Artículo de método

Detección de virus y proteínas salivales de un vector saltahojas en el huésped vegetal

DOI:

10.3791/63020

⸱

14 de septiembre de 2021

 ,  ,  , 
1Vector-borne Virus Research Center, Fujian Province Key Laboratory of Plant Virology, Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University

En este artículo

Resumen

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Este protocolo demuestra cómo usar la planta huésped para detectar proteínas salivales de saltahojas y proteínas virales vegetales liberadas por vectores saltahojas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los insectos vectores transmiten horizontalmente muchos virus vegetales de importancia agrícola. Más de la mitad de los virus de las plantas son transmitidos por insectos hemípteros que tienen piezas bucales perforadoras y chupadoras. Durante la transmisión viral, la saliva del insecto une el virus-vector-huésped porque los vectores de saliva los virus, y las proteínas del insecto, desencadenan o suprimen la respuesta inmune de las plantas de los insectos a los huéspedes de las plantas. La identificación y el análisis funcional de las proteínas salivales se están convirtiendo en una nueva área de enfoque en el campo de investigación de las interacciones arbovirus-huésped. Este protocolo proporciona un sistema para detectar proteínas en la saliva de los saltahojas utilizando la planta huésped. El vector saltahojas Nephotettix cincticeps infectado con el virus enano del arroz (RDV) sirve como ejemplo. La vitelogenina y la principal proteína P8 de la cápside externa del RDV vectorizada por la saliva de N. cincticeps se pueden detectar simultáneamente en la planta de arroz de la que se alimenta N. cincticeps. Este método es aplicable para probar las proteínas salivales que se retienen transitoriamente en el huésped de la planta después de la alimentación de insectos. Se cree que este sistema de detección beneficiará el estudio de las interacciones hemíptero-virus-planta o hemíptero-planta.

Introducción

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El modo de transmisión vector-huésped de los arbovirus, un problema fundamental, está en la frontera de la ciencia biológica. Muchos virus vegetales de importancia agrícola son transmitidos horizontalmente por insectos vectores1. Más de la mitad de los virus de las plantas son vectorizados por insectos hemípteros, incluidos pulgones, moscas blancas, saltahojas, saltamontes y trips. Estos insectos tienen características distintivas que les permiten transmitir eficientemente los virus de las plantas1. Poseen piezas bucales perforadoras-chupadoras y se alimentan de la savia del floema y el xilema, y secretan su saliva 1,2,3,4. Con el desarrollo y la mejora de las técnicas, la identificación y el análisis funcional de los componentes salivales se están convirtiendo en un nuevo foco de investigación intensiva. Las proteínas salivales conocidas en la saliva incluyen numerosas enzimas, como pectinesterasa, celulasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, polifenol oxidasa y sacarasa, entre otras 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Las proteínas en la saliva también incluyen elicitores que desencadenan la respuesta de defensa del huésped, alterando así el rendimiento de los insectos, y efectores que suprimen la defensa del huésped, lo que mejora la aptitud del insecto y los componentes que inducen respuestas patológicas del huésped14,15,16,17. Por lo tanto, las proteínas de la saliva son materiales vitales para la comunicación entre insectos y huéspedes. Durante la transmisión de virus, la saliva secretada por las glándulas salivales de los insectos virulíferos penetrantes y chupadores también contiene proteínas virales. Los componentes virales utilizan el flujo de saliva para liberarlos del insecto al huésped de la planta. Por lo tanto, la saliva del insecto une la interacción tritrófica virus-vector-huésped. Investigar la función biológica de las proteínas de la saliva secretadas por insectos virulíferos ayuda a comprender la relación virus-vector-huésped.

Para los virus animales, se informa que la saliva de los mosquitos media la transmisión y patogenicidad del virus del Nilo Occidental (VNO) y el virus del dengue (DENV). La proteína salival AaSG34 promueve la replicación y transmisión del virus del dengue-2, mientras que la proteína salival AaVA-1 promueve la transmisión del virus DENV y Zika (ZIKV) mediante la activación de la autofagia18,19. La proteína salival D7 de los mosquitos puede inhibir la infección por DENV in vitro e in vivo a través de la interacción directa con los viriones DENV y la proteína20 de la envoltura DENV recombinante. En virus vegetales, el begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induce la proteína salival de mosca blanca Bsp9, que suprime la inmunidad mediada por WRKY33 de la planta huésped, para aumentar la preferencia y el rendimiento de las moscas blancas, aumentando eventualmente la transmisión de virus21. Debido a que los estudios sobre el papel que desempeñan las proteínas salivales de los insectos en los huéspedes de las plantas se han quedado atrás de los de los huéspedes animales, se requiere urgentemente un sistema estable y confiable para detectar las proteínas salivales en los huéspedes de las plantas.

