Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota

El glucógeno está ampliamente distribuido en la naturaleza, y el compuesto se encuentra en bacterias, muchos protistas, hongos y animales. En los microorganismos, el glucógeno es importante para la supervivencia celular cuando los nutrientes son limitantes y, en organismos superiores como los mamíferos, la síntesis y degradación del glucógeno sirven para amortiguar los niveles de glucosa en sangre ^1,2,3. El estudio del metabolismo del glucógeno es, por lo tanto, de importancia para campos tan diversos como la microbiología y la fisiología de los mamíferos. Comprender el metabolismo del glucógeno requiere estudiar las enzimas clave de la síntesis de glucógeno (glucógeno sintasa y la enzima ramificante) y la degradación del glucógeno (glucógeno fosforilasa y enzima desramificante). Los ensayos estándar de oro de glucógeno sintasa, fosforilasa, ramificación y actividades enzimáticas de desramificación emplean isótopos radiactivos. Por ejemplo, la glucógeno sintasa se mide generalmente en un ensayo radioquímico detenido siguiendo la incorporación de glucosa de UDP-[14 C]glucosa (en el caso de enzimas animales y fúngicas) o ADP-[¹⁴C]glucosa (en el caso de enzimas bacterianas) en glucógeno ^4,5. Del mismo modo, la glucógeno fosforilasa se mide en la dirección de la síntesis de glucógeno, después de la incorporación de glucosa de [¹⁴C] glucosa-1-fosfato en glucógeno⁶. La enzima de ramificación se ensaya midiendo la capacidad de esta enzima para estimular la incorporación de [14 C]glucosa de glucosa-1-fosfato en cadenas ligadas a α1,4 por la glucógeno fosforilasa⁷, y la actividad enzimática de desramificación se determina siguiendo la capacidad de la enzima para incorporar [¹⁴C]glucosa en glucógeno⁸ . Si bien son muy sensibles, lo que permite su uso en extractos de células crudas con bajos niveles de actividad enzimática, los sustratos radiactivos son caros y están sujetos a los requisitos reglamentarios relacionados con el uso de radioisótopos. Estas barreras ponen el uso de ciertos ensayos fuera del alcance de muchos trabajadores. Sin embargo, a lo largo de muchos años, se ha descrito una impresionante variedad de enfoques espectrofotométricos para la medición de estas enzimas. En general, estos enfoques se basan en última instancia en la medición de la producción o el consumo de NADH / NADPH, o la generación de complejos coloreados entre el glucógeno y el yodo. Por lo tanto, son sencillos y se pueden llevar a cabo utilizando espectrofotómetros simples equipados solo con lámparas de flash de tungsteno o xenón.

Los ensayos espectrofotométricos de glucógeno sintasa se basan en la medición del nucleósido difosfato liberado por el donante de nucleótido de azúcar a medida que la glucosa se agrega a la creciente cadena de glucógeno ^9,10. El procedimiento para medir la actividad de la glucógeno sintasa descrito en la sección 1 del protocolo, a continuación, es una modificación de la descrita por Wayllace et ^al.11, y el esquema de acoplamiento se muestra a continuación:

(Glucosa) _n + UPD-glucosa → (glucosa)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP

Piruvato + NADH + H+ → Lactato + NAD⁺

La glucógeno sintasa agrega glucosa de UDP-glucosa al glucógeno. El UDP generado en este proceso se convierte en UTP por nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa), en una reacción que genera ADP. El ADP, a su vez, sirve como sustrato para la piruvato quinasa, que fosforila el ADP utilizando fosfoenolpiruvato como donante de fosfato. El piruvato resultante se convierte en lactato por la enzima lactato deshidrogenasa en una reacción que consume NADH. Por lo tanto, el ensayo se puede realizar de manera continua, monitoreando la disminución de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume NADH. Se adapta fácilmente para su uso con enzimas que requieren ADP-glucosa como donante de glucosa. Aquí, los pasos de acoplamiento son más simples ya que el ADP liberado por la acción de la glucógeno sintasa es directamente actuado por la piruvato quinasa.

Hay una variedad de ensayos espectrofotométricos disponibles para la determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa. En la versión clásica, la enzima es impulsada hacia atrás, en la dirección de la síntesis de glucógeno, como se muestra a continuación:

(Glucosa) _n + Glucosa-1-fosfato → (Glucosa)_n+1 + P_i

A intervalos de tiempo, se eliminan las alícuotas de la mezcla de reacción y se cuantifica la cantidad de fosfato liberado^12,13. En nuestras manos, este ensayo ha sido de uso limitado debido a la presencia de fosfato libre fácilmente medible en muchas preparaciones comerciales de glucosa-1-fosfato, combinado con las altas concentraciones de glucosa-1-fosfato requeridas para la acción de la fosforilasa. Más bien, hemos empleado rutinariamente un ensayo alternativo que mide la glucosa-1-fosfato liberada a medida que el glucógeno es degradado por la fosforilasa¹³. Se emplea un esquema de reacción acoplada, ilustrado a continuación.

