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Artículo de método

Respirometría de alta resolución para evaluar la bioenergética en células y tejidos utilizando respirómetros basados en cámaras y placas

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DOI:

10.3791/63000

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26 de octubre de 2021

 , 
1Department of Biochemistry and Developmental Biology, Faculty of Medicine, University of Helsinki

En este artículo

Resumen

La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.

Resumen

La respirometría de alta resolución (HRR) permite monitorear la fosforilación oxidativa en tiempo real para el análisis de estados de energía celular individuales y la evaluación de complejos respiratorios utilizando protocolos diversificados de titulación de sustrato-desacoplador-inhibidor (SUIT). Aquí, se demuestra el uso de dos dispositivos de respirometría de alta resolución, y se presenta una colección básica de protocolos aplicables para el análisis de células cultivadas, fibras esqueléticas y del músculo cardíaco, y tejidos blandos como el cerebro y el hígado. Se proporcionan protocolos para células y tejidos cultivados para un respirómetro basado en cámara y células cultivadas para un respirómetro basado en microplacas, ambos que abarcan protocolos de respiración estándar. Para fines comparativos, las células HEK293 diseñadas por CRISPR deficientes en la traducción mitocondrial que causan deficiencia múltiple del sistema respiratorio se utilizan con ambos dispositivos para demostrar defectos celulares en la respiración. Ambos respirómetros permiten una medición integral de la respiración celular con sus respectivos méritos técnicos e idoneidad dependiendo de la pregunta de investigación y el modelo en estudio.

Introducción

Las mitocondrias cumplen con la provisión clave de energía y son un orgánulo compartimentado que contribuye a procesos bioenergéticos y metabólicos celulares esenciales como el anabolismo de nucleótidos, lípidos y aminoácidos, la biogénesis del grupo hierro-azufre y están implicadas en la señalización como la muerte celular controlada 1,2,3 . La bioenergética mitocondrial a través de la fosforilación oxidativa contribuye a casi todos los procesos celulares dentro de la célula, y en consecuencia, las disfunciones mitocondriales de origen primario o secundario se asocian con un amplio espectro de condiciones de enfermedad 4,5. La disfunción mitocondrial no sólo implica alteraciones en la estructura o densidad mitocondrial sino también en la calidad y regulación del sistema respiratorio6. Este elemento cualitativo abarca el control del sustrato, las características de acoplamiento, las modificaciones post-traduccionales, la dinámica cristae y los supercomplejos respiratorios 7,8. Por lo tanto, el análisis preciso de la bioenergética mitocondrial para enfoques experimentales y diagnósticos para evaluar el metabolismo energético de la célula es importante en la salud y la enfermedad.

La fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) es una secuencia de reacciones dentro del sistema respiratorio o sistema de transferencia de electrones (ETS) para la generación de energía celular a través del trifosfato de adenosina (ATP)9. El paso multienzimático para aprovechar la energía del flujo de electrones a través de los complejos I y II al complejo IV genera un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana mitocondrial interna, posteriormente utilizado para la fosforilación de adenosina difosfato (ADP) a ATP a través del complejo V (F1FO ATP sintasa) (Figura 1A).

En primer lugar, se generan portadores de dos electrones durante el ciclo tricarboxílico (TCA), la glucólisis y la oxidación de piruvatos: nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y dihidroflavina adenina dinucleótido (FADH2). El NADH se oxida en el complejo I (NADH deshidrogenasa), durante el cual dos electrones se transfieren a la coenzima Q (la quinona se reduce a quinol), mientras que los protones se bombean al espacio intermembrana (IMS). En segundo lugar, el complejo II (succinato deshidrogenasa) oxida FADH2 y alimenta los electrones a la coenzima Q sin bombear protones. En tercer lugar, en el complejo III (citocromo c oxidorreductasa), los electrones de la coenzima Q se transfieren al citocromo c, mientras que los protones se bombean al IMS. Cuarto, el citocromo c transfiere los electrones al complejo IV (citocromo c oxidasa), el complejo final para bombear protones, y donde el oxígeno funciona como un aceptor de electrones para asimilar protones, formando finalmente agua. Es este oxígeno el que consumen las mitocondrias el que se puede medir mediante un oxígrafo. Finalmente, los protones generados a partir de los complejos I, III y IV se utilizan para rotar el complejo V, generando así ATP9.

Es importante destacar que la transferencia de electrones ocurre no solo de manera lineal, también denotada como la cadena de transporte de electrones. En cambio, los electrones se pueden transferir al grupo de coenzima Q a través de múltiples vías respiratorias y facilitar el flujo convergente de electrones. Los sustratos de NADH y succinato, por ejemplo, pueden entrar a través del complejo I y el complejo II, respectivamente. Los electrones de la oxidación de ácidos grasos se pueden donar a través del complejo de flavoproteína de transferencia de electrones. De hecho, un análisis exhaustivo de OXPHOS requiere un enfoque holístico con sustratos de combustible apropiados (Figura 1A).