El virus vegetal conocido como virus enano del arroz (RDV) es transmitido por el saltahojas Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) con alta eficiencia y de manera persistentemente propagativa22,23. Se informó por primera vez que el RDV era transmitido por un insecto vector y causa una enfermedad grave del arroz en Asia24,25. El virión es icosaédrico y esférico de doble capa, y la capa externa contiene la proteína22 de la cápside externa P8. El período de transmisión circulativa de RDV en N. cincticeps es de 14 días 26,27,28,29,30. Cuando el RDV llega a las glándulas salivales, los viriones se liberan en las cavidades almacenadas en saliva en las glándulas salivales a través de un mecanismo similar a la exocitosis23. La vitelogenina (Vg) es el precursor proteico vitelino esencial para el desarrollo de ovocitos en insectos hembra31,32,33. La mayoría de las especies de insectos tienen al menos una transcripción Vg de 6-7 kb, que codifica una proteína precursora de aproximadamente 220 kDa. Los precursores proteicos de Vg generalmente se pueden escindir en fragmentos grandes (140 a 190 kDa) y pequeños (<50 kDa) antes de ingresar al ovario18,19. Análisis proteómicos previos revelaron la presencia de los péptidos derivados de Vg en la saliva secretada del saltahojas Recilia dorsalis, aunque se desconoce su función (datos inéditos). Se ha informado recientemente que Vg, que es secretada por vía oral de los saltamontes, funciona como un efector para dañar las defensas de las plantas34. Se desconoce si el Vg de N. cincticeps también podría liberarse al huésped de la planta con flujo salival, y luego podría desempeñar un papel en la planta para interferir con las defensas de la planta. Para abordar si N. cincticeps explota proteínas salivales, como Vg, para inhibir o activar las defensas de la planta, el primer paso es identificar las proteínas liberadas a la planta durante la alimentación. Comprender el método para identificar las proteínas salivales presentes en la planta es potencialmente esencial para explicar la función de las proteínas de la saliva y las interacciones entre los hemípteros y las plantas.

En el protocolo presentado aquí, N. cincticeps se utiliza como ejemplo para proporcionar un método para examinar la presencia de proteínas salivales en la planta huésped introducidas a través de la alimentación de insectos. El protocolo detalla principalmente la recolección y detección de proteínas salivales y es útil para una mayor investigación en la mayoría de los hemípteros.

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Protocolo

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Los saltahojas adultos no virulíferos se propagaron en el Centro de Investigación de Virus Transmitidos por Vectores en la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian, China.

1. Cría de insectos no virulíferos

  1. Críe a los adultos en plántulas de arroz en una jaula cúbica de 40 cm x 35 cm x 20 cm (largo x ancho x alto). Mantenga un lado de la jaula cubierto con una red a prueba de insectos para ventilación.
    1. Mantener las jaulas con saltahojas en una incubadora que contenga un controlador de humedad incorporado a 26 °C con una humedad relativa del 60-75% bajo un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad.
  2. Use un aspirador para transferir suavemente a todos los adultos de su jaula a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz fresco cada semana.
    1. Deje que más de 200 adultos se apareen y pongan huevos en el arroz.
    2. Retenga las viejas plántulas de arroz para que emerjan las ninfas. Cría a estas nuevas ninfas no virulíferas a la etapa de 2 estrellas.

2. Adquisición de virus y recolección de insectos virulíferos

  1. Transfiera cuidadosamente las ninfas no virulíferas de 2 estadios a un tubo de cultivo de vidrio (2,5 cm de diámetro por 15 cm de alto) durante 1-2 h para la inanición con el aspirador.
    1. Libere a las ninfas en una jaula que contenga una planta de arroz infectada con RDV cultivada en una maceta.
    2. Permita que las ninfas se alimenten de la planta de arroz infectada durante 2 días.
      NOTA: Riegue cuidadosamente la planta de arroz y evite lavar las ninfas. Las ninfas de 2 estrellas miden aproximadamente 1.6-2 mm de largo.
  2. Transfiera cuidadosamente estas ninfas a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz frescas libres de virus con una humedad relativa del 60-75% bajo un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Permita que las ninfas se alimenten de la planta de arroz infectada durante 12 días para completar el período de transmisión circulativa de RDV.

