Este protocolo describe un ensayo de reportero de minigenes para monitorear el impacto de las mutaciones del sitio de empalme 5'en el empalme y desarrolla snRNA supresor U1 para el rescate de la inhibición del empalme inducida por la mutación. Las construcciones de snRNA U1 reportero y supresor se expresan en células HeLa, y el empalme se analiza por extensión de cebador o RT-PCR.
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Artículo de método
Un ensayo celular basado en reporteros para monitorear la eficiencia del empalme
En este artículo
Resumen
Resumen
Durante la expresión génica, el paso vital del empalme pre-ARNm implica el reconocimiento preciso de los sitios de empalme y el ensamblaje eficiente de los complejos espliceosómicos para unir exones y eliminar los intrones antes de la exportación citoplasmática del ARNm maduro. La eficiencia del empalme puede verse alterada por la presencia de mutaciones en los sitios de empalme, la influencia de los factores de empalme de acción trans o la actividad de la terapéutica. Aquí, describimos el protocolo para un ensayo celular que se puede aplicar para monitorear la eficiencia de empalme de cualquier exón dado. El ensayo utiliza un plásmido adaptable codificado 3-exon/2-intron minigene reporter, que puede expresarse en células de mamíferos por transfección transitoria. Después de la transfección, se aísla el ARN celular total, y la eficiencia del empalme de exones en el ARNm reportero se determina mediante la extensión del cebador o la reacción en cadena semicuantitativa de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Describimos cómo se puede determinar el impacto de las mutaciones del sitio de empalme 5′ asociadas a la enfermedad introduciéndolas en el reportero; y cómo la supresión de estas mutaciones se puede lograr mediante la coinfección con el ARN nuclear pequeño (snRNA) U1 que lleva mutaciones compensatorias en su región de 5′ que se fusiona con los sitios de empalme 5′ en las uniones exón-intrón en pre-ARNm. Por lo tanto, el reportero se puede utilizar para el diseño de partículas terapéuticas de U1 para mejorar el reconocimiento de los sitios de empalme mutantes de 5 '. La inserción de sitios reguladores de acción cis, como secuencias de potenciador de empalme o silenciador, en el informador también se puede utilizar para examinar el papel de U1 snRNP en la regulación mediada por un factor de empalme alternativo específico. Finalmente, las células que expresan al reportero se pueden incubar con moléculas pequeñas para determinar el efecto de la terapéutica potencial en el empalme constitutivo de pre-ARNm o en exones que transportan sitios de empalme mutantes de 5 '. En general, el ensayo de reportero se puede aplicar para monitorear la eficiencia del empalme en una variedad de condiciones para estudiar los mecanismos fundamentales de empalme y las enfermedades asociadas al empalme.
Introducción
El empalme pre-ARNm es un paso de procesamiento esencial que elimina los intrones no codificantes y liga con precisión los exones codificantes para formar ARNm maduro. El reconocimiento de secuencias de consenso en las uniones exón-intrón, denominadas sitio de empalme de 5′ y sitio de empalme de 3′, por componentes de la maquinaria de empalme inicia el proceso de empalme. La ribonucleoproteína nuclear pequeña U1 (snRNP) reconoce el sitio de empalme 5′ por emparejamiento de bases del snRNA U1 con el pre-ARNm1. Las mutaciones heredadas genéticamente que alteran las secuencias del sitio de empalme....
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Protocolo
1. Reactivos y tampones
NOTA: Toda la esterilización con filtros de vacío debe realizarse con una membrana de polietersulfona (PES) de 0,2 μm en un gabinete de bioseguridad.
- Prepare agua sin RNasa agregando 1.0 ml de dietilpirocarbonato (DEPC) a 1.0 L de agua desionizada, mezcle durante al menos 1 hora a temperatura ambiente (RT), autoclave dos veces y luego enfríe a RT antes de usar.
- Prepare el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco mezclando un paquete de polvo de DMEM (13.4 g), 3.7 g de bicarbonato de sodio, 100 ml de suero fetal bovino (FBS), penicilina y estreptomicina a ~ 800 ml de agua desionizada estéril. La ....
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Resultados
El reportero de empalme Dup51, un minigén de tres exones-dos intrón, se derivó del gen humano β-globina y ha sido descrito previamente (Figura 1A)11,12 . Creamos un reportero mutante, Dup51p, introduciendo mutaciones en el sitio de empalme 5' asociadas al síndrome de Usher que ocurren en el exón 3 del gen de la protocadherina 15 (PCDH15)13. La secuencia del sitio de empalme 5' en la unión exón 2-intró.......