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Figura 1: Fosforilación oxidativa mitocondrial y sustrato específico y protocolos inhibidores. (A) Mitocondria y esquema del sistema de transferencia de electrones (CI-CIV) y mitocondrial F1F0 ATP sintasa (CV). Todas las estructuras son de PDB. Las figuras solo representan sustratos e inhibidores descritos en este estudio). (B) Traza de muestra de flujo de oxígeno en células HEK293 intactas utilizando el protocolo estándar en un dispositivo mHRR. (C) Traza de muestra de flujo de oxígeno en células HEK293 intactas utilizando el protocolo estándar en un dispositivo cHRR. (D) Muestra de rastro de flujo de oxígeno en fibroblastos humanos permeabilizados de un donante sano con el protocolo SUIT respectivo. Abreviaturas: 1 = Respiración rutinaria de células intactas; 2 = Estado 2; 3 = Estado 3(I); 4 = Estado 3(I) con cytC; 5 = Estado 3 (I+II); 6 = Fuga (OM); 7 = capacidad del RCDE; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenona, AM = Antimicina, ATP = Trifosfato de adenosina, Az = Azida, OM = Oligomicina, FCCP = Cianuro de carbonilo p-trifluoro-metoxifenil-hidrazona; Asc = Ascorbato, TMPD = N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiamina, Succ = Succinato, M = Malato, P = Piruvato, ADP = Adenosina difosfato, NAD = Nicotinamida adenina dinucleótido, IMS = Espacio intermembrana, FAD = Flavina adenina dinucleótido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El análisis de la capacidad mitocondrial de OXPHOS utilizando HRR se ha convertido en un método bioquímico instrumental de valor diagnóstico no solo para defectos mitocondriales primarios10,11, sino que se extiende a todos los demás ámbitos de la biología, como el cáncer y el envejecimiento12. La HRR permite la determinación de la respiración celular mediante el análisis de la capacidad mitocondrial de OXPHOS, que refleja directamente la deficiencia del complejo respiratorio mitocondrial individual o combinada, e indirectamente se asocia con disfunción celular y metabolismo energético alterado9. Metodológicamente, las mediciones de la respiración se realizan utilizando células, tejidos o mitocondrias aisladas 11,13,14, con material congelado solo parcialmente adecuado15,16. Se ha demostrado que el tejido congelado tiene un ETS intacto con una estabilidad supercompleja mantenida15. Por lo tanto, a diferencia de los intermedios tradicionales de TCA, los sustratos respectivos se introducen directamente en el ETS. Sin embargo, el acoplamiento entre el ETS y la síntesis de ATP se pierde a medida que la integridad de la membrana se ve comprometida por el daño por congelación (formación de cristales de hielo).

Los experimentos de respiración normalmente tienen lugar a una temperatura fisiológica de 37 °C para endotermas en células o tejidos no permeabilizados o permeabilizados. Mientras que el primero considera el contexto metabólico citosólico, el segundo proporciona la contribución energética de los complejos OXPHOS individuales y la ATPasa a través de la adición de sustratos específicos (e inhibidores). La secuencia y la variación de sustratos e inhibidores han llevado al desarrollo de una amplia gama de protocolos SUIT17 y ensayos18 para abordar diversas cuestiones científicas de la función oxphos (revisados bajo12). El protocolo básico de la respiración celular evalúa cuatro estados diferentes: i) respiración de rutina: la respiración en un medio respiratorio respectivo sin ninguna adición de sustratos o inhibidores que consuman sino sustratos endógenos. Este estado puede revelar OXPHOS general o defectos respiratorios inducidos secundariamente causados, por ejemplo, por perfiles de metabolitos alterados. A continuación, la adición del inhibidor de la ATPasa oligomicina revela la permeabilidad de la membrana mitocondrial interna a los protones, definida como ii) respiración por fuga. La titulación posterior de un protonóforo como el cianuro de carbonilo no acoplado p-trifluoro-metoxifenil-hidrazona (FCCP) permite determinar el estado en el que la capacidad de ETS es máxima en un modo de circuito de protones transmembrana abierta, definido como iii) respiración desacoplada. Es importante destacar que un estado desacoplado también puede ocurrir por intervenciones experimentales a través de un daño mecánico excesivo a las membranas mitocondriales. Por el contrario, el estado no acoplado se refiere al desacoplamiento respiratorio por un mecanismo intrínseco que está fisiológicamente controlado. Finalmente, la inhibición completa del ETS mediante la adición del inhibidor del complejo III antimicina y el inhibidor del complejo I rotenona determina el consumo residual de oxígeno (ROX) de procesos no mitocondriales que consumen oxígeno (Figura 1A-C).

La bioenergética mitocondrial consta de cinco estados respiratorios distintos19,20. La respiración de estado 1 es sin sustratos adicionales o ADP, excepto por lo que está disponible endógenamente. Después de la adición de ADP, pero aún así, sin sustratos, se logra la respiración del estado 2. Cuando se agregan sustratos, lo que permite la transferencia de electrones y la síntesis de ATP, se alcanza la respiración del estado 3. En este estado, la capacidad de OXPHOS se puede definir a concentraciones saturadoras de ADP, fosfato inorgánico, oxígeno, sustratos ligados a NADH y succinato. La respiración de estado 4 o respiración LEAK se puede definir como un estado sin ADP o ATP sintasas inhibidas químicamente mientras que tiene sustratos suficientes. Por último, cuando todo el oxígeno se agota (anóxico) en un entorno de cámara cerrada, se observa la respiración de estado 5.

Existen varios métodos para evaluar los estados de energía celular14 con dos dispositivos que dominan la evaluación actual en tiempo real de OXPHOS a través del análisis del consumo de oxígeno, medido como la función de la disminución de oxígeno a lo largo del tiempo en un sistema de cámara cerrada con diferente aplicabilidad dependiendo del modelo experimental y la pregunta de investigación: el respirómetro de alta resolución Oroboros 2k y el analizador de flujo extracelular Seahorse XF. Ambos dispositivos registran las tasas de consumo de oxígeno como una disminución en picomoles (pmol) de oxígeno (O2) por segundo como un valor absoluto dentro de la cámara o microplaca del pozo. El consumo específico de oxígeno por masa se obtiene normalizando el consumo de oxígeno respectivo en una receta tampón específica por número de células (millones), peso tisular (mg) o cantidad de proteína.

El O2k (Oroboros Instruments) es un sistema cerrado de dos cámaras equipado con un sensor polarográfico de oxígeno (abreviado como respirómetro de alta resolución basado en cámara: cHRR). Cada cámara experimental contiene 2 ml de líquido que se mantiene homogéneo por agitadores magnéticos. El sensor polarográfico de oxígeno utiliza un enfoque amperométrico para medir el oxígeno: contiene un cátodo de oro, un ánodo de cloruro de plata / plata y, entre una solución KCI, crea una celda electroquímica sobre la cual se aplica un voltaje (0.8 V). El oxígeno del medio de ensayo se difunde a través de una membrana de etileno propileno fluorado de 25 μm (O 2-permeable) y sufre una reducción en el cátodo, produciendo peróxido de hidrógeno. En el ánodo, la plata es oxidada por peróxido de hidrógeno, generando una corriente eléctrica. Esta corriente eléctrica (amperio) está linealmente relacionada con la presión parcial de oxígeno. La presión parcial de oxígeno y el factor de solubilidad de oxígeno del medio de ensayo se utilizan para calcular la concentración de oxígeno. Dado que la presión parcial de oxígeno depende de la temperatura experimental y las mediciones polarográficas son sensibles a la temperatura, las fluctuaciones de temperatura necesitan una regulación precisa (±0,002 °C) mediante un bloque de calentamiento Peltier. La temperatura se puede controlar dentro de un rango de 4 ° C y 47 ° C.

