El kit de herramientas genómicas funcionales para los nematodos parásitos Strongyloides stercoralis y Strongyloides ratti incluye transgénesis, mutagénesis mediada por CRISPR / Cas9 y ARNi. Este protocolo demostrará cómo utilizar la microinyección intragonadal para introducir transgenes y componentes CRISPR en S. stercoralis y S. ratti.
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Artículo de método
Generación de transgénicos y knockouts en especies de Strongyloides por microinyección
En este artículo
Resumen
Resumen
El género Strongyloides consiste en múltiples especies de nematodos penetrantes en la piel con diferentes rangos de huéspedes, incluyendo Strongyloides stercoralis y Strongyloides ratti. S. stercoralis es un nematodo parásito de la piel que penetra en la piel y que infecta a aproximadamente 610 millones de personas, mientras que el parásito de la rata S. ratti está estrechamente relacionado con S. stercoralis y se usa a menudo como modelo de laboratorio para S. stercoralis. Tanto S. stercoralis como S. ratti son fácilmente susceptibles a la generación de transgénicos y knockouts a través de la técnica de administración de ácido nucleico exógeno de microinyección intragonadal, y como tales, han surgido como sistemas modelo para otros helmintos parásitos que aún no son susceptibles a esta técnica.
Los adultos parásitos de Strongyloides habitan en el intestino delgado de su huésped y liberan progenie en el medio ambiente a través de las heces. Una vez en el medio ambiente, las larvas se convierten en adultos de vida libre, que viven en heces y producen progenie que debe encontrar e invadir un nuevo huésped. Esta generación ambiental es exclusiva de la especie Strongyloides y lo suficientemente similar en morfología al nematodo modelo de vida libre Caenorhabditis elegans que las técnicas desarrolladas para C. elegans se pueden adaptar para su uso con estos nematodos parásitos, incluida la microinyección intragonadal. Usando microinyección intragonadal, se puede introducir una amplia variedad de transgenes en Strongyloides. Los componentes CRISPR/Cas9 también pueden ser microinyectados para crear larvas mutantes de Strongyloides . Aquí, se describe la técnica de microinyección intragonadal en Strongyloides, incluida la preparación de adultos de vida libre, el procedimiento de inyección y la selección de la progenie transgénica. Se incluyen imágenes de larvas transgénicas de Strongyloides creadas mediante mutagénesis CRISPR/Cas9. El objetivo de este artículo es permitir a otros investigadores utilizar la microinyección para crear Strongyloides transgénicos y mutantes.
Introducción
Strongyloides stercoralis se ha pasado por alto durante mucho tiempo como un patógeno humano importante en comparación con los anquilostomas más ampliamente reconocidos y el gusano redondo Ascaris lumbricoides1. Los estudios previos sobre la carga de gusanos a menudo subestimaron gravemente la prevalencia de S. stercoralis debido a la baja sensibilidad de los métodos de diagnóstico comunes para S. stercoralis2. En los últimos años, estudios epidemiológicos basados en herramientas diagnósticas mejoradas han estimado que la verdadera prevalencia de infecciones por S. stercor....
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Protocolo
NOTA: Los jerbos se usaban para pasar S. stercoralis, y las ratas se usaban para pasar S. ratti. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Oficina de Supervisión de Investigación Animal de UCLA (Protocolo No. 2011-060-21A), que se adhiere a los estándares AAALAC y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Las siguientes tareas deben completarse al menos un día antes de la microinyección: cultivo de gusanos, preparación de almohadillas de microinyección, creación de construcciones para la mezcla de microinyección y propagación de bacterias (E. coli HB101) en placas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) de 6 cm
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Resultados
Si el experimento tuvo éxito, las larvas de F1 expresarán el fenotipo transgén y/o mutante de interés (Figura 4). Sin embargo, las tasas de transformación son muy variables y dependen de las construcciones, la salud de los gusanos, las condiciones de cultivo posteriores a la inyección y la habilidad del experimentador. En general, un experimento exitoso producirá larvas de >15 F1 por hembra inyectada y una tasa de transformación del >3% para los marcadores fluores.......
