Pinzas magnéticas en formato de microplaca

Resumen

Aquí, describimos el uso de un nuevo ensayo de microplacas para permitir la manipulación mecánica de biomoléculas mientras se realizan ensayos bioquímicos conjuntos. Esto se logra utilizando una tapa de microplaca modificada con imanes para crear múltiples pinzas magnéticas estáticas a través de la microplaca.

Resumen

La mecanobiología describe cómo las fuerzas físicas y las propiedades mecánicas del material biológico contribuyen a la fisiología y la enfermedad. Por lo general, estos enfoques son métodos limitados de una sola molécula, lo que restringe su disponibilidad. Para abordar esta necesidad, se desarrolló un ensayo de microplaca que permite la manipulación mecánica mientras se realizan ensayos bioquímicos estándar. Esto se logra utilizando imanes incorporados en una tapa de microplaca para crear múltiples pinzas magnéticas. En este formato, la fuerza se ejerce a través de biomoléculas conectadas a perlas paramagnéticas, equivalente a una pinza magnética típica. El estudio demuestra la aplicación de esta herramienta con ensayos basados en FRET para monitorear las conformaciones de proteínas. Sin embargo, este enfoque es ampliamente aplicable a diferentes sistemas biológicos que van desde la medición de la actividad enzimática hasta la activación de vías de señalización en células vivas.

Introducción

La mecanobiología se centra en comprender cómo la propagación de fuerzas físicas dentro y entre las células regula la actividad celular ^1,2 y cómo esto se correlaciona con la organización y la dinámica tanto de las proteínas como de las células.

Las mediciones de fuerza de una sola molécula han revelado cómo se utiliza la fuerza en los sistemas biológicos, desde proteínas individuales hasta células y tejidos enteros 3,4,5,6,7. Estos experimentos desafiantes requieren equipo especializado y experiencia técnica. Por el contrario, los ensayos bioquímicos estándar se pueden realizar con un mayor rendimiento en equipos comerciales fácilmente disponibles.

Aquí, el estudio describe un ensayo de mecanobiología que permite realizar conjuntamente la manipulación basada en pinzas magnéticas y los ensayos bioquímicos⁸. Los imanes se colocan en una tapa de microplaca impresa en 3D (Figura 1A-D), lo que permite el uso de lectores de placas comerciales para los ensayos. La fuerza se aplica a través de la biomolécula de interés acoplando la molécula a partículas paramagnéticas. A continuación, los imanes ejercen tensión a través de la molécula. La alteración de la distancia entre las partículas y los imanes ajusta la fuerza ejercida a través de la biomolécula (Figura 1E).

Representamos el uso de este ensayo utilizando el motor molecular basado en actina, Myosin VI. La miosina VI está regulada por el plegamiento intramolecular⁹. Se ha demostrado que la miosina VI existe en un estado autoinhibido, en el que la unión de proteínas asociadas, como NDP52, desencadena el despliegue de la miosina VI^10,11. Para realizar estos ensayos, utilizaremos una construcción de doble etiqueta del dominio de cola de miosina VI con una GFP N-terminal y una RFP C-terminal mediante la cual el plegamiento de la proteína genera una transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) entre GFP y RFP. El N-terminal también lleva una etiqueta de biotinilación para inmovilizar la proteína en la superficie. Utilizamos este ensayo en combinación con las mediciones de FRET para mostrar cómo la fuerza puede afectar al plegado posterior de la miosina VI.

Protocolo

Las proteínas de muestra necesarias para este experimento y una lista de reactivos se encuentran en la Tabla de Materiales. Se deben producir proteínas equivalentes para el sistema de estudio del usuario para medir los cambios en la conformación.

1. 3D tapa magnética impresa

1. Diseñe una tapa de microplaca para alojar los imanes dentro de una microplaca de 24 pocillos. Se puede descargar un archivo CAD de ejemplo desde GitHub¹². Las mediciones se muestran en la Figura 1.
   NOTA: La altura del pedestal se puede modificar para cambiar la distancia entre los imanes y la superficie para alterar la fuerza aplicada. Además, la fuerza final ejercida sobre la partícula depende del tamaño de la partícula y del espacio entre el par de imanes. Las ecuaciones para calcular la fuerza aplicada para partículas de 1 μm y 2,8 μm a espacios de 0,5 mm, 1 mm y 2 mm se dan en Dos Santos et ^al.8. Para los experimentos descritos aquí con partículas de 2,8 μm y un espacio de 2 mm, utilice la Ecuación 1.
   Ecuación 1:
2. Imprime en 3D una tapa de microplaca con tereftalato de polietileno glicol (PETG) en un sistema de impresora 3D.
   NOTA: Utilice una impresora con una resolución de capa de 0,02 mm para permitir la precisión y la reproducibilidad. El impacto de la precisión de la impresora se discutió en Dos Santos et ^al.8.
3. Fije pares de imanes cúbicos de neodimio N42 de 5 mm con adhesivo a los pedestales con los polos magnéticos orientados para crear el campo dirigido hacia la parte inferior de la microplaca.
4. Deje al menos 1 posición vacía para que actúe como un control sin imanes.
5. Almacene en un recipiente sellado de tamaño suficiente para colocar y quitar fácilmente la tapa.