3. Recolección de proteínas salivales usando una jaula de alimentación

  1. Prepare cinco pequeñas jaulas de alimentación en forma de tubo (2,5 cm de diámetro por 4 cm de alto) en las que un extremo esté cubierto con una red a prueba de insectos.
  2. Confine 15-20 saltahojas en cada jaula de alimentación, y luego cubra el otro extremo de la jaula con una estera de espuma delgada.
    1. Fije una plántula de arroz (5-6 cm de altura) entre el extremo de la jaula y una estera de espuma con cintas. Asegúrese de que los saltahojas en la jaula de alimentación puedan alimentarse de las plántulas de arroz expuestas al interior de la jaula.
  3. Sumerja las raíces de las plántulas en agua para que la planta de arroz permanezca viva. Permita que los saltahojas se alimenten de ellos durante 2 días.
  4. Retire los saltahojas de sus jaulas de alimentación y recoja las plántulas de arroz de las que se alimentaron. Corte las partes de las plántulas fuera de la jaula y recupere las regiones de alimentación de las plántulas.
    NOTA: Esta muestra se puede almacenar a -80 °C durante 3 meses como máximo, si no se utiliza instantáneamente para la detección.

4. Preparación del reactivo

  1. Disuelva 15.1 g de Tris-base, 94 g de glicina y 5 g de SDS en 1 L de agua estéril para preparar 5xTris-glicina tampón. Diluir 200 ml de tampón 5xTris-glicina con 800 mL de agua estéril para preparar 1xTampón Tris-glicina (ver Tabla 1 para la composición tampón).
  2. Disuelva 80 g de NaCl, 30 g de Tris-base y 2 g de KCl en 1 L de agua estéril para preparar 10xTris-buffered saline (TBS). Autoclave de la solución a 121 °C durante 15 min.
  3. Disolver 8 g de SDS, 4 ml de ß-mercaptoetanol, 0,02 g de azul de bromofenol y 40 ml de glicerol en 40 ml de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6,8) para preparar 4x tampón de muestra de proteína.
  4. Mezcle 800 ml de tampón de tris-glicina con 200 ml de metanol para preparar el tampón de transferencia.
  5. Agregue 100 ml de solución de 10xTBS y 3 ml de Tween 20 a 900 ml de agua estéril para preparar el tampón TBS con solución de Tween 20 (TBST).

5. Western blot para detectar la saliva y las proteínas virales

  1. Moler 0,1 g de las muestras de arroz con nitrógeno líquido hasta que el tejido se convierta en polvo. Agregue 200 μL de tampón de muestra de proteína 4x a la muestra y hiérvala durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    1. Retire el sobrenadante y colóquelo en un vial nuevo. Cargue 10 μL de la muestra en un gel SDS-PAGE y ejecútela en tampón Tris-glicina a 150 V durante 45-60 min.
      NOTA: El residuo después de la centrifugación puede desecharse.
  2. Coloque una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm y otros suministros sándwich en el búfer de transferencia durante 30 minutos.
    NOTA: Este paso se puede hacer antes de que el gel haya completado su ejecución.
  3. Coloque el gel en un sándwich y transfiéralo durante 90-120 min a 100 V en el búfer de transferencia.
  4. Tome la membrana y colóquela en una solución bloqueadora de leche en polvo sin grasa al 7% en solución TBST durante 20 minutos. Agregue el anticuerpo específico contra RDV P8 o Vg a una solución al 7% de leche en polvo descremada en TBST. Incubar con el anticuerpo para teñir la membrana durante 2 h o durante la noche.
  5. Lave la membrana con solución TBST tres veces, con 5 minutos de lavado cada vez.
  6. Agregue la IgG anti-conejo de cabra como anticuerpo secundario a la leche en polvo descremada al 7% con TBST. Incubar con el anticuerpo durante 60-90 min a temperatura ambiente.
  7. Lave la membrana con solución TBST tres veces durante 5 minutos cada vez.
  8. Utilice el kit ECL Western para el método quimioluminiscente. Reactivos de detección de mezcla 1 y 2 en el kit en una proporción de 1:1 en un tubo. Coloque el reactivo mezclado en la membrana e incube el blot durante 5 min.
  9. Drene el exceso de reactivo y tome una imagen colorimétrica de la imagen quimioluminiscente. Combínalos para ver la escalera con bandas de proteínas.

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Resultados

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La Figura 1 ilustra todos los pasos de este protocolo: la cría de insectos, la adquisición de virus, la recolección de proteínas salivales a través de la alimentación con arroz y el western blot. Los resultados de Western blots mostraron que se observaron bandas específicas y esperadas de aproximadamente 220 kDa en las muestras de arroz y glándulas salivales de alimentación de insectos en la membrana incubada con anticuerpos contra Vg. En contraste, no se observó ninguna banda en la...

