Un método de extracción no degradativo para la caracterización de la estructura molecular de partículas de glucógeno bacteriano

Summary

La estructura del glucógeno bacteriano se ve muy afectada por los métodos de extracción, que pueden dar lugar a la degradación molecular y/o al muestreo sesgado. Es esencial desarrollar métodos para minimizar estos problemas. Aquí, se han comparado cuatro métodos de extracción utilizando la distribución del tamaño y la distribución de la longitud de la cadena como criterios clave para minimizar los artefactos de extracción.

Abstract

En la actualidad, existe una variedad de métodos de extracción de glucógeno, que dañan la estructura espacial del glucógeno o solo extraen parcialmente el glucógeno, lo que lleva a la caracterización sesgada de la estructura molecular fina del glucógeno. Para comprender los cambios dinámicos de las estructuras de glucógeno y las funciones versátiles de las partículas de glucógeno en las bacterias, es esencial aislar el glucógeno con una degradación mínima. En este estudio, se demuestra un método de aislamiento de glucógeno suave mediante el uso de precipitación de agua fría (CW) a través de ultracentrifugación en gradiente de densidad de azúcar (SDGU-CW). También se realizó el método tradicional del ácido tricloroacético (TCA) y el método del hidróxido de potasio (KOH) para la comparación. Una cepa de laboratorio comúnmente utilizada, Escherichia coli BL21(DE3), se utilizó como organismo modelo en este estudio con fines de demostración. Después de extraer las partículas de glucógeno utilizando diferentes métodos, sus estructuras se analizaron y compararon mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para la distribución del tamaño de partícula y electroforesis capilar asistida por fluoróforos (FACE) para distribuciones lineales de longitud de cadena. El análisis confirmó que el glucógeno extraído a través de SDGU-CW tenía una degradación mínima.

Introduction

El glucógeno es un polisacárido muy ramificado que consta de residuos de glucosilo y también de una cantidad pequeña pero significativa de proteínas, en el que todos los residuos de glucosilo están unidos entre sí a través de enlaces α-1,4-glicosídicos en cadenas lineales y enlaces α-1,6-glicosídicos en los puntos de ramificación¹. La estructura de las partículas de glucógeno generalmente se divide en tres jerarquías: 1) oligómeros de cadena corta, 2) partículas de β esféricas (~ 20 nm de diámetro) y 3) partículas grandes de α en forma de roseta agregadas por β partículas, cuyo diámetro varía aproximadamente hasta 300 nm. Recientemente, se ha descubierto que las partículas de α glucógeno tienen dos estados estructurales en los eucariotas, es decir, un estado frágil y un estado estable. Aquí, la fragilidad significa la disociación de partículas de α más grandes en partículas β más pequeñas en presencia de un agente caótico como el DMSO². Análisis posteriores encontraron que las partículas de α de glucógeno en el hígado diabético son consistentemente frágiles³ y las partículas de α frágiles se degradan mucho más rápido que las partículas de α estables⁴. Por lo tanto, la fragilidad estructural del glucógeno puede exacerbar las condiciones hiperglucémicas en la diabetes ^2,4, lo que convierte a la partícula de α frágil en un potencial biomarcador patológico de la diabetes a nivel molecular. Sin embargo, la existencia de partículas de α de glucógeno en procariotas solo se reporta esporádicamente⁵, y no hay reporte de los dos estados estructurales diferentes de las partículas de α de glucógeno en las bacterias.

Para comprender las funciones fisiológicas de las partículas de glucógeno bacteriano, es esencial determinar la estructura fina de las moléculas de glucógeno, lo que requiere un aislamiento de glucógeno con el máximo rendimiento y la mínima degradación¹. Hasta ahora, se han desarrollado varias técnicas para la extracción de glucógeno, que incluyen, entre otras, la extracción con agua caliente, la extracción con ácido tricloroacético (TCA) y la extracción con alcalinos calientes (hidróxido de potasio, KOH)⁶. Además, otro método que se usa comúnmente para el aislamiento de glucógeno eucariota, el método de ultracentrifugación en gradiente de densidad de azúcar (SDGU), también se reportó para el aislamiento de glucógeno bacteriano en Selenomonas ruminantium y Fibrobacter succinogenes ^7,8. A pesar de que los pros y los contras de estos métodos han sido ampliamente discutidos en estudios eucariotas ^9,10, rara vez existen estudios comparativos de estructuras finas de glucógeno aisladas mediante diferentes métodos de extracción en bacterias desde la perspectiva de las estructuras de las partículas de glucógeno.