(Glucosa) n + P_i → (Glucosa)_n-1 + _{Glucosa-1-fosfato}

Glucosa-1-fosfato → Glucosa-6-fosfato

Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H⁺

La glucosa-1-fosfato se convierte en glucosa-6-fosfato por la fosfoglucomutasa, y la glucosa-6-fosfato se oxida a 6-fosfogluconolactona, con la reducción concomitante de NADP ⁺ a NADPH. El procedimiento detallado en la sección 2 del protocolo, a continuación, se deriva de los métodos descritos por Mendicino et al.14 y Schreiber & Bowling ¹⁵. El ensayo se puede realizar fácilmente de manera continua, con el aumento de la absorbancia a 340 nm con el tiempo, lo que permite la determinación de la velocidad de reacción.

La determinación espectrofotométrica de la actividad enzimática desramificante se basa en la medición de la glucosa liberada por la acción de la enzima sobre la dexforilasa límite de dextrina¹⁶. Este compuesto se elabora tratando el glucógeno exhaustivamente con glucógeno fosforilasa. Dado que la acción de la glucógeno fosforilasa detiene 4 residuos de glucosa lejos de un punto de ramificación α1,6, el límite de dextrina contiene glucógeno, cuyas cadenas externas se han acortado a ~ 4 residuos de glucosa. La preparación de la dextrina límite de fosforilasa se describe aquí, utilizando un procedimiento derivado de los desarrollados por Taylor et al.17 y Makino & Omichi¹⁸.

La desramificación es un proceso de dos pasos. La actividad de la 4-α-glucanotransferasa de la enzima desramificante bifuncional transfiere primero tres residuos de glucosa desde el punto de ramificación al extremo no reductor de una cadena de glucosa cercana ligada a α1,4. El único residuo de glucosa ligado a α1,6 que queda en el punto de ramificación es hidrolizado por la actividad de la α1,6-glucosidasa¹⁹. El ensayo generalmente se realiza de manera detenida, la glucosa liberada después de un tiempo determinado (o serie de veces) se mide en un ensayo enzimático acoplado como se muestra a continuación:

(Glucosa) n → (Glucosa)_n-1 + Glucosa

Glucosa + ATP → Glucosa-6-fosfato + ADP

Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H⁺

La determinación de NADPH producido da una medida de la producción de glucosa. El procedimiento descrito en la sección 3 del protocolo, a continuación, se basa en uno descrito por Nelson et ^al.16. Al igual que los otros métodos que dependen del consumo o la generación de NADH / NADPH, el ensayo es bastante sensible. Sin embargo, la presencia de amilasas u otras glucosidasas, que también pueden liberar glucosa libre de la dextrina límite fosforilasa, causará interferencia significativa (ver Discusión).

La determinación colorimétrica de la actividad enzimática ramificada se basa en el hecho de que las cadenas de glucosa α1,4 adheridas adoptan estructuras helicoidales que se unen al yodo, formando complejos coloreados²⁰. El color del complejo formado depende de la longitud de las cadenas enlazadas α1,4. Por lo tanto, la amilosa, que consiste en cadenas largas, en gran parte no ramificadas, de glucosa ligada a α1,4, forma un complejo azul profundo con yodo. En contraste, los glucógenos, cuyas cadenas externas son generalmente del orden de solo 6 a 8 residuos de glucosa de largo, forman complejos de color rojo anaranjado. Si una solución de amilosa se incuba con enzima ramificada, la introducción de ramas en la amilosa da como resultado la generación de cadenas de glucosa ligadas a α1,4 más cortas. Por lo tanto, el máximo de absorción de los complejos amilosa / yodo se desplaza hacia longitudes de onda más cortas. El procedimiento discutido aquí se deriva del detallado por Boyer & Preiss²¹ y la actividad enzimática de ramificación se cuantifica como una reducción en la absorción del complejo amilosa / yodo a 660 nm con el tiempo.

Como debería ser fácilmente evidente a partir de la discusión anterior, el hecho de que los colores de los complejos formados entre las cadenas de yodo y α1,4-glucosa varíen con la longitud de la cadena significa que los espectros de absorbancia de los complejos glucógeno/yodo deberían variar con el grado de ramificación del glucógeno. Este es de hecho el caso, y los glucógenos / glucógenos menos ramificados con cadenas externas más largas absorben la luz a una longitud de onda más larga que los glucógenos que son más ramificados / tienen cadenas externas más cortas. Por lo tanto, la reacción de tinción de yodo puede utilizarse para obtener datos rápidos y cualitativos sobre el grado de ramificación del glucógeno²². El color marrón anaranjado se forma cuando los complejos de glucógeno con yodo no son particularmente intensos. Sin embargo, el desarrollo del color puede mejorarse con la inclusión de una solución saturada de cloruro de calcio²². Esto aumenta la sensibilidad del método unas 10 veces y permite un análisis rápido de cantidades de microgramos de glucógeno. El ensayo para la determinación de la ramificación descrito en la sección 4 del protocolo, a continuación, está adaptado de un procedimiento desarrollado por Krisman²². Se lleva a cabo simplemente combinando la muestra de glucógeno con solución de yodo y cloruro de calcio en una cubeta y recogiendo el espectro de absorción de 330 nm a 800 nm. El máximo de absorbancia cambia hacia longitudes de onda más largas a medida que disminuye el grado de ramificación.