El analizador de flujo extracelular Seahorse XF (Agilent) es un sistema basado en placas con formato de microplaca de 24 o 96 pocillos en el que tres electrodos de fluorescencia miden el consumo de oxígeno a lo largo del tiempo en cada pozo (abreviado como respirómetro de alta resolución basado en microplacas: mHRR). Un máximo de cuatro puertos en el cartucho de ensayo están disponibles para la inyección automatizada durante el ensayo. Un ensayo contiene múltiples ciclos, cada uno con tres fases: 1) mezcla, 2) espera y 3) medición. Durante la fase de medición, las sondas del sensor se bajan a la microplaca creando una cámara temporalmente cerrada que contiene un volumen de 7-10 μL para medir la luz emitida. Esta luz es emitida por fluoróforos incrustados en polímeros en la punta de las sondas del sensor, que detectan O2 en función del enfriamiento de fosforescencia. La intensidad de la señal de fluorescencia es proporcional a O2 e influenciada por la temperatura del sensor y el medio de ensayo. Por lo tanto, la estimación precisa del oxígeno requiere un enfoque relativo con un pozo de fondo sin ninguna muestra. La restauración de la concentración de oxígeno ocurre durante la fase de mezcla cuando el sensor se mueve hacia arriba y hacia abajo para mezclar el volumen por encima de la cámara temporal. Cada ciclo calcula una tasa de consumo de oxígeno. La temperatura se puede controlar dentro de un rango de 16 ° C y 42 ° C.

HrR es el estándar de oro para evaluar la bioenergética celular en enfermedades primarias y asociadas a las mitocondrias y el metabolismo celular general. En este estudio, se proporcionan protocolos básicos para la HRR para evaluar la función de OXPHOS en células y tejidos.

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Figura 2: Flujo de trabajo para preparaciones celulares y tisulares para la RCH, y preparación celular para la respirometría de RMH. (A) Esquema de los protocolos proporcionados. (B) Células de mamíferos (paso 1.2): pellet HEK293 igual a 3 x 106 celdas (panel izquierdo). Tejido no fibroso (paso 1.3): Preparación de lisado de cerebelo murino en alfarero de teflón de 2 ml (panel medio). Permeabilización del músculo esquelético inducida por saponina (paso 1.4) panel derecho) para la respirometría de RCH. (C) Diseño estándar de siembra de microplacas (paso 2.4) y verificación de confluencia para el análisis de células eucariotas (HEK293) para la respirometría mHRR. (D, E) Esquema de carga del puerto de inyección para respirometría mHRR (paso 2.4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Toda la experimentación con animales se realiza de acuerdo con la Junta Nacional de Revisión de Experimentos con Animales y la Agencia Administrativa Estatal Regional para el Sur de Finlandia. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6JOlaHsd (4-6 meses de edad). El consentimiento para el uso de líneas celulares humanas se obtuvo del comité de ética institucional de la Universidad de Helsinki.

1. Respirometría de alta resolución: respirómetro basado en cámara (cHRR)

NOTA: Los experimentos en esta sección del protocolo se realizaron utilizando el Oroboros O2k-Core: Oxygraph-2k (Tabla de Materiales)