En este estudio, este problema se ha abordado utilizando Escherichia coli BL21(DE3) como organismo modelo. Se compararon un total de cuatro métodos de extracción de glucógeno, a saber, la extracción con agua caliente precipitada con TCA (TCA-HW), la extracción con agua fría precipitada con TCA (TCA-WW), la extracción con solución caliente de KOH AL 30% (KOH-HW) y la extracción con agua fría mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa (SDGU-CW). La distribución del tamaño de las partículas de glucógeno se midió mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), mientras que la distribución de la longitud de la cadena se detectó mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE), ambos utilizados para evaluar la calidad de los métodos de extracción. Además, también se comparó la estabilidad y fragilidad de las partículas de glucógeno bacteriano α entre los diversos métodos de extracción comparando la distribución del tamaño de las partículas antes y después del tratamiento con el agente caotrópico comúnmente utilizado, el dimetilsulfóxido (DMSO). A continuación se presentan los procedimientos detallados para la extracción de glucógeno y la caracterización estructural. En resumen, el método SDGU-CW tiene el mejor efecto general en términos de integridad estructural del glucógeno y, por lo tanto, se recomienda para la extracción de glucógeno bacteriano en futuros estudios relevantes.

Protocol

1. Cultivo y recolección de bacterias

1. Resucite E. coli BL21(DE3) a partir de un caldo de glicerol bacteriano (-80 °C) inoculando una placa de agar LB estéril (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl y 15 g/L de agar). Coloque la placa en una incubadora estándar y cultive durante la noche a 37 °C.
2. Recoja una sola colonia e inocule en un medio líquido LB estéril de 10 ml (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl). Mezclar bien mediante vórtice y cultivo durante la noche a 37 °C con agitación a 220 rpm.
   NOTA: A menos que se especifique lo contrario, todas las condiciones de cultivo líquido fueron de 37 °C con una tasa de agitación de 220 rpm.
3. Transfiera 1 mL del cultivo de E. coli durante la noche a 100 mL de medio líquido LB estéril y cultive durante 5 h. Transfiera 50 mL a 1 L de 1x medio mínimo M9 (3 g/L KH₂PO₄, 0,5 g/L de NaCl, 6,78 g/L de Na₂HPO₄ y 1 g/L de NH₄Cl) que contenga 0,8% de D-(+)-glucosa. Mezclar bien, y cultivar durante 20 h.
   NOTA: 1x M9 medio mínimo y glucosa se esterilizaron por separado y luego se mezclaron cuando se enfriaron a temperatura ambiente de forma aséptica.
4. Después de cultivar durante 20 h, centrifugar la solución bacteriana a 6.000 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Guarde el pellet de celda a -80 °C durante la noche y luego liofilice el pellet.
5. Selle y almacene el polvo bacteriano liofilizado en un refrigerador (-20 °C) para su uso posterior.