En conjunto, los métodos descritos aquí proporcionan medios simples y confiables para evaluar las actividades de las enzimas clave del metabolismo del glucógeno y para obtener datos cualitativos sobre el alcance de la ramificación del glucógeno.

1. Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa

1. Preparar soluciones madre de los reactivos necesarios como se indica en la Tabla 1 (antes del día experimental).

Tabla 1: Soluciones madre necesarias para el ensayo de la actividad de la glucógeno sintasa.

2. El día del ensayo, preparar una nueva solución de trabajo de 4 mM de NADH disolviendo 4,5 mg de NADH en 1,5 ml de 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0. Almacenar en hielo, protegido de la luz.
3. Descongele las soluciones madre de UDP-glucosa, ATP, fosfoenolpiruvato y NDP quinasa en hielo.
4. Precalentar un baño maría a 30 °C.
5. Configure cada ensayo de glucógeno sintasa en un tubo de 1,5 ml agregando los reactivos de mezcla de reacción enumerados en la Tabla 2.

Tabla 2: Composición de la mezcla de reacción para el ensayo de la actividad de la glucógeno sintasa.

NOTA: Para facilitar la configuración, se puede hacer una mezcla maestra que contenga suficiente cantidad de cada uno de los reactivos mencionados anteriormente para completar el número de ensayos planificados.

6. Prepare una reacción en blanco, donde el NADH en la mezcla anterior se reemplaza con agua. Transfiera a una cubeta desechable de metacrilato y utilícela para establecer el cero en el espectrofotómetro a 340 nm.
7. Tomar un 770 μL de la alícuota de la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 ml. Añadir 2 μL de NDP quinasa y 2 μL de mezcla de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa, mezclar suavemente e incubar a 30 °C durante 3 min para precalentar la mezcla de reacción.
8. Añadir 30 μL de la muestra que contiene glucógeno sintasa en tampón Tris de 20 mM, pH 7,8; mezclar y transferir la mezcla de reacción a una cubeta desechable de metacrilato.
9. Coloque la cubeta en el espectrofotómetro y registre la absorbancia a 340 nm a intervalos cronometrados de 10 a 20 min. Trazar las absorbancias obtenidas contra el tiempo.
   NOTA: Se debe realizar una reacción en la que la muestra de glucógeno sintasa se reemplaza con tampón Tris de 20 mM para controlar la oxidación no enzimática de NADH. Dependiendo de la pureza de la muestra, pueden ser necesarias otras reacciones de control. Consulte Discusión para obtener más detalles.
10. Determine la velocidad de reacción (consulte Resultados para obtener más información).

2. Determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa

1. Preparar las soluciones madre como se indica en la Tabla 3 (antes del día experimental).

Tabla 3: Soluciones madre necesarias para el ensayo de la actividad de la glucógeno fosforilasa.

2. Precalentar un baño maría a 30 °C
3. Configure cada ensayo de glucógeno fosforilasa en un tubo de 1,5 ml agregando los reactivos de mezcla de reacción que se enumeran a continuación (Tabla 4).

Tabla 4: Composición de la mezcla de reacción para el ensayo de la actividad de la glucógeno fosforilasa.

NOTA: Para facilitar la configuración, se puede hacer una mezcla maestra que contenga suficiente cantidad de cada uno de los reactivos mencionados anteriormente para completar el número de ensayos planificados.

5. Preparar una reacción en blanco que contenga los componentes enumerados en la Tabla 4 , pero añadir 30 μL adicionales de tampón PIPES de 25 mM, pH 6,8 (preparado diluyendo 125 mM PIPES tampón 1/5 con agua). Transfiera a una cubeta desechable de metacrilato y utilícela para establecer el cero en el espectrofotómetro a 340 nm.
6. Tomar una alícuota de 770 μL de mezcla de reacción en un tubo de 1,5 ml. Añadir 1 μL de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y 1 μL de fosfoglucommutasa, mezclar suavemente e incubar a 30 °C durante 3 min para precalentar la mezcla de reacción.
7. Añadir 30 μL de la muestra que contiene glucógeno fosforilasa en tampón PIPES de 25 mM, pH 6,8. Mezclar y transferir la mezcla de reacción a una cubeta desechable de metacrilato.
8. Coloque la cubeta en el espectrofotómetro y registre la absorbancia a 340 nm a intervalos cronometrados de 10 a 20 min. Trazar las absorbancias obtenidas contra el tiempo.
   NOTA: Se debe incluir una reacción en la que la glucógeno fosforilasa se reemplaza con tampón PIPES de 25 mM. Dependiendo de la pureza de la muestra de glucógeno fosforilasa, también pueden ser necesarios otros controles (ver Discusión para más detalles).
9. Determine la velocidad de reacción (consulte Resultados representativos para obtener más detalles).

3. Determinación de la actividad enzimática desramificante del glucógeno

1. Preparar las soluciones madre como se indica en la Tabla 5 (antes del día experimental).

Tabla 5: Soluciones madre necesarias para el ensayo de la actividad enzimática desramificante del glucógeno.