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Discusión
Este protocolo de microinyección detalla los métodos para introducir constructos para la transgénesis y la mutagénesis mediada por CRISPR/Cas9 en S. stercoralis y S. ratti. Tanto para S. stercoralis como para S. ratti, la supervivencia posterior a la inyección y la tasa de transgénesis o mutagénesis están sujetas a varias variables que pueden ajustarse.
La primera consideración crítica para una transgénesis exitosa es cómo se construyen los transgenes plásm.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
pPV540 y pPV402 fueron amables regalos del Dr. James Lok de la Universidad de Pensilvania. Agradecemos a Astra Bryant por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por un Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, un Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award y National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (&menos;)-Nicotina, ≥ 99% (GC), líquido | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | nicotina para gusanos paralizantes |
| Abrazadera en C de hierro de 3", 3" x 2" (capacidad x profundidad) | VWR | 470121-790 | Abrazadera en C para asegurar la instalación en la mesa de trabajo |
| Agarosa LE | Phenix | RBA-500 | para portaobjetos |
| Carbón de hueso, cubo de 4 libras, malla de 10 x 28 | Carbón Ebonex | n/a | para cultivos |
| de carbón fecalCarbón de hueso, gránulos, malla 10 x 28 | Carbón | Reade bonechar10x28 | para cultivos fecales (alternativo al anterior) |
| Micromanipulador grueso | Narishige | MMN-1 | Micromanipulador |
| Filtros de tubo de centrífuga Corning Costar Spin-X | Columna | microfiltro Fisher | 07-200-385 |
| Cubreobjetos, 48 x 60 mm, espesor n.º 1 | Cubreobjetos Brain Research Lab | 4860-1 | (48 x 60 mm) |
| Placas de Petri profundas, versión pesada con 6 rejillas de ventilación, 100 mm de diámetro | VWR | 82050-918 | Placas de Petri de 10 cm (para cultivos de carbón fecal) |
| Base de retorta Eisco con varilla | Fisher | 12-000-101 | soporte para aparato Baermann |
| Eppendorf FemtoJet microinyector puntas de microcargador | VWR | 89009-310 | para el llenado de agujas de microinyección |
| Almohadillas absorbentes Fisherbrand | Fisher | 14-206-62 | papel de banco (para preparar) |
| Fisherbrand Anillos de hierro fundido | Fisher | 14-050CQ | Junta tórica Baermann |
| Vasos de precipitados de polipropileno de tres esquinas | Fisherbrand Fisher | 14-955-111F | Vaso de precipitados de plástico (para mezclar) |
| Fisherbrand vasos de precipitados de polipropileno de tres esquinas | Fisher | 14-955-111F | Vaso de precipitados de plástico (para cubo de captura/cubo de agua) |
| Vasos de precipitados de polipropileno de tres esquinas | Fisherbrand Fisher | 14-955-111F | Vaso de precipitados de plástico (x2) (para hacer soporte) |
| Epoxi de gorila en jeringa | Pegamento McMaster-Carr | 7541A51 | (para unir tubos) |
| Aceite de halocarbono 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | Tubo |
| caucho de silicona de alta temperatura para alimentos y bebidas, 1/2" ID, 5/8" OD | McMaster-Carr | Tubo 3038K24 | (para embudo) |
| Embudos KIMAX, vástago largo, 60° Ángulo, Kimble Chase | VWR | 89001-414 | Embudo Baermann |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Protectores de sobremesa | Fisher | 15-235-101 | papel de banco (para la preparación) |
| Microscopio estereoscópico Leica con fluorescencia | Microscopio | M165 FC | GFP para la identificación y clasificación de gusanos transgénicos |
