
FGF-2 Millipore MerckBiosciences341595Factor de crecimiento en medio G
Y-27632Operacióngénica IAD1011inhibidor de ROCK
FungizoneGibco15290026Preparación para
EGF en medio G Proteína humana recombinanteGibcoPHG0311Factor de crecimiento en medio G
Kit de recuento de células-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04para el ensayo de proliferación celular
Conejo Anti-Humano CK18Abcamab82254Para la tinción de inmunofluorescencia para verificar el marcador de diferenciación de HGGEPCs
Conejo Anti-Humano Citoqueratina10Abcamab76318Para la tinción de inmunofluorescencia para verificar el marcador de diferenciación de HGGEPCs
Tecnología de señalización celular Vimentina anti-humanade3390Para la tinción por inmunofluorescencia de fibroblastos gingivales
Conejo anti-humano pan-ckBD550951Para la tinción por inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de los HGGEPCs
conejo anti-Ki67Abcam15580Para la tinción por inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de los HGGEPCs
conejo anti-p63Biolegend619002Para la tinción de inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de los HGGEPCs
conejo anti-p75NGFRAbcamab52987Para la tinción con inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de los HGGEPCs
Para medio de ratón

Referencias

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