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Discusión
El ensayo se puede adaptar para el análisis de empalme en líneas celulares distintas de HeLa, sin embargo, es posible que sea necesario optimizar los factores que afectan la eficiencia de la transfección, como la confluencia celular y la cantidad de ADN. La relación de constructo reportero-U1 es otro parámetro crítico que puede necesitar ser determinado dependiendo de los niveles de expresión observados en otros tipos de células. La calidad del ARN extraído es crítica para el análisis de empalme; por lo tanto, el uso de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por fondos a S.S. de los Institutos Nacionales de Salud (R21CA170786 y R01GM127464) y la Sociedad Americana del Cáncer (la Subvención de Investigación Institucional 74-001-34-IRG) y a S.S. y W.M. del Programa de Asociación de Investigación del Valle (P1-4009 y VRP77). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agua desionizada de grado reactivo | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Pirocarbonato de dietilo (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Paquete de polvo Eagle Medium modificado (DMEM) de Dulbecco | Gibco | 12100-046 | |
| Bicarbonato de sodio | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Suero fetal bovino (FBS), Fuente australiana, | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicilina-estreptomicina (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Hidróxido de sodio, solución estándar 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Ácido clorhídrico, certificado ACS Plus, 36.5 a 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Filtros desechables de tapa de botella PES | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| Sal disódica EDTA dihidratada | Amresco | 0105-2,5 kg | |
| 2,5 % de tripsina (10x), sin rojo fenol | ThermoFisher Scientific | 15090046 cloruro | |
| de sodio | Fisher Biorreactivo | BP358-212 | |
| Cloruro de potasio | Biorreactivo Fisher | BP366-1 | |
| Disódico Fosfato de hidrógeno Heptahidratado | Biorreactivo Fisher | BP332-1 | |
| Dihidrogenofosfato de potasio | Biorreactivo Fisher | BP362-1 | |
| Medio de transfección - Opti-MEM™ I Medio de suero reducido, sin rojo fenol | Reactivo | 11058021 | |
| - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reactivo | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| cloroformo (aprox. 0,75 % de etanol como conservante/biología molecular) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Etanol, absoluto (200 pruebas), grado de biología molecular, Fisher BioReagents | ThermoFisher | Scientific BP2818-4 | |
| isopropanol, grado de biología molecular, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glucógeno (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit Zymo | Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Plomo, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polinucleótido quinasa | New England Biolabs | M0201L | |
| Granos de exclusión de tamaño - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Mini columnas de exclusión de tamaño | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Marcador de bajo peso molecular, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Reactivos inactivantes de rnasa - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Inhibidor de la ribonucleasa recombinante | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| transcriptasa inversa - M-MLV Transcriptasa inversa | ThermoFisher Scientific | 28025013 | utilizado para la extensión de cebadores |
| Taq ADN polimerasa | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Hexámeros aleatorios (50 y micro; M) | ThermoFisher Scientific N8080127 | ||
| Mezcla de PCR en tiempo real - SYBR™ Seleccione Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Transcriptasa inversa | ThermoFisher Scientific | 18080093 | utilizado para la preparación de ADNc |
| Ditiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X Tampón de primera cadena | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamida (≥ 99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Revisión Hojas de datos de seguridad del material |
| Azul de bromofenol sal sódica | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xileno Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (cristales blancos o polvo cristalino/biología molecular) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Ácido bórico (cristalino/ Electroforesis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrilamida: Bis-Acrilamida 19:1 (40% Solución/Electroforesis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Revisar Hojas de datos de seguridad del material |
| Urea (cristales incoloros a blancos o polvo cristalino/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Peroxodisulfato de amonio (APS) ≥ 98%, Pro-Pure, Grado Proteómico VWR | M133-25G | ||
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED) ≥ 99%, | Ultrapure VWR | 0761-25ML | Revisión Hojas de datos de seguridad |
| del material Sistemas de gel de losa ajustables, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Juegos de placas de vidrio, 16,5 x 14,5 cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Juegos de placas de vidrio, 16,5 x 22,0 cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Juegos de placas de vidrio, 16,5 x 38,7 cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Cribas de fósforo de almacenamiento | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Generador de imágenes biomoleculares | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Contador de centelleo líquido | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Termociclador | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Sistemas de PCR en tiempo real | ThermoFisher Scientific |
Referencias
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
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Reimpresiones y permisos