| microINJECTOR portaagujas de brazo recto de latón | Tritech | MINJ-4 soporte de | aguja de microinyección |
| sistema microINJECTOR | Tritech | MINJ-1 | |
| Jerbos mongoles | Laboratorios Charles River | 213-jerbos mongoles | para el mantenimiento de S. stercoralis, macho 4-6 semanas |
| Nasco Whirl-Pak bolsas fáciles de cerrar, 18 oz | VWR | 11216-776 | Bolsas de muestra Whirl-Pak |
| nailon (malla) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | malla de nailon para soporte Baermann |
| Alambre de platino, calibre 36, por pulgada | Alambre de platino/iridio | Thomas Scientific | 1233S72 |
| Depresores linguales puritanos, 152 mm (largo) x 17,5 mm (ancho) | Palos de madera VWR | 62505-007 | (para mezclar muestras) |
| Kit de minipreparación QIAprep Spin (250) | QIAGEN | 27106 | Kit |
| de minipreparación QIAGENRats-Long Evans | Envigo 140 HsdBlu:LE Long Evans | ratas para el mantenimiento de S. ratti, hembra 4-6 semanas | |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | ratas para el mantenimiento de S. ratti, hembra 4-6 semanas |
| Cajas realmente útiles Cajas de almacenamiento translúcidas con tapa, 1,6 L de capacidad, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" | Office Depot | 452369 | cajas de plástico para cámara |
| humidificadaShepherd techboard, 8 x 16.5 pulgadas | Newco | 999589 techboard | |
| Suelo de alambre elevado de acero inoxidable | Fondos de jaula de alambre | R20SSRWF Ancare | |
| Cucharas para cubiertos compostables StalkMarket, 6", blanco, paquete de 1,000 | cucharas | de 9587303 de Office Depot | |
| Plato tierno, tipo apilable, 37 x 25 mm | Carolina (Ciencia) | 741012 | gafas de reloj (pequeñas, redondas) |
| Microscopio estereoscópico | Motic | K-400 LED | disección |
| Bolsa de almacenamiento, color claro/blanco, altura exterior 4-7/8 pulgadas, longitud exterior 13-5/8 pulgadas, Sterilite | Grainger | 53GN16 | cajas de plástico para cámara humidificada |
| Extractor de micropipetas Sutter P-30 Tirador de | Sutter | P-30/P | con filamento de platino/iridio |
| Gafas de reloj Syracuse | Fisher | S34826 | gafas de reloj (grandes, redondas) |
| Thermo Scientific Abrazaderas de ángulo fijo Castaloy | Fisher | 05-769-2Q | abrazaderas de embudo (2x) |
| Joystick colgante de tres ejes micromanipulador hidrólico de aceite | Narishige | MM0-4 | micromanipulador fino |
| United Mohr abrazaderas de llave de presión | Fisher | S99422 | Pinzas de apriete (2x) |
| Placas de Petri ventiladas y de borde afilado (60 mm de diámetro) | Tritech Investigación | T3308P Placas | de Petri de 6 cm (para cultivos de carbón fecal a pequeña escala) |
| Limpiadores de pañuelos ligeros VWR | VWR | 82003-820 | Revestimiento para portarelojes Baermann |
| , cuadrado, 1-5/8 pulgadas | Carolina (Science) | 742300 | Gafas de reloj (pequeñas, cuadradas) |
| Whatman Círculos lisos de grado cualitativo, grado 1, 5,5 cm de diámetro | Papel | 09-805B | (para Petri de 6 cm platos) |
| Círculos lisos de grado cualitativo Whatman, grado 1, 9 cm de diámetro | Fisher | 09-805D | papel de filtro (para placas de Petri de 10 cm) |
| Capilar de vidrio de borosilicato World Precision Instrument, 1,2 mm x 4 pulgadas | Capilares | 50-821-813 | para agujas de microinyección |
| Cuchillos X-Acto, cuchillo n.º 1 con hoja n.º 11 | Cuchillos de 238816 | X-Acto de Office Depot sin hojas para sujetar picos de gusano | |
| Microscopio invertido Zeiss AxioObserver A1 | Zeiss | n/a |
Referencias
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).
- Buonfrate, D., et al.
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Reimpresiones y permisos