  1. Calibración de sensores de oxígeno
    1. Los respirómetros pre-run a 37 °C en 2,1 mL de medio de respiración mitocondrial (MiR05, Tabla 1, factor de solubilidad: 0,92) durante >45 min y realizan la calibración de oxígeno como se describe21. Proceda si la variación basal está dentro de ± 4 pmol/s.
      NOTA: Grandes fluctuaciones en la señal de fondo podrían indicar el mantenimiento requerido de la membrana del sensor o rastros de inhibidores que permanecen en la cámara de la experimentación previa. Se recomienda una corrección instrumental del flujo de oxígeno de fondo antes de un lote de experimentos25.
    2. Registre los valores de calibración de oxígeno para monitorear el rendimiento de la membrana del sensor a lo largo del tiempo.
      NOTA: Esto revela la función del sensor, la estabilidad de la señal al ruido y cuándo se requiere el mantenimiento de la membrana del sensor. Dependiendo de la presión ambiental, entre 180-200 μmol de oxígeno se solubiliza en MiR05.
    3. Retire todo el líquido de la cámara antes de agregar cualquier muestra en el medio de respiración.
      NOTA: Evalúe el volumen de las cámaras respiratorias para que sea exactamente de 2 ml regularmente.
  2. Preparación de células para respirometría de alta resolución
    1. Cultive células HEK293 en platos de 10 cmy 2 diámetros en el medio modified Eagle (DMEM) de Dulbecco con alta glucosa suplementado con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10%, GlutaMax, aminoácidos no esenciales y Na-Piruvato22 y uridina23 para apoyar el metabolismo defectuoso de OXPHOS en una incubadora a 37 ° C al 5% de CO2.
      NOTA: Se puede cultivar cualquier tipo de célula eucariota. Para la mayoría de los tipos de células, cultivar un plato de 10 cm2 conduce a suficientes células (generalmente >3 x 106 células). Verifique rutinariamente si hay infección por micoplasma para evitar efectos sobre el metabolismo celular y la respiración.
    2. Cultivar células sin exceder el 90% de confluencia (Figura 2C).
      NOTA: Las células con >90% de confluencia pueden mostrar efectos inhibitorios dependientes del crecimiento sobre la respiración (si no están sincronizados o post-mitóticos).
    3. Lavar las células con 1x PBS, separar con 1 mL de tripsina tibia al 0,25%, desactivar la tripsina añadiendo DMEM caliente (placa de 5 mL/10 cm2 ) y contar las células con un hemocitómetro.
    4. Centrifuga suavemente la solución celular que equivale a 2,5 x 106 células a 300 x g durante 5 min, retira el sobrenadante por completo y vuelve a suspender en 2,5 mL de MiR05 caliente (1 x 106 celdas/mL) (Figura 2A).
    5. Para las celdas de suspensión, cuente y retire la solución que equivale a 2.5 x 106 celdas, ghole y continúe como se menciona en el paso 1.2.4.
    6. Ejecute el protocolo SUIT para la optimización de la permeabilización (paso 1.6), células o tejidos permeabilizados (paso 1.5) o células intactas (paso 1.7)
      NOTA: Para obtener resultados consistentes, se recomienda mantener constante la concentración celular (por ejemplo, 1 x 106 células/ml). Aunque la respiración es independiente de la densidad celular en el respirómetro24, los sustratos e inhibidores están en concentración comparable a lo largo de los experimentos si el número de células se mantiene constante.
  3. Preparación de tejido no fibroso (por ejemplo, cerebro, hígado) para la respirometría de alta resolución
    1. Extirpar un pedazo homogéneo de tejido, 30-40 mg de peso, o usar todo el órgano (cerebelo de ratón en este caso).
      NOTA: Si el tejido no se usa inmediatamente, mantenga en 2 ml de MiR05 helado que permita la preservación hasta 2 h para la mayoría de los tejidos. Los tiempos de almacenamiento de tejido individual deben evaluarse en series temporales.
    2. Seque el tejido con un papel de filtro Whatman (cuidado: la materia de tejido blando tiende a pegarse).
    3. Coloque la pieza de tejido de 30-40 mg en un homogeneizador Elvehjem de alfarero de politetrafluoroetileno refrigerado por hielo de 2 ml.
    4. Agregue una cantidad adecuada de MiR05 para obtener 20 mg / ml para mantener la relación tejido-tampón. Mantenga la cantidad total >1.5 ml y <2 ml para evitar un líquido insuficiente o excesivo para una permeabilización mecánica adecuada.
    5. Inserte el mortero, lise el tejido lentamente retrayendo el mortero con cuidado mientras evita la generación de un vacío que cause un daño tisular excesivo.
    6. Realizar 7 golpes en total (1x definido como un trazo hacia arriba y hacia abajo) hasta que se lisifique (aparente como un líquido turbio sin grandes residuos) (Figura 2B).
      NOTA: El número de accidentes cerebrovasculares para la lisis adecuada debe analizarse para cada tejido mediante la evaluación de la integridad de la membrana mitocondrial externa a través de la respuesta del citocromo C (paso 1.5.11). Es posible que queden partes del tejido conectivo o de los vasos difíciles de lisar.
    7. Decantar el tejido lisado en un tubo centrífugo de 15 ml.
    8. Lave el interior del alfarero con una cantidad igual de MiR05 utilizado en la etapa de lisado (por ejemplo, 1.5 ml) y agregue al tubo de 15 ml que ahora contiene 3-4 ml de MiR05 a 10 mg / ml de lisado tisular.
    9. Añadir 2 ml de MiR05 simple por cámara para calentar a 37 °C.
    10. Gire el tubo para una distribución equitativa antes de pipetear 500 μL (lo que equivale a 5 mg) de cada lisado por cámara lentamente para minimizar el estrés del frío a 37 ° C.
    11. Espere >3 min para que el contenido de la cámara se caliente a 37 °C antes de cerrar la cámara. Retire el exceso de líquido en la parte superior del tapón (cantidad por cámara después del cierre: 4 mg).
    12. Ejecute el protocolo SUIT para permeabilizado estándar (paso 1.5).