2. Preparar la dextrina límite fosforilasa
   1. Disolver 0,3 g de glucógeno de ostra en 10 mL de tampón fosfato de sodio de 50 mM, pH 6,8.
   2. Disuelva suficiente polvo de fosforilasa A liofilizada para producir 60 U de actividad en tampón fosfato de 50 mM, pH 6.8.
      NOTA: Dependiendo del lote de fosforilasa A comprado, la masa necesaria variará, pero generalmente es entre 5 y 10 mg de polvo.
3. Agregue 60 U de fosforilasa A a la solución de glucógeno y transfiérala a una bolsa de diálisis. Dializar a temperatura ambiente contra 1 L de tampón fosfato sódico de 50 mM, pH 6,8 durante 8 h. Cambie al tampón de diálisis fresco y continúe la incubación durante la noche.
4. Agregue otros 10 U de fosforilasa A y cambie a tampón de diálisis nuevo. Después de 8 h, cambie nuevamente a tampón de diálisis fresco y continúe la incubación durante la noche.
5. Transfiera el contenido de la bolsa de diálisis a un tubo de centrífuga y hierva durante 10 minutos. Enfriar sobre hielo y luego centrifugar a 10,000 x g durante 15 min.
6. Transfiera el sobrenadante a una bolsa de diálisis y dialice durante 8 h contra tres cambios de 2 L de agua destilada.
7. Transfiera el contenido de la bolsa de diálisis a un tubo de centrífuga de 50 ml. Mida el volumen y agregue dos volúmenes de etanol absoluto helado para precipitar el límite de dextrina. Deje reposar el tubo sobre hielo durante 30 minutos.
   NOTA: Un precipitado blanco debe comenzar a formarse inmediatamente después de la adición de etanol pero, si no lo hace, agregue una gota de 3 M NaCl.
8. Centrifugar a 15.000 x g durante 15 min y desechar el sobrenadante. Enjuague el pellet blanco de dextrina límite dos veces con etanol al 66% v/v, usando ~30 mL para cada enjuague.
9. Transfiera la dextrina límite a un mortero y deje secar completamente al aire. Cuando el límite de dextrina esté seco, moler hasta obtener un polvo con un mortero y transferirlo a un recipiente adecuado para su almacenamiento; seco a 4 °C.
10. Para su uso como sustrato enzimático desramificador, prepare una solución p/v al 1% en agua.
11. Precalentar un baño maría a 30 °C.
12. Precaliente un bloque calefactor o un baño de agua a 95 °C.
13. Prepare cuatro tubos de 1,5 ml cada uno con 100 μL de tampón maleato, 80 μL de dextrina límite de fosforilasa y 10 μL de agua. Estos tubos se utilizarán para realizar el ensayo de la enzima desramificante. Etiquete dos de los tubos Reacción y los otros dos tubos Control.
14. A intervalos cronometrados, añadir 10 μL de la muestra de la enzima desramificante a los tubos de reacción y 10 μL de tampón que se utilizó para preparar la muestra de la enzima ramificada a los tubos de control. Incubar a 30 °C.
15. En momentos de tiempo definidos (por ejemplo, incubación de 5, 10 y 20 minutos), extraiga 50 μL de cada tubo de reacción y control y colóquelos inmediatamente en el bloque de calentamiento o en el baño de agua a 95 °C. Calentar durante 3 min.
16. Centrifugar a 15.000 x g durante 2 min para eliminar la proteína precipitada.
    NOTA: En este punto, el procedimiento se puede detener si es necesario. Las muestras calentadas pueden almacenarse congeladas a -20 °C hasta proceder a la medición de la glucosa liberada (paso 17, a continuación).
17. Medición de la glucosa liberada
    1. Transfiera 40 μL del sobrenadante de las muestras calentadas a cubetas de metacrilato desechables y agregue 833 μL de tampón de clorhidrato de trietanolamina/sulfato de magnesio, 67 μL de mezcla NADP/ATP y 60 μL de agua. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.
       NOTA: Para facilitar la configuración, se puede hacer una mezcla maestra que contenga suficiente cantidad de cada uno de los reactivos mencionados anteriormente para completar el número de ensayos planificados.
    2. Prepare una reacción en blanco combinando 100 μL de tampón de maleato, 80 μL de dextrina límite de fosforilasa y 20 μL de agua. Mezclar bien y transferir 40 μL a una cubeta desechable de metacrilato. Añadir 833 μL de clorhidrato de trietanolamina/sulfato de magnesio, etc., como se describe en el paso 3.17.1.
    3. Ajuste el cero en el espectrofotómetro a 340 nm usando la reacción en blanco.
    4. Agregue 0.5 μL de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa a cada cubeta. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min, y luego registrar la absorbancia a 340 nm.
       NOTA: Los valores de absorción deben ser bajos, lo que significa poca contaminación de las muestras con glucosa-6-fosfato.
    5. Agregue 0.5 μL de hexoquinasa a cada cubeta. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min, y luego registrar la absorbancia a 340 nm.
    6. Continúe la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos adicionales. Registre la absorbancia a 340 nm una vez más. Si la absorción ha aumentado con respecto a la registrada a los 15 min, continúe la incubación durante otros 5 minutos y vuelva a comprobar la absorción. Registrar la absorción final a 340 nm obtenida.
    7. Para cada muestra, restar la absorbancia a 340 nm registrada después de la adición de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de la absorbancia final obtenida después de la adición de hexoquinasa. Trazar los valores obtenidos contra el tiempo que la muestra correspondiente había sido incubada con la enzima desramificante.