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Discusión

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La saliva secretada directamente por las glándulas salivales de los insectos perforadores-chupadores juega un papel fundamental porque predigiere y desintoxica los tejidos del huésped y los factores biológicos de los vectores en los huéspedes 1,3,4. Los factores biológicos entre reinos, incluyendo elicitores, efectores y ARN pequeño, son críticos para la comunicación insecto-huésped14,15,16

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31772124 y 31972239) y la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian (subvención KSYLX014).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos
Tris base RocheD609K69032para 5&veces; Tampón de tris-glicina y 10&veces; Preparación de tampón TBS
glicinaSigma-AldrichWXBD0677Vpara 5 veces; Preparación de tampón de tris-glicina
SDSSigma-AldrichSLCB4394para 5 veces; Preparación de tampón de tris-glicina
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318para 10 veces; Preparación del tampón TBS
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016318para 10 veces; Preparación de tampón TBS
ß-mercaptoetanolXiya ReactivoB14492Para 4 y veces; preparación de tampón de muestra de proteínas
azul de bromofenolSigma-AldrichSHBL3668para 4 veces; preparación de tampón de muestra de proteínas
glicerolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618 para 4 veces; preparación de tampón de muestra de proteínas
metanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118Para la preparación de tampones de transferencia
Tween 20Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGYCT30111220Para la preparación de TBST
leche en polvo descremadaBecton.Dickinso y compañía252038Para el bloqueo de membranas, dilución de anticuerpos
anti-conejo IgGSangon BiotechD110058-0001Reconocimiento de la esencia primaria y
del cuerpo ECL Western kitThermoFisher Scientific32209Sustrato quimioluminiscente
nitrocelulosa membranaPall Corporation25312915Para la transferencia de proteínas
Tampones y soluciones
TampónComposiciónComentarios/Descripción
  5&veces; Tampón de trisglicina15,1 g Tris base
94 g glycine
  5 g de SDS en 1 L de agua		  Solución de stock
1&veces; Tampón de tris-glicina200 mL de 5 veces; Tampón de trisglicina
800 mL de solución de trabajo de agua		para SDS-PAGE
10× Tampón de solución salina tamponada (TBS)80 g NaCl
30 g Tris base
2 g KCl
en 1 L de agua		Solución madre
TBS con solución Tween 20 (TBST)100 mL 10 mL 10× TBS solución
3 mL Tween 20
900 mL de agua		Solución
trabajo 4 veces; tampón de muestra de proteínas8 g SDS
4 mL ß-mercaptoetanol
0,02 g azul de bromofenol
40 mL glicerol
en 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8)		Para la extracción de proteínas
Tampón de transferencia800 mL Tampón de trisglicina
200 mL de metanol		Para transferencia
de proteínasInstrumentsAzul de
tampones de muestras de proteínas
4x Incubadora de temperatura constanteNingbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.PRX-1200BPara la cría de saltahojas
Electroforesis TanonScience & Tecnología Co., Ltd.Tanon EP300para SDS-PAGE
Módulo de núcleo de transferencia electroforéticaBIO-RAD1703935para glicerol SDS-PAGE
Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618Para 4 veces la preparación de tampón de muestra de proteínas
glicinaSigma-AldrichWXBD0677VPara 5 veces Preparación de tampón de tris-glicina
anti-conejo IgGSangon BiotechD110058-0001Reconocimiento del
instrumento de molienda de tejido de paso altoprimario y tibody Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.JXFSIPRP-24Para la molienda de tejidos vegetales
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016318Para la preparación de tampones 10x TBS
metanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118Para la preparación de tampones de transferencia
Mini canal de transferencia de calor húmedoBIO-RAD1703930para SDS-PAGE
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318Para la preparación de tampón TBS 10x
membrana de nitrocelulosaPall Corporation25312915Para la transferencia de proteínas
leche en polvo descremadaBecton.Dickinso y compañía252038Para el bloqueo de membranas, dilución de anticuerpos
Pierce ECL Western kitThermoFisher Scientific32209Sustrato quimioluminiscente
Instrumento de color de proteínasGE Biociencias de la salud ABAmersham lmager 600Para la detección de proteínas
SDSSigma-AldrichSLCB4394Para 5x Preparación de tampón de tris-glicina
Tris baseRocheD609K69032Para 5x Tampón de tris-glicina y 10&veces; Preparación del tampón TBS
Tween 20Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGYCT30111220para la preparación de TBST
Tanque de electroforesis de placa verticalBIO-RAD1658001para SDS-PAGE
Baño de aguaShanghai Jinghong Equipo experimental Co., Ltd.XMTD-8222Para hervir las muestras de proteínas
β-mercaptoetanolXiya ReactivoB14492Para la preparación de tampones de muestras de proteínas 4x
cabra estéril estéril, estéril estéril de bromofenol Sigma-Aldrich SHBL3668 para la preparación de cabra

Referencias

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