  4. Preparación de tejido fibroso (músculo esquelético, músculo cardíaco) para respirometría de alta resolución
    1. Extraiga el tejido duro, elimine el tejido conectivo y la grasa de los músculos utilizando fórceps afilados en 2 ml de BIOPS helado (Tabla 2) bajo un microscopio de disección.
    2. Separe los haces de fibra (~ 4 mg) a lo largo del eje longitudinal con pinzas afiladas. Desentrañar las fibras lo suficiente como para obtener una estructura similar a una malla (Figura 2B).
      NOTA: La separación y permeabilización adecuada de la fibra mecánica está indicada por la pérdida del pigmento rojo mioglobina y el aumento de la translucidez.
    3. Lavar y permeabilizar el haz de fibra en saponina (50 μg/ml en BIOPS, preparado fresco) durante 20 min a 4 °C (las fibras se vuelven translúcidas, lo que indica una permeabilización completa, Figura 2B).
    4. Lave las fibras dos veces en MiR05 durante 5 min por lavado a 4 °C.
    5. Seque con papel de filtro y pese antes de agregar a la cámara llena de 2.1 mL MiR05.
    6. Introduzca tapones sin cerrar completamente, luego oxigene las cámaras con 2 ml de O2 puro utilizando una jeringa de 20 ml y cierre las cámaras girando los tapones en un movimiento giratorio. Mantenga la concentración de O2 entre 300-500 μM durante el experimento para evitar la limitación de difusión de oxígeno.
  5. Protocolo para evaluar la respiración de rutina en células o tejidos
    1. Agregue la muestra a la cámara como se menciona en los pasos 1.5.2-1.5.3.
    2. Añadir 2,3 ml de suspensión de células MiR05 calientes (entrada estándar: 1 x 106 células/ml como en el paso 1,2 o 2 mg de tejido/ml como en el paso 1.3)
    3. Músculo esquelético y cardíaco (paso 1.4): Agregue ~ 4 mg de fibras permeabilizadas con saponina a 2.3 ml precalentados de MiR05 caliente considerando los pasos 1.4.4-1.4.6
    4. Cámaras de funcionamiento a 37 °C y una velocidad de agitación de 700 rpm. Espere >3 min para permitir que los medios se desgasifiquen y cierren las cámaras girando el tapón en un movimiento giratorio. La estabilización del bloque Peltier indica alcanzar la temperatura establecida.
    5. (OPCIONAL) Cambie la velocidad del agitador a 300 rpm para permitir que las burbujas restantes escapen a través del capilar del tapón.
    6. Aspire cualquier exceso de líquido en la parte superior del tapón. Espere 10 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable con cualquier tipo de muestra para registrar la respiración de rutina / estado 1, Figura 1B).
    7. Para las mediciones de la respiración en células y tejidos permeabilizados, continúe con el paso 1.6. Para celdas intactas con el paso 1.8.
  6. Protocolo para el análisis OXPHOS en células o tejidos permeabilizados
    1. Utilice una muestra de tejido lisado (permeabilizado) o permeabilice células agregando 1 μL de digitonina (8,1 mM de digitonina en dimetilsulfóxido (DMSO)) para una concentración final de 5 μg/mL para permeabilizar las células. El flujo disminuirá y debe estabilizarse a >5 min.
      PRECAUCIÓN: La digitonina es agudamente tóxica para el tracto respiratorio, en contacto con la piel o cuando se ingiere.
      NOTA: La inyección de todos los productos químicos se realiza con jeringas de vidrio de precisión. Use jeringas solo para los productos químicos indicados para evitar la contaminación cruzada y lávese bien en agua y EtOH después de su uso. Las jeringas bloqueadas pueden requerir ultrasonidos en ddH2O caliente o un cable de limpieza para desalojar cualquier obstrucción química. Siempre retraiga un excedente de la solución madre respectiva en la jeringa para evitar la introducción de aire en las cámaras. Inspeccione el interior de las cámaras para detectar la introducción de aire después de cada inyección. Registre cada paso hasta que el flujo se estabilice.
    2. Añadir en rápida sucesión: 5 μL de 0,4 M de malato (M) para una concentración final de 1 mM, 5 μL de piruvato de 2,0 M (P; preparado fresco), para una concentración final de 5 mM, 4 μL de 2,5 M de glutamato (G) para una concentración final de 5 mM.
    3. Después de que el flujo anterior se estabilizó, agregue 5 μL (10 μL para el tejido muscular) de 0,5 M de difosfato de adenosina (ADP, alícuotas almacenadas a -80 °C) para una concentración final de 1,25 mM.
      NOTA: El tejido como el músculo puede necesitar una concentración diferente para alcanzar la saturación.
    4. Añadir 5 μL de 4 mM de citocromo C (cytC) para una concentración final de 10 μM.
      NOTA: Opcional para que las células evalúen la calidad de la permeabilización.
    5. Añadir 16 μL de succinato (S) de 1,25 M para una concentración final de 10 mM. (OPCIONAL) Añadir 3 μL de 0,5 M de ADP para una concentración final de 2 mM para controlar la saturación de la concentración de ADP.
    6. Para las células y el tejido no fibroso, añadir 2 μL de 1 mg/ml de oligomicina (OM) para una concentración final de 1 μg/ml.
      PRECAUCIÓN: Todos los inhibidores del ETS utilizados son altamente tóxicos.
      NOTA: La oligomicina puede requerir titulación para una concentración óptima, ya que puede reprimir la capacidad de ETS y se omite para el tejido muscular. Reoxigenar aquí cuando se ensaya el tejido muscular y si O2 está por debajo de 300 μM.
    7. Valore FCCP a partir de un stock de 2 mM, agregue 0.6 μL con pasos posteriores de 0.2 μL hasta que no se desacople al máximo ningún aumento en la respiración y la respiración (teórico: no acoplado).
    8. Añadir 1 μL de 1 mM de rotenona (ROT) para una concentración final de 0,5 μM. Añadir 2 μL de 1 mg/ml de antimicina (AM) para una concentración final de 1 μg/ml.
    9. Reoxigene las cámaras para lograr un nivel de oxígeno similar (~ 150 μM) en todas las cámaras levantando lentamente el émbolo en movimiento de torsión.
