La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.
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Artículo de método
Respirometría de alta resolución para evaluar la bioenergética en células y tejidos utilizando respirómetros basados en cámaras y placas
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Resumen
Resumen
La respirometría de alta resolución (HRR) permite monitorear la fosforilación oxidativa en tiempo real para el análisis de estados de energía celular individuales y la evaluación de complejos respiratorios utilizando protocolos diversificados de titulación de sustrato-desacoplador-inhibidor (SUIT). Aquí, se demuestra el uso de dos dispositivos de respirometría de alta resolución, y se presenta una colección básica de protocolos aplicables para el análisis de células cultivadas, fibras esqueléticas y del músculo cardíaco, y tejidos blandos como el cerebro y el hígado. Se proporcionan protocolos para células y tejidos cultivados para un respirómetro basado en cámara y células cultivadas para un respirómetro basado en microplacas, ambos que abarcan protocolos de respiración estándar. Para fines comparativos, las células HEK293 diseñadas por CRISPR deficientes en la traducción mitocondrial que causan deficiencia múltiple del sistema respiratorio se utilizan con ambos dispositivos para demostrar defectos celulares en la respiración. Ambos respirómetros permiten una medición integral de la respiración celular con sus respectivos méritos técnicos e idoneidad dependiendo de la pregunta de investigación y el modelo en estudio.
Introducción
Las mitocondrias cumplen con la provisión clave de energía y son un orgánulo compartimentado que contribuye a procesos bioenergéticos y metabólicos celulares esenciales como el anabolismo de nucleótidos, lípidos y aminoácidos, la biogénesis del grupo hierro-azufre y están implicadas en la señalización como la muerte celular controlada 1,2,3 . La bioenergética mitocondrial a través de la fosforilación oxidativa contribuye a casi todos los procesos celulares dentro de la célula, y en consecuencia, las disfunciones mitocondriales de origen primario o secundario se asocian con un....
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Protocolo
Toda la experimentación con animales se realiza de acuerdo con la Junta Nacional de Revisión de Experimentos con Animales y la Agencia Administrativa Estatal Regional para el Sur de Finlandia. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6JOlaHsd (4-6 meses de edad). El consentimiento para el uso de líneas celulares humanas se obtuvo del comité de ética institucional de la Universidad de Helsinki.
1. Respirometría de alta resolución: respirómetro basado en cámara (cHRR)
NOTA: Los experimentos en esta sección del protocolo se realizaron utilizando el Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tab....
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Resultados
Aquí, proporcionamos protocolos para determinar la bioenergética mitocondrial en células eucariotas, tejido no fibroso (por ejemplo, cerebelo) y tejido fibroso (por ejemplo, músculo esquelético). Para las células eucariotas, HEK293 con knockout diseñado por CRISPR de dos proteínas diferentes asociadas con la traducción mitocondrial que resultan en deficiencia múltiple (CRISPRKO1) y severa / completa de OXPHOS (CRISPRKO2) se midieron con cHRR (Figura 3A-C
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Discusión
Tradicionalmente, la bioenergética mitocondrial se ha estudiado con electrodos de oxígeno tipo Clark. Sin embargo, la falta de resolución y rendimiento justificaba el avance tecnológico. Hasta la fecha, el O2k (conocido como cHRR) y el seahorse XF96 Flux Analyzer (conocido como mHRR) han sido ampliamente adoptados en el campo de la bioenergética celular. Aquí, presentamos una colección comprensible de protocolos para el análisis del metabolismo energético celular a través de la evaluación de la respiración mitocondrial u.......
