Detección indel tras mutagénesis CRISPR/Cas9 mediante análisis de fusión de alta resolución en el mosquito Aedes aegypti

Resumen

Este artículo detalla un protocolo para la identificación rápida de indels inducidos por CRISPR/Cas9 y la selección de líneas mutantes en el mosquito Aedes aegypti utilizando análisis de fusión de alta resolución.

Resumen

La edición de genes de mosquitos se ha convertido en rutina en varios laboratorios con el establecimiento de sistemas como nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN), nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y endonucleasas de homing (HE). Más recientemente, la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) ha ofrecido una alternativa más fácil y barata para la ingeniería genómica de precisión. Después de la acción de la nucleasa, las vías de reparación del ADN arreglarán los extremos rotos del ADN, a menudo introduciendo indels. Estas mutaciones fuera de marco se utilizan para comprender la función génica en los organismos objetivo. Un inconveniente, sin embargo, es que los individuos mutantes no llevan un marcador dominante, lo que hace que la identificación y el seguimiento de los alelos mutantes sean un desafío, especialmente a escalas necesarias para muchos experimentos.

El análisis de fusión de alta resolución (HRMA) es un método simple para identificar variaciones en las secuencias de ácidos nucleicos y utiliza curvas de fusión por PCR para detectar tales variaciones. Este método de análisis post-PCR utiliza colorantes fluorescentes de doble cadena de unión al ADN con instrumentación que tiene capacidad de captura de datos de control de rampa de temperatura y se escala fácilmente a formatos de placa de 96 pocillos. Aquí se describe un flujo de trabajo simple utilizando HRMA para la detección rápida de indels inducidos por CRISPR / Cas9 y el establecimiento de líneas mutantes en el mosquito Ae. aegypti. Críticamente, todos los pasos se pueden realizar con una pequeña cantidad de tejido de la pierna y no requieren sacrificar el organismo, lo que permite que se realicen cruces genéticos o ensayos de fenotipado después del genotipado.

Introducción

Como vectores de patógenos como los virus del ^dengue1, ^Zika2 y chikungunya3, así como de parásitos de la ^malaria4, los mosquitos representan una amenaza significativa para la salud pública de los seres humanos. Para todas estas enfermedades, hay un enfoque sustancial de la intervención de transmisión en el control de los mosquitos vectores. El estudio de los genes importantes en, por ejemplo, la permisividad a los patógenos, la aptitud de los mosquitos, la supervivencia, la reproducción y la resistencia a los insecticidas es clave para desarrollar nuevas estrategias de cont....

Protocolo

1. Escaneo de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), diseño de imprimación HRMA y validación de imprimación

1. Identificación de SNP en mosquitos colonias de laboratorio de tipo silvestre
   1. Seleccione el exón objetivo para interrumpir la traducción adecuada del polipéptido.
      NOTA: El objetivo debe estar cerca del codón de inicio o entre los residuos clave necesarios para la función de la proteína. Cuanto más corto sea el exón (por ejemplo, ≤200 bases), más difícil será apuntar y analizar. Evite editar cerca de los límites de un exón, ya que esto obliga a uno de los cebadores HRMA a cruzar un intrón o estar en un intrón. Esto es indeseable porque las ....

Resultados

Los mosquitos que contenían mutaciones en los genes AaeZIP11 (supuesto transportador de ^hierro21) y myo-fem (un gen de miosina con sesgo femenino relacionado con los músculos de ^vuelo13) se obtuvieron utilizando la tecnología CRISPR/Cas9, genotipados con HRMA y verificados por secuencia (Figura 5). La Figura 5A y la Figura 5C muestran la intensidad de fluorescencia no.......

Discusión

El análisis de fusión de alta resolución ofrece una solución simple y rápida para la identificación de indels generados por la tecnología CRISPR/Cas9 en el mosquito vector Ae. aegypti. Proporciona flexibilidad, permitiendo el genotipado de mosquitos mutados para una amplia gama de genes, desde el músculo de vuelo hasta el metabolismo del hierro y ^más13,14. La HRMA se puede realizar en solo unas pocas horas desde la recolección de la muestra hasta los aná.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Etanol			al 70% Solución de etanol al 70% en agua
Placas de PCR de 96 pocillos y PCR en tiempo real	VWR	82006-636	Para la obtención de ADN genómico (de la pata del mosquito)
Plantillas			Impreso en casa, para el registro de genotipos
Bio Rad CFX96	Máquina de PCR Bio Rad		con gradiente y capacidades
HRMADepósitos de reactivos biotecnológicos diversificados	VWR	490006-896
Exo-CIP Kit de limpieza rápida de PCR	New England Biolabs	E1050S
Placa de Petri de vidrio	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Placas de PCR rígidas de pared delgada de 96 pocillos	Bio-rad	HSP9665	para HRMA
Pipeta multicanal (P10)	Integra Biosciences	4721
Pipeta multicanal (P300)	Integra Biosciences	4723
Nunc Cinta de sellado de acrilato de poliolefina, Thermo Scientific	VWR	37000-548	Para usar con el 96-pocillos  Placas de PCR para la obtención de ADN genómico
Cinta de sellado óptico	Bio-rad	2239444	Para usar con las placas de PCR con faldón de 96 pocillos para HRMA
Kit de PCR directo de tejido animal Phire (sin herramientas de muestreo)	Thermo Fisher	F140WH	Para la obtención de ADN genómico y la realización de PCR
Divisores de viales de moscas de plástico	Genesee	59-128W
Software de análisis de fusión de precisión	Bio Rad	1845025	Se utiliza para el genotipado de las muestras de ADN de mosquitos y el análisis de las propiedades de desnaturalización térmica del ADN bicatenario (consulte el paso 3.3 del protocolo)
	SeqMan Pro	DNAstar Lasergene	Para la alineación de secuencias múltiples
Pipeta monocanal	Pinzas Gilson
Dumont #5 11 cm	WPI	14098
Tapones de espuma blanca	VWR	60882-189
Viales anchos de Drosophila, poliestireno	Genesee	32-117
Bandeja ancha para viales para moscas, azul	Genesee	59-164B