4. Determinación de la actividad enzimática de ramificación del glucógeno

1. Antes del día experimental, prepare la solución de yodo/KI disolviendo primero 2,6 g de KI en 10 ml de agua. En una campana extractora, pese 0,26 g de yodo y agréguelo a la solución de KI.
   PRECAUCIÓN: El yodo es dañino cuando está en contacto con la piel o si se inhala. Mezclar para disolver el yodo y almacenar a 4 °C, protegido de la luz. Prepare también un tampón PIPES de 125 mM, pH 6.8 (ver Tabla 3).
2. Al comenzar los experimentos, haga un material de trabajo de reactivo de yodo acidificado.
   1. Tome 45,7 ml de agua en un tubo de 50 ml y añadir 150 μL de solución de yodo/KI seguido de 150 μL de HCl 1 M.
   2. Mezclar bien y conservar a 4 °C, protegido de la luz. La solución es estable durante al menos 3 días en estas condiciones.
3. El día del experimento, haga una solución fresca de 10 mg / ml de amilosa.
   1. Pesar 50 mg de amilosa y transferir a un tubo de 15 ml.
   2. Añadir 200 μL de etanol absoluto y agitar suavemente.
   3. Añadir 500 μL de 2 M KOH y agitar suavemente.
      PRECAUCIÓN: KOH causa quemaduras graves en la piel y daño ocular. Use el equipo de protección personal adecuado.
   4. Agregue 0.5 ml de agua mientras agita suavemente. Si la amilosa no se disuelve completamente, agregue 0,5 ml adicionales de agua.
   5. Ajuste el pH a ~6.5 a 7.0 con 1 M HCl.
      PRECAUCIÓN: HCl puede causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Use el equipo de protección personal adecuado.
   6. Agregue agua para alcanzar un volumen final de 5 mL.
   7. Esterilizar por paso a través de un filtro final de jeringa de 0,2 μm y almacenar a temperatura ambiente. No enfríe ni congele.
4. Precalentar un baño maría a 30 °C.
5. Prepare doce tubos de 1,5 ml, cada uno con 1 ml de reactivo de yodo acidificado. Dejar a un lado en el banco. Estos se utilizarán para detener la reacción enzimática de ramificación.
6. Prepare cuatro tubos de 1,5 ml cada uno con 150 μL de amilosa, 150 μL de tampón PIPES y 45 μL de agua. Estos tubos se utilizarán para realizar el ensayo de la enzima de ramificación. Etiquete dos de los tubos Reacción y los otros dos tubos Control.
7. A intervalos cronometrados, agregue 5 μL de muestra de enzima ramificada a los tubos de reacción y 5 μL de tampón que se utilizó para preparar la muestra de enzima ramificada a los tubos de control. Incubar a 30 °C.
8. En momentos de tiempo definidos (p. ej., incubación de 5, 10 y 15 minutos), retire 10 μL de cada tubo de reacción y control y agréguelos a los tubos de 1,5 ml que contienen 1 ml de reactivo de yodo acidificado. Añadir 140 μL adicionales de agua y mezclar bien. Traslado a cubetas desechables.
   NOTA: Las muestras deben ser de color azul y la solución debe estar libre de cualquier precipitado. El color formado es estable durante al menos 2 h a temperatura ambiente.
9. Prepare una muestra que contenga 1 ml de reactivo de yodo acidificado y 150 μL de agua. Mezclar bien y transferir a una cubeta. Utilice esta cubeta para establecer el cero en el espectrofotómetro a 660 nm.
10. Lea la absorbancia de cada una de las doce muestras a 660 nm. Determinar la velocidad de la reacción de la enzima de ramificación restando la absorbancia obtenida en presencia de la enzima de ramificación (reacción) de la absorbancia cuando no hay ninguna enzima de ramificación presente (Control) en cada punto de tiempo. Consulte los resultados representativos para obtener más información.