2. Extracción de glucógeno

1. Extracción con agua caliente precipitada con ácido tricloroacético (TCA-HW)
   1. Pesar con precisión 500 mg de polvo liofilizado de E. coli BL21 (DE3) y volver a suspenderlo en 20 ml de tampón de trietanolamina (TEA) 0,05 M helado. Utilice una trituradora de células ultrasónica (25% de energía, 4 °C) para interrumpir las células bacterianas durante 3 minutos (ciclos de trabajo de 30 s e intervalos de 2 s). Asegúrese de que no haya gránulos obvios en la solución.
      NOTA: La disrupción celular se llevó a cabo en el hielo. Ajuste el pH del tampón de TEA a pH 7 mediante la adición de HCl y almacene a temperatura ambiente.
   2. Transfiera todo el homogeneizado bacteriano a dos tubos de ultracentrífuga de 10,4 mL (10 mL/tubo). Llene los tubos con agua desionizada hasta la parte superior y centrifugue a 104.000 x g en una ultracentrífuga a 4 °C durante 90 min. Deseche el sobrenadante.
   3. Añadir 2 mL de agua desionizada para resuspender el pellet en cada tubo. Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 50 mL y agregue agua desionizada hasta un volumen final de 20 mL. Calentar y hervir durante 5 min para desnaturalizar todas las proteínas.
   4. Centrifugar la suspensión durante 10 min a 18.000 x g y retener el sobrenadante (S1). Trate el precipitado de la misma manera que en el paso 2.1.3. Agrupe el nuevo sobrenadante (S2) con S1.
   5. Añadir un 50% de TCA (0,1 volumen) al sobrenadante (S1+S2) y colocar la mezcla en hielo durante 10 min para precipitar macromoléculas como ADN, ARN, proteínas, etc. Centrifugar la mezcla a 18.000 x g durante 10 min y mezclar el sobrenadante con 1,5 de volumen de etanol absoluto.
      NOTA: La concentración de TCA es del 50% v/v. Para el almacenamiento, manténgalo alejado de la luz.
   6. Precipitar glucógeno en hielo durante 20 min y centrifugar a 18.000 x g durante 10 min. Vierte el sobrenadante.
   7. Disuelva el pellet en 5 mL de ddH₂O, y luego agregue 5 mL de etanol absoluto helado. Incubar la solución durante la noche a 4 °C y centrifugar a 18.000 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y guarde la bolita.
   8. Repita los pasos de "lavado y precipitación" como en el paso 2.1.7 dos veces más.
   9. Finalmente, disuelva el glucógeno precipitado en 400 μL de ddH₂O en un tubo de 2 mL, precongele a -80 °C y liofilice para obtener glucógeno seco en polvo.
2. Extracción con agua fría precipitada con ácido tricloroacético (TCA-CW)
   NOTA: El método TCA-CW es el mismo que el método TCA-HW, excepto que, después de desechar el sobrenadante, tratar el pellet sin hervir (ver paso 2.1.3) y volver a suspenderlo en 20 mL de ddH₂O que contiene 1 mg/mL de cóctel de inhibidores de proteasa.
   1. Para preparar una solución de cóctel de inhibidores de la proteasa de 1 mg/mL, disuelva 50 mg de cóctel de inhibidores de la proteasa en 1 mL de agua desionizada y diluya en una proporción de 50:1 (agua desionizada: solución de cóctel de inhibidores de la proteasa).
3. Extracción de agua fría mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa (SDGU-CW)
   1. Disuelva y homogeneice 1 g de polvo de E. coli liofilizado en 4 mL de tampón de extracción de glucógeno (GEB) con un cóctel de inhibidores de proteasa de 1 mg/mL.