2. Modificación de la superficie de la microplaca

1. Tome una microplaca de 24 pocillos con fondo de vidrio limpia, sin tratar.
2. Lave los pocillos 3 veces con 500 μL de tampón de lavado (50 mM de Tris-HCl (pH 7,5) y 50 mM de NaCl) a temperatura ambiente.
3. Añadir 200 μL de biotina-BSA (0,2 mg/mL) en el tampón de lavado y dejar reposar durante 15 min a temperatura ambiente.
   NOTA: La biotina-BSA se utiliza tanto para la pasivación como para la fijación. Se pueden utilizar otras estrategias de pasivación y fijación de superficies. Para el primer uso y la optimización, la concentración de biotina-BSA se puede variar hasta 1 mg/mL.
4. Lave los pocillos 3 veces con 500 μL de tampón de lavado.
5. Añadir 200 μL de estreptavidina (20 μg/mL) en el tampón de lavado y dejarlo reposar durante 15 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Para el primer uso, la concentración de estreptavidina puede variar hasta 1 mg/mL.
6. Retire la solución y luego lave los pocillos 3 veces con tampón de lavado.
7. Cubra los pocillos con 500 μL de tampón de lavado.
8. Almacenar a 4 °C hasta que esté listo para usar. Los platos deben usarse el mismo día.

3. Preparación de la muestra: Inmovilización de proteínas

1. Deje que la microplaca modificada en la superficie alcance la temperatura ambiente.
2. Lave los pocillos con 500 μL de tampón de lavado.
3. Añadir 100 nM de biotina-eGFP-miosina VI Tail-mRFP (proteína de muestra madre) e incubar durante 15 min a temperatura ambiente en tampón de lavado.
   NOTA: Esta proteína de ejemplo se produce tal y como la describe Dos Santos et ^al.8. Las concentraciones y los tiempos de incubación pueden variar dependiendo de la proteína.
4. Lave los pocillos 3 veces con 500 μL de tampón de lavado.
5. Configure el lector de placas para registrar espectros de fluorescencia para GFP (excitación de 490 nm y emisión de 510-600 nm) y RFP (excitación de 560 nm y emisión de 580-650 nm) para confirmar la presencia de las proteínas de fusión.
6. Si hay una falta de proteína, aumente la concentración en el paso 3.3.
   NOTA: Una mala unión podría relacionarse con una unión inadecuada de biotina-BSA y/o estreptavidina y, por lo tanto, las cantidades podrían aumentar 10 veces.
7. Si es posible, realice una medición de pocillo para determinar si la proteína de fusión está unida a través de la microplaca (Figura 2).
   NOTA: Esta medición registrará la intensidad de fluorescencia en puntos específicos a través del pocillo de la microplaca. Revelará si la proteína está unida a través del pozo.
8. Asegúrese de que la señal sea uniforme (dentro del 5%) en el centro del pozo donde se realiza la medición del ensayo.

4. Preparación de cordones magnéticos

1. Agite el vial de perlas paramagnéticas de 2,8 μm con Proteína A recombinante (Tabla de Materiales) durante 30 s para resuspender las perlas.
2. Transfiera el volumen correspondiente a 1 mg de perlas paramagnéticas a un tubo de 1,5 mL.
3. Coloque el tubo en un aislador magnético (Tabla de Materiales) y luego retire el sobrenadante.
4. Vuelva a suspender las perlas en 200 μL de PBS pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo.
5. Coloque el tubo en el aislador magnético y luego retire el sobrenadante.
6. Repite el paso de lavado 3 veces.
7. Diluir 10 μg de anticuerpo Anti-RFP en 200 μL de PBS.
8. Aísle las perlas en el aislador magnético y luego vuelva a suspenderlas en la solución de anticuerpos.
9. Gire a 20 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotor de sobremesa.
10. Coloque el tubo en el aislador magnético y retire el sobrenadante.
11. Lavar 3 veces en PBS.
12. Vuelva a suspender las perlas en 200 μL de tampón de lavado.
13. Para confirmar la inmovilización de anticuerpos en las perlas, incube las perlas cargadas de anticuerpos con una solución de proteína de fusión RFP de >1 μM.
    NOTA: Confirme visualmente si la proteína está aislada por las perlas.
14. Alternativamente, mida la intensidad de fluorescencia del sobrenadante (excitación 560 nm y emisión 580-650 nm) para RFP en un espectrómetro de fluorescencia.

