Artículo de método

Aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas primarias utilizando Y-27632

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DOI:

10.3791/62978

6 de noviembre de 2021

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un método modificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales gingivales humanas mediante la adición del inhibidor de Rock, Y-27632, al método tradicional. Este método es más fácil, consume menos tiempo, mejora las propiedades de las células madre y produce un mayor número de células epiteliales de alto potencial tanto para el laboratorio como para aplicaciones clínicas.

Resumen

El tejido gingival es la primera estructura que protege los tejidos periodontales y desempeña un papel significativo en muchas funciones orales. El epitelio gingival es una estructura importante del tejido gingival, especialmente en la reparación y regeneración del tejido periodontal. El estudio de las funciones de las células epiteliales gingivales tiene un valor científico crucial, como la reparación de defectos orales y la detección de la compatibilidad de los biomateriales. Como las células epiteliales gingivales humanas son células queratinizadas altamente diferenciadas, su vida útil es corta y son difíciles de pasar. Hasta ahora, solo hay dos formas de aislar y cultivar células epiteliales gingivales, un método de explante directo y un método enzimático. Sin embargo, el tiempo requerido para obtener células epiteliales utilizando el método de explante directo es más largo, y la tasa de supervivencia celular del método enzimático es menor. Clínicamente, la adquisición de tejido gingival es limitada, por lo que se necesita un sistema de aislamiento y cultivo in vitro estable, eficiente y simple. Mejoramos el método enzimático tradicional agregando Y-27632, un inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK), que puede promover selectivamente el crecimiento de las células epiteliales. Nuestro método enzimático modificado simplifica los pasos del método enzimático tradicional y aumenta la eficiencia del cultivo de células epiteliales, lo que tiene ventajas significativas sobre el método de explante directo y el método enzimático.

Introducción

La encía humana, la estructura de defensa de primera línea que protege el tejido periodontal, no solo es una barrera física y química1,sino que también segrega diferentes clases de mediadores inflamatorios que participan en las respuestas inmunes y constituyen una barrera inmune2,3. El epitelio gingival juega un papel importante en la reparación y regeneración del tejido periodontal. Por lo tanto, estudiar la defensa y la inmunidad del epitelio gingival es de gran importancia para comprender la aparición, el diagnóstico y el tratamiento de la periodontitis. El aislamiento y cultivo de c....

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Protocolo

Los tejidos humanos utilizados en este protocolo son tejidos gingivales adultos frescos descartados de las extracciones de dientes impactados en el Departamento de Cirugía Maxilofacial de acuerdo con las directrices del Comité de Ética en Investigación Humana de la Institución (Protocolo No. GR201711, Fecha: 27-02-2017).

1. Preparativos

  1. Recolectar tejidos gingivales adultos frescos en tubos de 15 ml que contengan 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con penicilina/estreptomicina al 3% (P/S) y mantener los tejidos a 4 °C.
    NOTA: Trate los tejidos como se detalla a continuación dentro ....

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Resultados

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del método de explantación directa y el método enzimático modificado. El método de explante directo no necesita ninguna enzima digestiva durante todo el proceso. En contraste, el método enzimático tradicional generalmente necesita dos conjuntos de enzimas digestivas, dispasa y colagenasa, para separar la lámina epitelial de la capa de fibroblastos subyacente, y luego tripsina para liberar las células epiteliales en suspensión. Nuestro nuevo método .......

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Discusión

El tejido gingival es una estructura clave que mantiene la integridad periodontal y la salud. Las células epiteliales gingivales tienen un papel importante en la reparación y regeneración del tejido periodontal y se pueden utilizar en la investigación científica y las aplicaciones clínicas y campos relacionados, incluida la biología oral, la farmacología, la toxicología y las deficiencias de la mucosa oral18. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método estable y eficiente para cosechar célula.......

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Divulgaciones

Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2019ZD36) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shandong (2019GSF108107) a X.W.; el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shandong (2018GSF118240) a J.G.; Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la Provincia de Shandong (2018WS163) a Z.X., y el Proyecto de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Médica y de la Salud de la Provincia de Shandong (2019WS045) a J.S.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
NombresAbreviaturas & Comentarios
Contador de células automatizado CountessShanghai Ruiyu Bio-science& La tecnología Co.Ltd.BBA0218ACRecuento automático de células
Incubadora de CO2Thermo Scientific51026333para la incubación de células
Centrífuga Sorvall ST 16R CentrífugaThermo Scientific75004380Cell
plato de cultivo celularEppendorf30702115para cultivo celular
Tubo de centrífuga de 50 mlKIRGEN171003Para centrifugación celular
Microcentrífuga de 1,5 ml TubosKIRGEN190691JPara la digestión celular
Filtro de célulasCorning incorporado431792Filtración celular
Solución tamponada de fosfatoSolarbio Life ScienceP1020-500Solución de lavado
DMEMThermo ScientificC11995500Componente del medio de neutralización
Vida K-SFMdefinida Tecnologías10785-012Medio de cultivo de células epiteliales gingivales
Penicilina EstreptomicinaThermo Scientific15140-122Antibióticos
Suero Fetal BovinoIndustrias Biológicas04-001-1AC5Componente del medio de neutralización
0.05% TripsinaLife Technologies25300-062dilución de disociación de HGGEPCs
Life Technologies50-9701Para la matriz de recubrimiento
DispasaGibco17105-041Para el aislamiento de HGGEPCs
Colagenasa Tipo ILife Technologies17100-017Para el aislamiento de HGGEPCs
F12 Nutrient Mix, HamsLife Technologies31765035componente del medio G
B27 SuplementoLife Technologies17504044Factor de crecimiento en medio G
FGF-2 Millipore MerckBiosciences341595Factor de crecimiento en medio G
Y-27632Operacióngénica IAD1011inhibidor de ROCK
FungizoneGibco15290026Preparación para
EGF en medio G Proteína humana recombinanteGibcoPHG0311Factor de crecimiento en medio G
Kit de recuento de células-8Dojindo Molecular TechnologiesCK04para el ensayo de proliferación celular
Conejo Anti-Humano CK18Abcamab82254Para la tinción de inmunofluorescencia para verificar el marcador de diferenciación de HGGEPCs
Conejo Anti-Humano Citoqueratina10Abcamab76318Para la tinción de inmunofluorescencia para verificar el marcador de diferenciación de HGGEPCs
Tecnología de señalización celular Vimentina anti-humanade3390Para la tinción por inmunofluorescencia de fibroblastos gingivales
Conejo anti-humano pan-ckBD550951Para la tinción por inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de los HGGEPCs
conejo anti-Ki67Abcam15580Para la tinción por inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de los HGGEPCs
conejo anti-p63Biolegend619002Para la tinción de inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de los HGGEPCs
conejo anti-p75NGFRAbcamab52987Para la tinción con inmunofluorescencia para comprobar el marcador de diferenciación de los HGGEPCs
Para medio de ratón

Referencias

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Im....

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