    10. Añadir 5 μL de ascorbato de 0,8 M para una concentración final de 2 mM seguida inmediatamente de 5 μL de 0,2 M N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD) para una concentración final de 0,5 mM para evaluar la actividad del complejo IV (opcional).
    11. Añadir 5 μL de azida de 4 M para una concentración final de 10 mM inmediatamente cuando se alcance el flujo máximo de O2 con TMPD. Continúe la ejecución durante >5 minutos para evaluar la autooxidación de TMPD para el cálculo del nivel de base IV complejo.
    12. Vuelva a contar las celdas para confirmar la preejecución del recuento de celdas y continúe con el paso 1.9.
      NOTA: La permeabilización de digitoninas (solo para células) debe titularse en experimentos de ensayo para alcanzar el flujo máximo y no afectar la integridad de la membrana mitocondrial (ver paso 1.7). Las muestras permeabilizadas (especialmente el tejido muscular) con un aumento del >10% en la frecuencia respiratoria después de la adición del citocromo c deben excluirse de un análisis adicional debido al daño de la membrana mitocondrial externa. Se espera una caída de flujo de corto tiempo después de la adición de productos químicos disueltos en EtOH.
  7. Protocolo para determinar las condiciones óptimas de permeabilización de las células
    1. Agregue celdas como se describe en los pasos 1.2 y 1.5.2.
    2. Tomar 10 μL de 10 mg/ml de digitonina y añadir 10 μL de DMSO para diluir a 5 mg/ml.
    3. Añadir 1 μL de rotenona (1 mM de caldo). Añadir 10 μL de succinato (stock de 2 mM) y 5 μL de ADP (stock de 0,5 M).
    4. Valore 1 μL de digitonina (2,5 mg por paso) repetidamente hasta que la respiración no aumente más y sea máxima.
      NOTA: Una disminución en la respiración indica una concentración excesiva de digitonina.
  8. Protocolo para el análisis OXPHOS en células intactas
    1. Después de la respiración de rutina (paso 1.6.1-1.6.6), agregue 2 μL de oligomicina de 0.01 mM para una concentración final de 10 nM.
    2. Valore FCCP a partir de 2 mM de stock, agregue 0.6 μL con pasos posteriores de 0.2 μL hasta que no se desacople al máximo ningún aumento adicional en la respiración y la respiración (teórico: no acoplado)
    3. Añadir 1 μL de 1 mM de rotenona para una concentración final de 0,5 μM. Añadir 2 μL de 1 mg/ml de antimicina para una concentración final de 1 μg/ml.
    4. Reoxigene la cámara al mismo nivel de oxígeno (~ 150 μM) levantando lentamente el émbolo en movimiento de torsión.
    5. Añadir 5 μL de ascorbato de 0,8 M para una concentración final de 2 mM. Agregue inmediatamente 5 μL de 0,2 M TMPD para una concentración final de 0,5 mM para evaluar la actividad IV compleja.
      NOTA: Prepare un lote nuevo antes de cualquier conjunto más grande de experimentos, ya que TMPD es propenso a la autooxidación. La actividad puede disminuir con el tiempo cuando se almacena a -20 °C.
    6. Añadir 5 μL de azida de 4 M para una concentración final de 10 mM inmediatamente cuando se alcance el flujo máximo de O2 con TMPD. Continúe la ejecución durante >5 minutos para evaluar la autooxidación de TMPD para el cálculo del nivel de base IV complejo.
    7. Vuelva a contar las celdas para confirmar la ejecución previa del recuento de celdas y continúe con el paso 1.9.
  9. Recopilación de muestras posterior a la ejecución
    1. Recolecte exactamente 1 ml de suspensión MiR05 de cada cámara (con agitadores encendidos) en un tubo de 1,5 ml y 1,5 ml.
    2. Centrifugar a 1000 x g para células permeabilizadas o a 20.000 x g para lisado tisular. Retire el sobrenadante y congele el pellet a -80 °C para su posterior procesamiento (sección 3).
  10. Análisis de protocolos SUIT
    1. Analizar el flujo de oxígeno (pmol/s, normalizado a la entrada) en cada meseta después de agregar un sustrato o inhibidor (Figura 1C y Figura 3A). Exporte los valores a una hoja de cálculo.
    2. Reste el valor del consumo de oxígeno residual (ROX, Figura 1C y Figura 3C) de todos los valores de cada ejecución experimental. Reste la respiración residual de azida de TMPD para obtener una respiración IV compleja.
    3. Trazar los valores absolutos normalizados para la entrada de células (Figura 3A, B) o tejidos (Figura 5A, B). Calcule las relaciones de control de flujo (paso 1.11) o normalícelas a la entrada de proteínas (Figura 3C).
  11. Cálculo de la relación de control de flujo
    1. Adquirir un índice de control de la función respiratoria y del acoplamiento mediante ratios de control de flujo (FCR)9,26.
      NOTA: Esto permite evaluar la calidad mitocondrial intrínseca, independientemente de la cantidad mitocondrial. Además, las relaciones de control de flujo (FCR) son comparables dentro de las mismas líneas celulares, lo que permite el control de calidad de los reactivos (los FCR respectivos se obtienen a través de los valores de referencia numerados indicados en la Figura 1B-D y la Figura 3C).
    2. Calcule la relación de control respiratorio para el acoplamiento de OXPHOS a LEAK utilizando la Ecuación 1.
      Ecuación 1: FCRADP = 5/6 = Estado 3 / Estado 4
    3. Calcular el FCR para evaluar la respiración dependiente de NADH usando la Ecuación 2
      Ecuación 2: Estado FCR3 (I) = 3/5 = Estado 3 (I) / Estado 3 (I+II)
    4. Calcule el FCR para evaluar la respiración dependiente de succinato utilizando la Ecuación 3.
      Ecuación 3: Estado FCR3 (II) = 8/7 = Spodredumbre /capacidad ETS
    5. Calcule el FCR para evaluar acoplado a desacoplado usando la Ecuación 4.
      Ecuación 4: FCRacoplado/desacoplado = 5/7 = Estado 3 (I+II) /Capacidad ETS
    6. Para probar la integridad de la membrana externa mitocondrial, use la Ecuación 5.
      Ecuación 5: % de daño de la membrana externa mitocondrial = 3/4 = Estado 3 (I) / Estado 3 (I) con cyt c