5. Evaluación cualitativa de la ramificación del glucógeno

1. Prepare una solución saturada de cloruro de calcio agregando 74.5 g de cloruro de calcio anhidro a ~ 40 ml de agua y agitando. Agregue un poco más de agua y continúe removiendo. Haga el volumen hasta 100 ml con agua y continúe agitando hasta que el CaCl₂ se disuelva por completo.
2. Preparar una masa funcional de yodo/CaCl 2 reactivo colorante mezclando 50 μL de solución madre de KI/yodo (ver paso 4.1, arriba) con 13 ml de solución saturada de CaCl₂ en un tubo de 15 ml. Mezclar bien y conservar a 4 °C, protegido de la luz. La solución es estable durante al menos 1 semana en estas condiciones.
3. Determinación de la ramificación
   1. En un tubo de 1,5 ml, combine 650 μL de reactivo de color yodo/CaCl₂ con 100 μL de agua y mezcle bien. Transfiera la solución a una cubeta desechable de metacrilato.
      NOTA: La solución en la cubeta debe ser transparente y de color amarillo pálido.
   2. Colóquelo en el espectrofotómetro y, funcionando en modo de escaneo de longitud de onda, recopile un espectro de fondo de 330 nm a 800 nm.
   3. En un tubo de 1,5 ml, combine 650 μL de yodo funcional/reactivo de color CaCl₂ con 50 μg de glucógeno de ostra. Llevar el volumen final a 750 μL con agua y mezclar bien. Transfiera la solución a una cubeta desechable de metacrilato.
      NOTA: La solución en la cubeta debe ser transparente y de un color naranja / marrón intenso.
   4. Coloque en el espectrofotómetro y recoja un espectro de absorción de 330 nm a 800 nm.
   5. Repita los pasos 4.4.3 a 4.4.4 con 50 μg de amilopectina y 30 μg de amilosa.
      NOTA: La muestra de amilopectina debe ser amarilla/verde y la muestra de amilosa debe ser verde/azul. Ambas muestras deben ser claras. Los complejos coloreados formados son estables, sin cambios en el espectro de absorción, durante al menos 1 h a temperatura ambiente.
   6. Para obtener una indicación de la estructura ramificada de una muestra de glucógeno no caracterizada, combine de 25 μg a 50 μg de glucógeno con 650 μL de yodo de trabajo/reactivo de color CaCl₂ . Proceda como se indicó anteriormente, llevando el volumen a 750 μL con agua, mezclando bien y transfiriendo a una cubeta de metacrilato.
      NOTA: La muestra de glucógeno debe producir un color amarillo/naranja a naranja/marrón dependiendo del grado de ramificación (longitud de las cadenas externas) del glucógeno presente. Una vez más, la muestra debe ser clara. Consulte los resultados representativos para obtener más información.
   7. Recoge el espectro de absorción.

Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa
La Figura 1 muestra resultados representativos de ensayos de glucógeno sintasa utilizando enzimas purificadas. En el panel A, después de un ligero retraso, hubo una disminución lineal en la absorción a 340 nm con el tiempo durante un período de alrededor de 12 minutos. La tasa de cambio en la absorción en la Figura 1A fue ~0.12 unidades de absorbancia/min. Una tasa de cambio en la absorbancia entre ~0.010 y ~0.20 unidades de absorbancia/min es óptima y la cantidad de glucógeno sintasa añadida debe ajustarse a tasas de rendimiento dentro de este rango. En el panel B, se muestra el resultado de agregar demasiada glucógeno sintasa al ensayo. Aquí, la reacción se completó en los primeros 2 minutos. La reacción de control, que en estos casos no contenía glucógeno sintasa, no mostró una disminución mensurable en la absorbancia a lo largo del tiempo. Como se explica en la discusión, el uso de homogeneizados tisulares en este ensayo es perfectamente factible, aunque se requieren reacciones de control adicionales.

El protocolo descrito aquí utiliza glucógeno de ostra como sustrato, que funciona bien con glucógeno sintasas de muchas especies diferentes. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las glucógeno sintasas pueden mostrar una actividad bastante variable dependiendo del tipo de glucógeno empleado. Por lo tanto, es aconsejable examinar una variedad de formas de glucógeno antes de comenzar cualquier estudio detallado.

El protocolo dado incluye glucosa-6-phoposphato en la mezcla de reacción, ya que muchas glucógeno sintasas son activadas alostéricamente por este compuesto 9,23,24,25,26. La realización de ensayos en presencia y ausencia de glucosa-6-fosfato (que compone el volumen de reacción con agua), permite calcular la relación -/+ actividad glucosa-6-fosfato, que es una indicación útil del estado de fosforilación de las sintasas de glucógeno fúngico en mamíferos y hongos 1,27.

La determinación de la actividad de la glucógeno sintasa a partir del cambio en la absorbancia es bastante sencilla. El coeficiente de extinción de NADH se toma como 6220 M-1 cm-1, lo que permite calcular la tasa de cambio en la concentración de NADH a partir de la tasa de cambio de absorbancia de la siguiente manera:

Una tasa de cambio en la absorción de 0,12 unidades/min corresponde a 0,12/6220 = 1,93 x 10-5 mol/L/min cambio en la concentración de NADH. El volumen en la cubeta fue de 0,8 ml, lo que significa que el cambio en la cantidad de NADH fue: 1,93 x 10-5 x 0,8 x 10-3 = 3,46 x 10-8 mol/min. El volumen de enzima añadida fue de 60 μL, 3,46 x 10-8 x (1000/60) = 5,76 x 10-7 moles de enzima NADH consumida/min/ml.

Dado que existe una relación uno a uno entre el NADH consumido y la glucosa incorporada en el glucógeno, la velocidad de reacción se puede expresar como 5.76 x 10-7 mol de glucosa incorporada / min / ml.

