Aquí describimos un protocolo para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Para obtener organoides cerebrales en grandes cantidades y de alta calidad, utilizamos mini biorreactores caseros.
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Artículo de método
Generación de organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas en mini biorreactores caseros
En este artículo
Resumen
Resumen
El organoide cerebral derivado de iPSC es una tecnología prometedora para el modelado in vitro de las patologías del sistema nervioso y el cribado de fármacos. Esta tecnología ha surgido recientemente. Todavía está en su infancia y tiene algunas limitaciones aún sin resolver. Los protocolos actuales no permiten que la obtención de organoides sea lo suficientemente consistente para el descubrimiento de fármacos y estudios preclínicos. La maduración de los organoides puede tardar hasta un año, lo que empuja a los investigadores a lanzar múltiples procesos de diferenciación simultáneamente. Impone costos adicionales para el laboratorio en términos de espacio y equipo. Además, los organoides cerebrales a menudo tienen una zona necrótica en el centro, que sufre de deficiencia de nutrientes y oxígeno. Por lo tanto, la mayoría de los protocolos actuales utilizan un sistema circulante para el medio de cultivo para mejorar la nutrición.
Mientras tanto, no hay sistemas dinámicos baratos o biorreactores para el cultivo de organoides. Este artículo describe un protocolo para producir organoides cerebrales en mini biorreactores caseros compactos y económicos. Este protocolo permite obtener organoides de alta calidad en grandes cantidades.
Introducción
Los modelos derivados de iPSC humanos son ampliamente utilizados en los estudios de trastornos del neurodesarrollo y neurodegenerativos1. Durante la última década, los modelos de tejido cerebral en 3D, los llamados organoides cerebrales, complementaron esencialmente los cultivos neuronales 2D tradicionales2. Los organoides recapitulan en cierta medida la arquitectura 3D del cerebro embrionario y permiten un modelado más preciso. Se publican muchos protocolos para la generación de organoides que representan diferentes regiones cerebrales: corteza cerebral3,4,....
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Protocolo
NOTA: Utilice la técnica estéril en todo el protocolo, excluyendo los pasos 1.2 y 1.3. Calentar todos los medios de cultivo y soluciones a 37 °C antes de aplicar sobre células u organoides. Cultive células en una incubadora de CO2 a 37 °C en 5% de CO2 sobre 80% de humedad. El esquema de protocolo se muestra en la Figura 1.
1. Transformación de placas de Petri en mini biorreactores
- Cortar tubos centrífugos estériles de 15 ml en anillos de 7-8 mm de altura; autoclave los anillos.
- Rompe las placas de Petri de baja adherencia, no tratadas o microbiológicas ....
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Resultados
El esquema de protocolo se muestra en la Figura 1. El protocolo incluyó cinco medios en los que las iPSC se diferenciaron en organoides cerebrales durante al menos un mes. La diferenciación se inició entonces las iPSC alcanzaron la confluencia del 75-90%(Figura 2A,B). Los primeros signos de diferenciación hacia las neuronas se observaron en los días 10-11 de cultivo de iPSC en el medio A cuando las células comenzaron a agruparse en "rosetas"
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Discusión
El protocolo descrito tiene dos pasos cruciales que permiten la generación de organoides de alta calidad de tamaño uniforme. Primero, los organoides crecen a partir de esferoides que son casi idénticos en número de células y madurez celular. En segundo lugar, los biorreactores caseros proporcionan a cada organoide un entorno uniforme, donde los organoides no se amontonan ni se pegan.
La calidad celular y el estado de maduración celular son esenciales para realizar el protocolo. Es fundamental .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención 075-15-2019-1669 del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia (análisis RT-PCR) y por la subvención No. 19-15-00425 de la Fundación Rusa de Ciencia (para todos los demás trabajos). Los autores también agradecen a Pavel Belikov por su ayuda con la edición de video. Las figuras en el manuscrito fueron creadas con BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Avanzado DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | Placa de cultivo de 24 pocillos con micropocillos |
| Suplemento B-27 | Gibco | 17504044 | Suplemento neuronal B |
| GlutaMAX Suplemento | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanil-L-glutamina |
| BDNF humano | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| FGF-2 Humano | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| GDNF Humano | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| Suero KnockOut Reemplazo | Gibco | 10828028 | Reemplazo de suero |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Medio de células madre pliripotentes |
| Suplemento N2 | Gibco | ||
| Medio Neurobasal | Gibco | 21103049 | Medio basal para el mantenimiento de las células neuronales |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocina | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobianos |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| VástagoMACS Dorsomorfina | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorfina |
| VástagoMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| VástagoMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Solución de Azul de Tripán | Gibco 15250061 | ||
| Solución Versen | Gibco | 15040066 | 0,48 mM EDTA en PBS |
| β-mercaptoetanol | Gibco | 31350010 |
Referencias
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F.
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Reimpresiones y permisos