5. Preparación de la muestra: Accesorio de cuentas

1. Añada 10 μg de la fusión paramagnética perla-anticuerpo diluida en tampón de lavado (200 μL) a los pocillos de microplacas unidos a proteínas.
2. No coloque perlas en un pocillo de control para verificar el efecto de las perlas en la señal fluorescente. Prepare una muestra de control sin anticuerpos para determinar cualquier interacción inespecífica con las perlas.
3. Incubar la microplaca a temperatura ambiente durante 30 min.
4. Lave los pocillos 3 veces con 500 μL de tampón de lavado.
5. Si está disponible localmente, verifique que las perlas estén unidas a la superficie en un microscopio de campo claro. Si faltan perlas, aumente la concentración en el paso 5.1 a 500 μg/mL.

6. Adquisición de datos

1. Coloque la microplaca, sin tapa, en un lector de placas fluorescente a 25 °C.
2. Configure el lector de placas para registrar espectros de fluorescencia para GFP (excitación de 490 nm y emisión de 510-600 nm) y RFP (excitación de 560 nm y emisión de 580-650 nm) para confirmar la presencia de las proteínas de fusión.
   NOTA: Mida/registre los espectros de fluorescencia a través de la parte inferior de la microplaca para colocar la tapa en la parte superior. Por lo tanto, se debe seleccionar un lector de microplacas adecuado.
3. Registre un espectro de fluorescencia FRET (excitación de 490 nm y emisión de 510-650 nm), o controle la fluorescencia a 510 nm y 610 nm con excitación a 490 nm. Esto se configura de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Retire la microplaca del lector y agregue la tapa magnética.
5. Regrese al lector de placas y deje la muestra durante 2 minutos.
6. Repita la medición FRET, como en el paso 6.3.

7. Análisis de datos

1. Exporte los datos para importarlos a una hoja de cálculo (por ejemplo, Excel).
2. Extraiga manualmente los datos para la GFP del donante a 510 nm y la RFP del aceptor a 610 nm.
3. Calcule el FRET relativo utilizando la Ecuación 2 para cada condición.
   Ecuación 2:
   A: intensidad del aceptor (RFP 610 nm), D: intensidad del donante (GFP 510 nm).
   NOTA: Utilice el RFP recombinante en las mismas condiciones de excitación y emisión para controlar la excitación de fondo del aceptor.

Resultados

La Figura 2 muestra un ejemplo de una medición de escaneo de pocillo en la que la intensidad de fluorescencia de GFP se ha registrado a intervalos de 1 mm a través del pocillo de microplaca. Las mediciones típicas de fluorescencia se realizan en la posición central del pocillo de la microplaca (posición 8,8 en la Figura 2); Por lo tanto, es importante que haya proteína unida en este lugar. Como se muestra en la Figura 2, la intensid...

Discusión

Este enfoque permite que las mediciones basadas en la fuerza se apliquen fácilmente en una microplaca utilizando lectores de placas fluorescentes. Es importante destacar que este formato de ensayo asume que hay una proteína funcional cuando se une a una superficie. Por lo tanto, se requieren conocimientos previos antes de embarcarse en estas mediciones para garantizar que haya actividad proteica. También es beneficioso asegurarse de que la unión de las moléculas a las perlas paramagnétic...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microplaca con fondo de vidrio de 24 pocillos	Cellvis	P24-1.5H-N	Hay múltiples fuentes disponibles. A menos que sea necesario, es mejor evitar las superficies tratadas y utilizamos vidrio de grado de imagen N1.5.
Anticuerpo anti-RFP	Abcam	ab290	Existen múltiples fuentes, pero deben garantizar una reactividad mínima con GFP.
Microscopio óptico de sobremesa	Optika	IM-3
Rotador de sobremesa	Cole-Palmer-Stuart	SB3
Biotin-BSA	Sigma Aldrich	A8549
Software CAD - Sketch Up Educator	Sketch Up		Se pueden utilizar softwares CAD alternativos. Los usuarios deben asegurarse de que los formatos de archivo sean compatibles con su impresora 3D.
Dynabeads Proteína A	Fisher Scientific 10746713		2.8 y micro; m perlas paramagnéticas con proteína A recombinante
adhesivo de contacto por impacto	EVO-STIK
MagnaRack bastidor de separación magnética	ThermoFisher Scientific	CS15000	magnético
NaCl	Fisher Scientific	10316943
Neodimio N42 Imanes cúbicos de 5 mm	Supermagnete	W-05-N
- ClarioStar	BMG Labtech		Todos los sistemas de lectura de placas se pueden utilizar cuando las mediciones son posibles desde debajo de la microplaca. La tapa del imán excluye las mediciones estándar de arriba
Estreptavidina	Sigma Aldrich	189730
Tris-HCl	Fisher Scientific	10142400
Ultimaker PETG Filamento	Ultimaker Ultimaker
S3 - Impresora 3D	Ultimaker

aislador