      NOTA: El GEB consta de 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 50 mM de NaF y 5 mM de pirofosfato de sodio. El GEB debe ajustarse a pH 8 con HCl.
   2. Utilice una trituradora de células ultrasónica (25% de energía, 4 °C) para interrumpir las células bacterianas durante 3 minutos (ciclos de trabajo de 8 s e intervalos de 9 s). Asegúrese de que todo el proceso se lleve a cabo en el hielo. Después de la sonificación, transfiera el homogeneizado bacteriano a un tubo de centrífuga, llénelo con GEB hasta un volumen final de 10 mL y agite el tubo para mezclar.
      NOTA: No homogeneizar durante demasiado tiempo, ya que el calor generado puede degradar el glucógeno.
   3. Centrifugar a 6.000 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo ultracentrífugo de 10,4 mL, llene el tubo hasta la parte superior con GEB y, a continuación, centrifugue a 360.000 x g durante 2 h a 4 °C.
      NOTA: Asegúrese de que el tubo esté lleno y que no queden burbujas de aire.
   4. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y vuelva a suspender el precipitado con 2 mL de agua desionizada.
   5. En un nuevo tubo de ultracentrífuga, superponga lentamente 4 mL de solución de sacarosa al 75% con 4 mL de solución de sacarosa al 37,5%. A continuación, coloque la suspensión obtenida en el paso 2.3.4 sobre la solución de sacarosa y rellene con agua desionizada (véase la Figura 1).
      NOTA: La concentración de sacarosa es de 75% [v/v] y 37.5% [v/v]. Tenga cuidado al hacer el gradiente de densidad de sacarosa y asegúrese de que haya una estratificación observable entre las dos soluciones de sacarosa. Además, asegúrese de que no haya burbujas de aire en el tubo de ultracentrífuga.
   6. Centrifugar a 360.000 x g durante 2,5 h a 4 °C y desechar el sobrenadante. Disolver el pellet en 200 μL de agua desionizada. Agregue 800 μL de etanol absoluto para la precipitación de glucógeno.
   7. Precipitar glucógeno a -20 °C durante la noche. Centrifugar a 4.000 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   8. Disuelva el pellet resultante en 400 μL de ddH₂O en un tubo de 2 mL, precongele a -80 °C y liofilice para obtener glucógeno seco en polvo. Conserve el polvo de glucógeno seco a 4 °C para análisis estructural.
      NOTA: El procedimiento detallado se ilustra en la Figura 1.
4. Extracción en solución caliente de hidróxido de potasio al 30% (KOH-HW)
   1. Hervir E . coli liofilizada en polvo (50 mg) en 1 mL de KOH al 30% [p/v] durante 1 h.
   2. Añadir etanol al 67% [v/v] que contenga 15 mM de LiCl para la precipitación a -20 °C durante al menos 1 h. Centrifugar las muestras a 16.000 x g a 4 °C durante 20 min.
      NOTA: El etanol al 67% [v/v] con 15 mM de LiCl contiene 0,6358 g de LiCl, 67 mL de etanol absoluto y 33 mL de agua desionizada.
   3. Vuelva a disolver los pellets en 1 mL de ddH₂O y caliente durante 10 min a 95 °C con agitación intermitente.
   4. Repita el paso de precipitación de etanol tres veces más, como se describe en el paso 2.4.2. Vuelva a disolver el pellet final en 400 μL de ddH₂O en un tubo de 2 mL, precongele a -80 °C y liofilice para obtener polvo de glucógeno seco.