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Divulgaciones
No hay conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Academia de Finlandia (C.B.J), la Fundación Magnus Ehrnroot (C.B.J)), y una beca de doctorado de la Escuela de Graduados de Ciencias de la Vida Integrada (R.A.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2 mL Potter-Elvehjem Trituradora/Homogeneizadora de Vidrio/PTFE | Omni International | 07-358029 | |
| 95% O2, 5% CO2 mezcla de gases medicinales Potter | para la molienda de tejidos | ||
| ADP | Sigma | A 4386 | |
| Antimicina A | Sigma | A 8674 | |
| Ascorbato | Merck | PHR1279-1G | Químico, disuelva en etanol |
| BSA (libre de ácidos grasos) | Sigma | A 6003 | Químico |
| CaCO3 | Sigma | C 4830 | Químico |
| Citocromo C | Sigma | C 7752 | Químico |
| Digitonina | Sigma | D 5628 | Químico |
| Ditiotreitol | Sigma | D 0632 | Químico, disolver en DMSO |
| D-sacarosa | Roth | 4621.1 | |
| Dulbecco químico Águila modificada' s medio (glucosa alta) | Fisher Scientific | 41965-039 | |
| Dulbecco' químico Águila modificada' s medio (sin glucosa) | Fisher Scientific | A14430-01 | |
| EGTA | Sigma | E 4378 | |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | Chemical |
| Falcon 15 ml Tubos de centrífuga cónicos | Fisher Scientific | AM12500 | |
| Chemical Falcon 50 ml Tubos de centrífuga cónicos | Fisher Scientific | AM12501 | |
| FCCP | Sigma | C 2920 | |
| Glucosa | Sigma | G7021 | Químico, disolver en etanol |
| Glutamato | Sigma | G 1626 | |
| GlutaMax ( 100x) (200 nM L-alanil-L-glutamina dipéptido) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Químico Células HEK293 | ATTC | CRL-1573 | |
| Hemocitómetro | Fisher Scientific | 0267151B | Instrumento para el recuento de células |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Químico |
| Imidazol | Fluka | 56750 | Químico |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| L-carnitina | Sigma | C0283 | Malato químico |
| Sigma | M 1000 | Hidrato químico | |
| MES | Sigma | M8250 | MgCl químico |
| 2 | Sigma | M 9272 | Químico |
| Na2ATP | Sigma | A 2383 | Na |
| 2Fosfocreatina | Sigma | P 7936 | |
| Na-piruvato químico ( 100 mM) (100 veces) | Fisher Scientific | 11360070 | |
| NEAA ( Aminoácidos no esenciales) 100x | Fisher Scientific | 11140035 | |
| FBS normal ( 10x) | Fisher Scientific | 10500064 | |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 Instrumento de | respirometría de alta resolución |
| O2k-Set de valoración | Oroboros Instruments | 20820-03 | Jeringas Hamilton para inyecciones químicas |
| Oligomicina | Sigma | O 4876 | Químico, disuelto en etanol |
| palmitoilcarnitina | Sigma | P 4509 | Químico |
| Penicilina-Estreptomicina | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Kit de ensayo de proteínas BCA | Fisher Scientific | 23227 | |
| Piruvato | Sigma | P 2256 | Químico |
| Tampón RIPA | Fisher Scientific | 89900 | |
| Rotenona | Sigma | R 8875 | Químico, disuelto en |
| etanol Saponina | Sigma | S7900 | Químico |
Paquete mediano de ensayo Seahorse XF DMEM, pH 7.4 | Agilent, Santa Clara, CA | 103680-100 | |
| Seahorse XFe96 Analizador de flujo extracelular | Agilent, Santa Clara, CA | Instrumento de respirometría de alto rendimiento | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent, Santa Clara, CA | br/> Incluye placas de ensayo, cartuchos, guías de carga para transferir compuestos al cartucho de ensayo y solución de calibrante. | |
| Tijeras pequeñas | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Azida de sodio | Sigma | S2002 | |
| Succinato | Sigma | S 2378 | Químico |
| Taurina | Sigma | T 8691 | Químico |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Químico |
| Solución de azul de tripán | Merck | 72-57-1 | Químico |
| Tripsina 0.25% EDTA | Fisher Scientific | 25200056 | |
| Dos pinzas de borde fino | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Caldo de uridina (500x) | Sigma | U3750 | Chemical |
Referencias
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity. Beyond ATP. Nature Reviews Immunology. 17 (10), 608-620 (2017).
- Spi....
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Reimpresiones y permisos