Cuando se conoce el contenido proteico de la muestra enzimática, la actividad enzimática específica puede expresarse como μmol glucosa incorporada/min/mg proteína o nmol glucosa incorporada/min/mg proteína, según proceda.

Como se mencionó en la Introducción, el protocolo se adapta fácilmente para medir la actividad de las glucógeno sintasas que utilizan ADP-glucosa como donante de glucosa. Esto se logra mediante la simple sustitución de UDP-glucosa con ADP-glucosa en la mezcla de reacción. Además, tanto la quinasa NDP como el ATP se omiten de la mezcla de reacción, ya que el ADP que se libera durante la acción de la glucógeno sintasa es un sustrato directo para la piruvato quinasa.

Figura 1: Resultados representativos de ensayos de actividad de glucógeno sintasa. El espectrofotómetro se configuró para tomar una lectura por minuto durante un tiempo total de 20 minutos. El Panel A muestra la fase de retraso corto esperada seguida de una disminución lineal en la absorbancia con el tiempo (Experimental). No hubo disminución en la absorción observada en la reacción de control. La velocidad de reacción se calcula a partir de la pendiente del cambio de absorbancia en la fase lineal (de 5 a 16 min). El panel B muestra el resultado de agregar demasiada enzima. Aquí, el NADH se agota en 2 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa
La Figura 2 muestra datos representativos de un ensayo de glucógeno fosforilasa utilizando enzima purificada. Con la preparación utilizada aquí, el ensayo fue lineal durante aproximadamente 3 min. El recuadro muestra una línea de regresión dibujada a través de los puntos desde el tiempo 0 hasta 2,5 min. La pendiente de esta línea muestra que la tasa de cambio de absorbancia es de 0,022 unidades de absorbancia/min. Una tasa de aumento de la absorbancia de alrededor de 0,01 a 0,04 es óptima, ya que el ensayo se desviará de la linealidad con bastante rapidez si hay demasiada enzima presente. La tasa de formación de NADPH se calcula a partir del coeficiente de extinción que, como el de NADH, es 6220 M-1 cm-1. Por cada mol de NADPH formado, se había producido un mol de glucosa-1-fosfato por la acción de la glucógeno fosforilasa. Por lo tanto, la actividad enzimática puede expresarse como la cantidad de glucosa-1-fosfato liberada del glucógeno por unidad de tiempo, siguiendo un cálculo similar al descrito anteriormente.

Las condiciones de reacción son fácilmente adaptables para aquellas fosforilasas que son sensibles a la modulación alostérica. Los efectores necesarios simplemente se incluyen en la mezcla maestra de reacción, reemplazando parte del agua. Una advertencia importante es que se debe demostrar que el efector en sí no influye en la actividad de las enzimas de acoplamiento, fosfoglucomutasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

Por último, al igual que con la glucógeno sintasa descrita anteriormente, el tipo de glucógeno utilizado como sustrato puede afectar la velocidad de la reacción. Si bien el glucógeno de ostra funciona bien con fosforilasas de muchas especies, puede que no siempre sea la opción óptima.

Figura 2: Resultados representativos de ensayos de actividad de glucógeno fosforilasa. El espectrofotómetro se configuró para tomar una lectura cada 30 s durante un tiempo total de 10 minutos. Hubo un aumento constante en la absorbancia registrada en presencia de glucógeno fosforilasa (Experimental), mientras que la reacción sin fosforilasa añadida se mantuvo en el inicio (Control). El recuadro muestra una ampliación del período de reacción inicial, lo que demuestra la linealidad de la formación del producto con respecto al tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Determinación de la actividad enzimática desramificante del glucógeno
Los datos mostrados en la Figura 3 son representativos de un ensayo de enzima desramificante de glucógeno utilizando enzima desramificante purificada. En cada punto de tiempo, el cambio en la absorción que ocurrió en ausencia de la enzima ramificada agregada (Control) se restó del cambio en la absorción que ocurrió en presencia de la enzima ramificada (Reacción). A continuación, se trazaron los valores de absorbancia resultantes. Como se mencionó anteriormente, una tasa de cambio de la concentración de NADPH se calcula a partir de la pendiente inicial de la curva mediante análisis de regresión. En este ejemplo, el aumento de NADPH por unidad de tiempo fue lineal durante 10 min, con una pendiente de 0,0079 unidades de absorbancia/min. Si bien estos datos son perfectamente utilizables, la adición de un poco menos de enzima habría dado una pendiente menos profunda y habría permitido una fase lineal más larga. Alternativamente, se podrían tomar lecturas adicionales eliminando las alícuotas para la medición a 2 min y 7 min de incubación. La determinación de la actividad enzimática desramificante es muy sencilla, ya que se forma 1 mol de NADPH por cada mol de glucosa liberada por la actividad α1,6-glucosidasa de la enzima desramificante. Por lo tanto, la velocidad de reacción se puede expresar como la cantidad de glucosa liberada de la dextrina límite de fosforilasa por unidad de tiempo, siguiendo el mismo tipo de cálculo que se utilizó para los ensayos de glucógeno sintasa y fosforilasas, anteriormente.