3. Determinación de la estructura del glucógeno

1. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
   1. Resuspender el polvo de glucógeno en solución salina tamponada con Tris de 50 mM (pH 7) con una concentración final de 1 mg/mL.
   2. Diluya 10 veces la suspensión y aplique la suspensión diluida sobre la rejilla de cobre de malla 400 de descarga incandescente.
   3. Después de 2 minutos, extraiga el exceso de muestra de la rejilla con un papel de filtro y tiña la rejilla con 2-3 gotas de acetato de uranilo al 1%.
   4. Utilice un microscopio electrónico de transmisión que funcione a 75 kV para examinar las preparaciones.
2. Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
   1. Preparación de la fase móvil: prepare soluciones de azida sódica al 0,02% (p/p) y nitrato de sodio al 50 mM en agua desionizada y filtre a través de una membrana filtrante de 0,45 μm. Utilice el baño de agua oscilante ultrasónico para sonicar la solución durante más de 15 minutos para eliminar las burbujas de aire.
   2. Preparación de la muestra: Utilice la fase móvil para disolver el polvo de glucógeno de modo que la concentración final sea de 1 mg/mL. Incubar la solución a 80 °C durante la noche en una termobatidora. Centrifugar la muestra disuelta a 6.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente y transferir el sobrenadante a un vial SEC estándar.
   3. Preparación de muestras de glucógeno tratadas con DMSO
      1. Disuelva 1 mg de glucógeno en polvo en 300 μL de DMSO e incube a 80 °C durante la noche en una termomezcladora. Agregue 4 veces el volumen de etanol para precipitar el glucógeno y centrifugar la solución a 6.000 x g.
      2. Lavar el pellet dos veces con etanol, disolver el pellet en ddH₂O y liofilizar.
      3. Analice el polvo de glucógeno liofilizado a través de SEC preparando muestras como se describe anteriormente.
   4. Utilice el sistema SEC con precolumnas y 1000 y 10000 columnas para el análisis de la distribución del tamaño de partícula de glucógeno. Mantenga las columnas a 80 °C y el caudal a 0,3 mL/min.
3. Electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE)
   1. Desramificación del glucógeno
      NOTA: Cuando se utiliza FACE para detectar la distribución de la longitud de la cadena (CLD), todas las muestras que se van a analizar deben someterse al tratamiento previo de desramificación.
      1. Añadir 0,5 mg de glucógeno en polvo, 90 μL de agua caliente (90 °C), 1,5 μL de solución de NaN₃ , 3,5 μL de isoamilasa (200 U/mL) y 8 μL de tampón de ácido acético-acetato de sodio (pH 3,5) a un tubo de ensayo.
         NOTA: La isoamilasa se añade para cortar específicamente la cadena ramificada de la muestra que se va a analizar. La isoamilasa es una enzima desramificadora que puede destruir específicamente el enlace α-(1-6) sin destruir el enlace α-(1-4), por lo que puede escindir específicamente la cadena lateral del glucógeno sin destruir la estructura de la cadena principal.
      2. Incubar la mezcla a 37 °C durante 3 h en una termobatidora. Después de hacer el pH neutro con 8 μL de solución de NaOH 0,1 M, incubar la mezcla a 80 °C durante 1 h en una termomezcladora.
      3. Agregue 4 veces el volumen de etanol absoluto a la mezcla para precipitar el glucógeno. A continuación, centrifugar a 6.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Lave el pellet dos veces con etanol, disuelva el pellet en ddH₂O y liofilice.
   2. Preparación de la solución fluorescente
      1. Centrifugar el frasco de reactivo APTS (sal trisódica del ácido 8-aminopireno-1,3,6-trisulfónico) (cada frasco contiene 5 mg de APTS) a 4.000 x g durante 2 min. Añadir 50 μL de solución de ácido acético al 15% para disolver el polvo, mezclar bien y centrifugar a 4.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente para obtener una solución de ácido acético APTS de 0,2 M.
         NOTA: Mantenga la solución de APTS en un refrigerador a -20 ° C.It debe usarse completamente dentro de las dos semanas posteriores a la apertura. De lo contrario, se desactivará. APTS es un colorante cargado negativamente comúnmente utilizado que se une al extremo reductor de la cadena de glucógeno. Dado que todas las cadenas con diferentes grados de polimerización (DP) llevan una sola carga negativa, FACE puede separarlas en función de sus diferentes relaciones masa-carga. De esta manera, el detector de fluorescencia detecta señales de diferentes valores de DP.
   3. Transfiera el glucógeno desramificado a un tubo de ensayo y agregue 1,5 μL de solución de APTS y 1,5 μL de solución de cianoborohidruro de sodio. Incubar a 60 °C durante 1,5 h en la oscuridad. Añadir 80 μL de agua desionizada, centrifugar a 4.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente y conservar el sobrenadante.
   4. Introducir la muestra en el sistema de electroforesis capilar inyectando durante 3 s a 0,5 psi (3,4 kPa por encima de la presión atmosférica).
      NOTA: Los glucanos lineales marcados con fluorescencia se separaron mediante una tensión aplicada de 30 kV y una corriente aproximada de 14 mA a 25 °C. Las áreas de los picos dieron cantidades relativas de glucanos con diferentes masas (el grado de polimerización (DP) de los glucanos en los picos adyacentes difiere en 1 DP). La temperatura de la muestra se mantuvo a 18 °C.

Results

Distribución del tamaño de las partículas de glucógeno
Una serie de estudios han demostrado que las partículas de α de glucógeno en el hígado diabético son frágiles y se rompen fácilmente en el disruptor de enlace de hidrógeno DMSO 11,12,13,14. El presente estudio probó cómo cambiaba el tamaño de las partículas y la estabilidad estructural del glucógeno bacteriano extraído a...

