Reconstrucción y análisis en 3D de estructuras neuronales subcelulares delgadas mediante datos de microscopía electrónica de barrido de haz de iones enfocados

Summary

Un canal metodológico flexible para identificar, visualizar y cuantificar procesos neuronales subcelulares delgados dentro de volúmenes de imágenes de microscopía electrónica de barrido con haz de iones enfocados utilizando paquetes de software de código abierto fáciles de usar.

Abstract

Los avances recientes en las tecnologías de microscopio electrónico de barrido permiten ahora el análisis tridimensional rápido (3D) de procesos subcelulares ultrafinos. Aquí, se presenta una línea metodológica para identificar, visualizar y analizar procesos neuronales delgados, como los que se proyectan en los botones presinápticos de otras neuronas (denominados 'espínulas'). Utilizando paquetes de software disponibles gratuitamente, este protocolo demuestra cómo utilizar un árbol de decisión para identificar estructuras subcelulares neuronales comunes utilizando criterios morfológicos dentro de volúmenes de imágenes de microscopía electrónica de barrido con haz de iones focalizado (FIB-SEM), con especial atención a la identificación de una diversidad de espínulas que se proyectan en botones presinápticos. En particular, este protocolo describe cómo rastrear las espínulas dentro de las sinapsis neuronales para producir reconstrucciones en 3D de estas proyecciones subcelulares delgadas, sus neuritas progenitoras y socios postsinápticos. Además, el protocolo incluye una lista de programas de software de código abierto disponibles gratuitamente para analizar datos FIB-SEM y ofrece consejos (por ejemplo, suavizado, iluminación) para mejorar las reconstrucciones 3D para su visualización y publicación. Este protocolo adaptable ofrece un punto de entrada al análisis rápido a nanoescala de estructuras subcelulares dentro de volúmenes de imágenes FIB-SEM.

Introduction

Las investigaciones sobre las relaciones estructura-función de los componentes subcelulares nanométricos a menudo se benefician de la visualización y el análisis en 3D¹. Sin embargo, los estudios de microscopía electrónica de transmisión de sección en serie se han visto limitados temporal y espacialmente por la necesidad de utilizar un cuchillo de diamante para cortar y alinear cientos o miles de secciones ultrafinas en serie de ≥40 nm. Estas limitaciones han limitado la capacidad de muestrear y analizar eficazmente estructuras subcelulares delgadas (<40 nm de diámetro), y la necesidad de dominar el corte en se....

Protocol

1. Datos de volumen de imagen y tamaño del objeto subcelular: consideraciones y registro

1. Obtener un volumen de imagen FIB-SEM de calidad del área de interés que contiene los objetos subcelulares de interés.
   NOTA: Este protocolo utiliza segmentos de un volumen de imagen FIB-SEM de la corteza visual primaria de un hurón adolescente tardío (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, vóxeles isotrópicos de 4 nm), y un volumen FIB-SEM de libre acceso del hipocampo CA1 de rata adulta (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; vóxeles isotrópicos de 5 nm) puesto a disposición por el laboratorio Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Es fundamental prepa....

Results

Cuantificación del porcentaje de espínulas sinápticas dentro de la población de botones presinápticos excitatorios en la corteza visual primaria de hurones
Aunque se han observado protuberancias en forma de espínulas de las neuritas en los botones presinápticos excitatorios durante décadas^19,26, su importancia potencial para la función sináptica ha permanecido oscura. Estos experimentos se diseñaron para determinar la proporción de botones pre.......

Discussion

Esta canalización de análisis de volumen de imágenes FIB-SEM puede producir reconstrucciones 3D fiables y mediciones cuantitativas de estructuras subcelulares delgadas. Si bien las técnicas semiautomatizadas actuales que utilizan redes neuronales profundas y algoritmos de segmentación pueden aumentar la velocidad y la eficiencia en la reconstrucción de estructuras celulares que poseen un contraste de membrana relativamente alto dentro de grandes volúmenes de imágenes^33<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruir			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender Blender	Foundation		https:/www.blender.org