Figura 3: Resultados representativos de ensayos de actividad enzimática desramificante de glucógeno. Las muestras de dextrina límite de fosforilasa se trataron con enzima desramificante durante 5, 10, 20 o 40 min. El aumento de la absorbancia a 340 nm, producido cuando el NADP se redujo a NADPH en un ensayo enzimático acoplado, se midió en muestras tomadas en cada uno de estos puntos temporales. La reacción mostró una fase lineal, que persistió durante al menos 10 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Determinación de la actividad enzimática de ramificación del glucógeno
La Figura 4 muestra datos de ensayos de enzimas de ramificación de glucógeno. En cada uno de los puntos de tiempo indicados, se midió la absorbancia de las muestras de Control y Reacción. La absorbancia de la muestra de reacción a 660 nm se restó de la de la muestra de control correspondiente, y la diferencia de absorbancia se trazó contra el tiempo. Luego se dibujó una línea de regresión a través de los puntos (panel A). La velocidad de reacción se puede expresar simplemente como el cambio en la absorbancia a 660 nm por unidad de tiempo. El cambio máximo en la absorbancia que puede ocurrir en este ensayo es de solo ~ 0.4 unidades de absorbancia, lo que representa la ramificación máxima de la amilosa agregada por la enzima de ramificación (panel B). Además, cuando la absorbancia de los tubos de reacción cae más de ~0,2 unidades de absorbancia por debajo de la del Control, el ensayo ya no está dentro del rango lineal y no se puede hacer una estimación de la velocidad de reacción (panel B).

La amilosa utilizada como sustrato en este procedimiento comenzará a salir de la solución con bastante facilidad si se enfría o congela y luego se descongela. Por lo tanto, es importante hacer que la solución de sustrato de amilosa sea fresca y asegurarse de que no se haya formado precipitado antes de su uso.

Figura 4: Resultados representativos de ensayos de actividad enzimática de ramificación del glucógeno. Las muestras de amilosa se trataron con enzima ramificada. Las alícuotas se eliminaron en los puntos temporales indicados y se añadieron a un reactivo de yodo acidificado. La absorbancia del complejo amilosa/yodo formado se midió a 660 nm. Los datos mostrados representan la diferencia en la absorbancia entre las incubaciones de control que carecían de enzima ramificada y las reacciones que contenían enzima ramificada. El panel A muestra una disminución en la absorbancia a 660 nm debido a la actividad enzimática de desramificación, que fue lineal durante ~ 20 min. El panel B ilustra el rango dinámico estrecho del ensayo, donde el cambio máximo en la absorbancia que se puede producir es ~ 0.4 unidades de absorbancia y la linealidad se pierde cuando el cambio en la absorción es ~ 0.2 unidades de absorbancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Evaluación cualitativa del grado de ramificación del glucógeno
La amilosa, amilopectina, dextrina límite fosforilasa, glucógeno aislado de levadura se combinaron con solución de yodo/cloruro de calcio saturado y se recogieron los espectros de absorción de los complejos resultantes (Figura 5). Utilizando las masas de glucógeno, amilopectina y amilosa dadas en el protocolo descrito anteriormente, la lectura de absorbancia máxima obtenida debe ser de alrededor de 0,7 a 0,8, como se muestra aquí (paneles A y B). Los máximos de absorbancia para amilosa y amilopectina son alrededor de 660 nm y 500 nm, y 385 nm respectivamente. Aquí se incluyó la dextrina límite de fosforilasa, ya que la recolección del espectro de absorbancia de los complejos dextrina/yodo límite fosforilasa proporciona una comprobación rápida del grado de digestión de la fosforilasa logrado durante la preparación de este sustrato enzimático desramificador. El glucógeno de la mayoría de las fuentes produce dos picos, uno a aproximadamente 400 nm y un segundo pico a 460 nm (Figura 5B). Los desplazamientos hacia la izquierda en los espectros de absorbancia del glucógeno indican un aumento de la ramificación/disminución de la longitud de la cadena externa. Por el contrario, los desplazamientos hacia la derecha indican una disminución de la ramificación / aumento de la longitud de la cadena exterior.

La solución saturada de cloruro de calcio es densa y las muestras de glucógeno agregadas formarán una capa en la parte superior cuando se agreguen. Por lo tanto, se necesita una mezcla cuidadosa para obtener una solución homogénea. Además, si las muestras de carbohidratos utilizadas no se disuelven completamente antes de mezclarse con la solución de cloruro de calcio, se formarán agregados de tinción oscura en la cubeta. Estos agregados obviamente impedirán la recolección de un espectro de absorción y es importante asegurarse de que la solución en la cubeta sea clara antes de proceder con cualquier medición.

Figura 5: Resultados representativos de la evaluación cualitativa de la ramificación del glucógeno. Las muestras de dextrina límite de fosforilasa purificada, amilopectina, amilosa (Panel A) o glucógeno (Panel B) se combinaron con solución de yodo / cloruro de calcio saturado y los espectros de absorción de los complejos resultantes se midieron de 330 nm a 800 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

No hay conflictos de intereses conocidos asociados con este trabajo y no ha habido apoyo financiero para este trabajo que podría haber influido en su resultado.