Discussion

El glucógeno es una importante reserva energética que ha sido identificada en muchas bacterias¹⁶. Para diseccionar las funciones fisiológicas de las partículas de glucógeno, es esencial tener una mejor comprensión de la estructura fina de las moléculas de glucógeno. Hasta ahora, se han desarrollado una variedad de métodos para extraer glucógeno del cultivo bacteriano. Sin embargo, se han observado diferentes distribuciones de tamaño de las partículas de glucógeno ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Agilent 1260 infinity SEC system	Agilent	1260 infinity II	Distribución del tamaño de partícula
Columna analítica	PSS	10-1000-Centrífuga
	Eppendorf	5420-Membrana
filtrante	Cambio	Km-0220	-
Sistema de electroforesis capilar asistida por fluorescencia	Beckman Coulter-Distribución	de	la longitud
Liofilizador	Xinzhi	SCIENTZ-10N	Liofilización de bacterias y glucógeno
Congelador	Thermo Fisher	Forma 900	Almacenamiento de muestras
Columna de protección	PSS	SUPPERMA-Incubadora
	Thermo Fisher	PR505750R-CN	-
Centrífuga de gran capacidad de baja velocidad	Hexi	HR / T20MM	Centrífuga de muestras
Lector de microplacas Multiskan FC	Ultracentrífuga Thermo Fisher	1410101-Optima
XPN	Beckman	XPN-100/90/80	glucógeno
	Xinbao	SHZ-82-PA-800
Plus Sistema	Beckman Coulter	A66528-Medidor	de
pH	Mettler Toledo	FE28 -TRIS-Detector
índice de refracción	Wyatt	Optilab T-rEX-Refrigerador
	Haier	BCD-406WDPD-Thermomixer
	Shanghai Jingxin	JXH-100	Incubación de muestras
Microscopio electrónico de transmisión	Hitachi Corporation	H-7000	Morfología de las partículas de glucógeno
Tubo ultracentrífugo	Beckman		355651-Trituradora de
células ultrasónica	Ningbo Xinzhi	Scientz-IID	Disruptor de bacterias
Baño de agua oscilante ultrasónico	Jietuo	JT-1027HTD-Mezclador	de
vórtice	Tiangen	OSE-VX-01-Sistema de
agua	Merck Millipore	H2O-MM-UV-T	Agua
Material
8-Ácido aminopireno-1,3,6-trisulfónico Sal trisódica	Sigma-Aldrich	196504-57-1-Etanol
absoluto	Guoyao		10009228-Agar
en polvo	Solarbio	A1890-Alfa-amilasa
	Megazyme	E-BLAAM-40ML-Amyloglucosidasa
	Megazyme	E-AMGDF-40ML-cOmplete
Mini	Roche	4693159001-D
- (+)Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-1kg-D-Kit
de ensayo de glucosa (formato GOPOD)	Megazyme	K-GLUC	Cuantificación de glucógeno
Dimetilsulfóxido Vicmed	Vic147	Agente caotrópico
E. coli BL21(DE3)	Tiangen	CB105-02-Ácido
etilendiamina tetraacético	Vicmed	Vic1488	-
Ácido acético glacial	Guoyao
10000218-glicerol	Guoyao	10010618	Almacenamiento bacteriano
Ácido clorhídrico	Guoyao
10011008-hidroximetil aminometano	Sigma-Aldrich	V900483-500g-Isoamilasa
	MegaZyme	9067-73-6	Deramificación de glucógeno
Cloruro de litio	Sigma-Aldrich	62476-100g-M9
, sales mínimas, 5 veces;	Sigma-Aldrich	M6030-1kg	Cultivo bacteriano
Hidróxido de potasio	Guoyao
10017008-Pululano estándar	PSS-		-
Acetato de sodio trihidrato	Guoyao	10018718-Azida
de sodio	Sigma-Aldrich	26628-22-8-Cloruro
de sodio	Guoyao	10019318	Bacteriana cultivo
Cianoborohidruro de sodio	Huaweiruike	hws001297-Difosfato
sodio	Sigma-Aldrich	71515-250g-Fluoruro
de sodio	Macklin	S817988-250g-Hidróxido
de sodio	Guoyao	10019762-Nitrato de
sodio	Guoyao
10019928-Pirofosfato de sodio	Sigma-Aldrich	V900195-500g-Sacarosa
	Guoyao	Ácido
10021463-tricloroacético	Guoyao		40091961-triptona
	Oxoid	LP0042	Cultivo bacteriano
Extracto de levadura	Oxoid	LP0021	Cultivo bacteriano