2. Respirometría de alta resolución: respirómetro basado en microplacas (mHRR)

NOTA: Los experimentos en esta sección del protocolo se realizaron utilizando el analizador de flujo extracelular Seahorse XFe96 (Tabla de materiales)

  1. Cultivo celular
    1. Cultiva cualquier tipo de célula. Los adherentes (por ejemplo, colágeno, laminina) se pueden usar para facilitar la unión celular. Aquí, las células HEK293 se cultivan como antes (paso 1.3).
    2. El día antes del experimento, separe las células y transfiéralas a una microplaca mHRR de 96 pocillos designada para obtener la confluencia ideal el día del experimento (80%-100%) (Figura 2C).
      NOTA: Para la RMHm, las densidades celulares de microplacas son críticas. Las propiedades de crecimiento individuales de las líneas celulares o los tratamientos que afectan el crecimiento deben tenerse en cuenta para garantizar una confluencia comparable el día del experimento.
  2. Preparación de células para respirometría de alta resolución
    1. Cosechar y resuspendir las células lo suficiente antes de la siembra
      NOTA: Se recomienda sembrar células de la misma dilución para réplicas.
    2. Sembrar las células de acuerdo con las tasas de crecimiento de las líneas celulares individuales o las propiedades de crecimiento bajo tratamiento.
      NOTA: Optimice en una microplaca estándar de 96 pocillos y extrapole la densidad celular a una microplaca específica de ensayo de 96 pocillos. En esta configuración, se sembraron 7 x 104 células HEK293 WT por pozo de un pocillo de 96. La primera y la última columna de la placa de 96 pocillos se utilizan para la determinación de proteínas (Figura 2C). Los cuatro pozos de esquina no deben contener ninguna celda y se utilizan para la corrección experimental de fondo. Idealmente, los pozos cerca de los bordes están vacíos para minimizar el efecto del borde (por ejemplo, las células muestran tasas de crecimiento alteradas causadas por los efectos de la temperatura) (Figura 2C, D).
  3. Preparación de placas de sensores, carga de inhibidores
    1. El día del ensayo, complemente 38.8 mL de medio con 0.4 mL de 1 M de glucosa, 0.4 mL de 200 mM de glutamina y 0.4 mL de Na-piruvato de 100 mM.
      NOTA: La respiración mHRR requiere un medio DMEM especializado no tamponado a pH 7.4. En general, 40 ml deberían ser suficientes para un experimento con una microplaca de 96 pocillos.
    2. Caliente el medio de ensayo de respiración a 37 °C e intercambie el medio de cultivo celular por el medio de ensayo de respiración lavando dos veces con 80 μL por pozo.
    3. Coloque la placa con las células en una incubadora de 37 °C sin CO2 durante 60 minutos antes del ensayo.
      NOTA: Este paso es esencial para desgasificar la placa, ya que el CO2 puede afectar los resultados de la respiración, y el suero en el medio puede producir burbujas durante el ensayo.
    4. Alícuotas inhibidoras precalentadas para OM, FCCP, ROT y AM a 37 °C y saca la placa del sensor de la incubadora.
    5. Diluya OM, FCCP, ROT y AM en 3 ml de medio de ensayo hasta una concentración final de pozo de 1,5 μM, 1,125 μM y 1 μM, respectivamente. Rellene en puertos separados como se indica en la Figura 2E.
      NOTA: Se recomienda una pipeta multicanal para llenar el cartucho del sensor. Dado que el aire a presión se utiliza para inyectar compuestos, todos los puertos deben llenarse con una cantidad igual de volumen de líquido cada vez que un puerto se llena con un compuesto. ROT y AM se pueden combinar en un solo puerto. Los inhibidores se pueden disolver en EtOH o DMSO.
    6. Inspeccione los puertos de inyección y verifique un volumen de carga uniforme para cada puerto.
      NOTA: Todos los puertos contienen un orificio en la parte inferior para la inyección. Se debe tener cuidado al mover la placa del sensor. Las burbujas de aire se pueden eliminar con una aguja.
  4. Protocolo para la evaluación del oxígeno en células intactas
    1. El día antes del ensayo, realice los pasos 2.4.2-2.4.7.
    2. Alícuota 20 ml de la solución calibrante en un tubo cónico de 50 ml.
    3. Abra el kit de ensayo de flujo extracelular y retire el contenido.
    4. Coloque el cartucho del sensor invertido junto a la placa de utilidad. Pipetear 200 μL de solución calibrante en cada pocillo de la placa de utilidad.
    5. Coloque el cartucho del sensor en la placa de utilidad prestando atención a que todos los sensores estén sumergidos.
    6. Coloque la placa en una incubadora de 37 °C sin CO2 durante la noche o un mínimo de 12 h. Verifique que la humedad dentro de la incubadora sea suficiente para evitar la evaporación del calibrante.
    7. Encienda el sistema basado en microplacas y la computadora para estar listo para usar al día siguiente (la máquina requiere un mínimo de 3 h para equilibrarse a 37 ° C antes de realizar un ensayo).
      NOTA: Para la estabilidad de la señal, aumente los puntos de medición a 6 en lugar de 3 ciclos de medición por estado respiratorio. Cada ciclo consta de 3 min de mezcla y 3 min de medición.
    8. El día del ensayo XF, realice los pasos 2.4.9-2.4.20.
    9. Verificar la confluencia de la placa de cultivo celular, la morfología de las células y que los pozos de fondo estén vacíos.
    10. Lave las células con el medio de respiración preparado como se menciona en los pasos 2.4.11-2.4.12.
    11. Retire todos menos 20 μL del medio de cultivo de cada pozo. Retirar 55 μL si el medio de cultivo fue de 80 μL debido a la evaporación durante la noche (aproximadamente 5 μL).
    12. Lavar las células dos veces con 90 μL de medio de ensayo. Finalmente, agregue 100 μL de medio de ensayo. El volumen final debe ser de 120 μL.
      NOTA: Se recomienda una pipeta multicanal para este paso para garantizar que se haya aplicado el mismo procedimiento de lavado a cada condición experimental (depende de la configuración de la placa). Al aspirar, incline la placa a un ángulo de 45° y coloque las puntas de la pipeta en la esquina de los pozos para la aspiración e inyección de líquidos. Es imperativo tener cuidado durante el lavado, ya que ciertas células pueden desprenderse fácilmente del fondo de la placa de cultivo celular.
    13. Coloque la placa en una incubadora de 37 °C sin CO2 durante 60 minutos antes del ensayo.
    14. Recupere la placa del cartucho del sensor hidratado de la incubadora libre de CO2.
    15. Deseche la solución de calibrante vieja y reemplácela por una solución de calibrante nueva, precalentada a 37 °C.
    16. Preparar inhibidores y medio de ensayo (3 ml por inhibidor para un total de 12 ml de medio de ensayo) y utilizar un depósito de pipeta para la carga del inhibidor en los puertos.
    17. Abra el software y ejecute una plantilla prediseñada o nueva. Llene el mapa de la placa, ajuste las valoraciones y los ciclos de medición y, a continuación, pulse Iniciar para iniciar la calibración de los sensores ópticos.
    18. Retire la tapa del cartucho cargado y colóquela en la ranura que se desliza automáticamente fuera de la máquina, verificando que las marcas en la esquina inferior derecha de la placa se alineen con el triángulo en la esquina inferior derecha de la ranura.
    19. Haga clic en Continuar para realizar la calibración automática, con una duración aproximada de 20 minutos.
    20. Después de la calibración, retire la placa de utilidad que contiene el calibrante.
    21. Retire la tapa de la microplaca que contiene las celdas y coloque la placa en la ranura cuando la máquina se lo solicite. Haga clic en Continuar para iniciar la ejecución.
  5. Recopilación de muestras posterior a la ejecución
    1. Saque la placa de la máquina, retire cuidadosamente los medios de ensayo restantes sin perturbar las células y congele toda la placa a -80 °C para su posterior procesamiento (sección 3).

3. Determinación de proteínas mediante el ensayo de ácido bicinconónico (ensayo BCA)

  1. Preparar albúmina sérica bovina diluida (BSA) en tampón utilizado para la extracción de proteínas y compatible con BCA: 2 mg/mL, 1,5 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL y 0 mg/mL para la curva estándar en duplicados.
  2. Extraer proteínas mediante resusped en un tampón de lisis apropiado (por ejemplo, RIPA) con 20 μL por pocillo para mHRR o 100 μL por pellet contenido dentro de un tubo de 1,5 mL para cHRR.
  3. Incubar la placa mHRR o el tubo de 1,5 ml que contiene lisados de proteínas durante 30 minutos en hielo.
  4. Centrifugar el tubo de 1,5 ml que contiene el lisado de proteína a 4 °C a 20.000 x g durante 20 min y transferir el sobrenadante resultante a un nuevo tubo limpio de 1,5 ml.
  5. Utilice 10 μL por muestra en duplicados y estándares en una placa de microtitulación. Añadir 200 μL de reactivo de trabajo BCA e incubar durante >15 min.
  6. Lea la placa en un espectrofotómetro estándar a una longitud de onda de 562 nm y calcule las concentraciones de proteínas utilizando una curva estándar BSA.
  7. Normalizar los resultados de la respiración a la concentración de proteínas.
    NOTA: La normalización a la cantidad de proteína permite corroborar las densidades de siembra celular o la entrada de peso húmedo. Las proteínas extraídas son adecuadas para la inmunoblotting posterior contra subunidades del ETS, por ejemplo, pero no representan completamente la muestra nativa (por ejemplo, pérdida de sitios de fosforilación).

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Resultados

Aquí, proporcionamos protocolos para determinar la bioenergética mitocondrial en células eucariotas, tejido no fibroso (por ejemplo, cerebelo) y tejido fibroso (por ejemplo, músculo esquelético). Para las células eucariotas, HEK293 con knockout diseñado por CRISPR de dos proteínas diferentes asociadas con la traducción mitocondrial que resultan en deficiencia múltiple (CRISPRKO1) y severa / completa de OXPHOS (CRISPRKO2) se midieron con cHRR (Figura 3A-C

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Discusión

Tradicionalmente, la bioenergética mitocondrial se ha estudiado con electrodos de oxígeno tipo Clark. Sin embargo, la falta de resolución y rendimiento justificaba el avance tecnológico. Hasta la fecha, el O2k (conocido como cHRR) y el seahorse XF96 Flux Analyzer (conocido como mHRR) han sido ampliamente adoptados en el campo de la bioenergética celular. Aquí, presentamos una colección comprensible de protocolos para el análisis del metabolismo energético celular a través de la evaluación de la respiración mitocondrial u...

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Divulgaciones

No hay conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Academia de Finlandia (C.B.J), la Fundación Magnus Ehrnroot (C.B.J)), y una beca de doctorado de la Escuela de Graduados de Ciencias de la Vida Integrada (R.A.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2 mL Potter-Elvehjem Trituradora/Homogeneizadora de Vidrio/PTFEOmni International07-358029
95% O2, 5% CO2 mezcla de gases medicinales Potterpara la molienda de tejidos
ADPSigmaA 4386
Antimicina ASigmaA 8674
AscorbatoMerckPHR1279-1GQuímico, disuelva en etanol
BSA (libre de ácidos grasos)SigmaA 6003Químico
CaCO3SigmaC 4830Químico
Citocromo CSigmaC 7752Químico
DigitoninaSigmaD 5628Químico
DitiotreitolSigmaD 0632Químico, disolver en DMSO
D-sacarosaRoth4621.1
Dulbecco químico Águila modificada' s medio (glucosa alta)Fisher Scientific41965-039
Dulbecco' químico Águila modificada' s medio  (sin glucosa)Fisher ScientificA14430-01
EGTASigmaE 4378
EtomoxirSigmaE1905Chemical
Falcon 15 ml Tubos de centrífuga cónicosFisher ScientificAM12500
Chemical Falcon 50 ml Tubos de centrífuga cónicosFisher ScientificAM12501
FCCPSigmaC 2920
GlucosaSigmaG7021Químico, disolver en etanol
GlutamatoSigmaG 1626
GlutaMax ( 100x)  (200 nM  L-alanil-L-glutamina dipéptido)Fisher Scientific35050061
Químico Células HEK293ATTCCRL-1573
HemocitómetroFisher Scientific0267151BInstrumento para el recuento de células
HepesSigmaH 7523Químico
ImidazolFluka56750Químico
KClMerck1.04936
L-carnitinaSigmaC0283Malato químico
SigmaM 1000Hidrato químico
MESSigmaM8250MgCl químico
2SigmaM 9272Químico
Na2ATPSigmaA 2383Na
2FosfocreatinaSigmaP 7936
Na-piruvato químico ( 100 mM)  (100 veces)Fisher Scientific11360070
NEAA ( Aminoácidos no esenciales) 100xFisher Scientific11140035
FBS normal ( 10x)Fisher Scientific10500064
O2k-Core: Oxygraph-2kOroboros Instruments10000-02 Instrumento derespirometría de alta resolución
O2k-Set de valoraciónOroboros Instruments20820-03Jeringas Hamilton para inyecciones químicas
OligomicinaSigmaO 4876Químico, disuelto en etanol
palmitoilcarnitinaSigmaP 4509Químico
Penicilina-EstreptomicinaFisher Scientific15140122
Pierce Kit de ensayo de proteínas BCAFisher Scientific23227
PiruvatoSigmaP 2256Químico
Tampón RIPAFisher Scientific89900
RotenonaSigmaR 8875Químico, disuelto en
etanol SaponinaSigmaS7900Químico

Paquete mediano de ensayo Seahorse XF DMEM, pH 7.4
Agilent, Santa Clara, CA		103680-100
Seahorse XFe96 Analizador de flujo extracelular
Agilent, Santa Clara, CA		Instrumento de respirometría de alto rendimiento
Seahorse XFe96 FluxPak
Agilent, Santa Clara, CA		br/> Incluye placas de ensayo, cartuchos, guías de carga para transferir compuestos al cartucho de ensayo y solución de calibrante.
Tijeras pequeñasFisher Scientific08-951-20
Azida de sodioSigmaS2002
SuccinatoSigmaS 2378Químico
TaurinaSigmaT 8691Químico
TMPDSigmaT 3134Químico
Solución de azul de tripánMerck72-57-1Químico
Tripsina 0.25% EDTAFisher Scientific25200056
Dos pinzas de borde finoFisher Scientific12-000-122
Caldo de uridina (500x)SigmaU3750Chemical
químico química Química< químico

Referencias

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