Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota

Resumen

Se presentan técnicas para medir la actividad de enzimas clave del metabolismo del glucógeno, utilizando un espectrofotómetro simple que opera en el rango visible.

Resumen

El glucógeno se sintetiza como una forma de almacenamiento de glucosa por una amplia gama de organismos, que van desde bacterias hasta animales. La molécula comprende cadenas lineales de residuos de glucosa ligados a α1,4 con ramas introducidas mediante la adición de enlaces α1,6. Comprender cómo se regulan la síntesis y la degradación del glucógeno y cómo el glucógeno alcanza su estructura ramificada característica requiere el estudio de las enzimas de almacenamiento de glucógeno. Sin embargo, los métodos más comúnmente utilizados para estudiar estas actividades enzimáticas suelen emplear reactivos o técnicas que no están disponibles para todos los investigadores. Aquí, discutimos una batería de procedimientos que son técnicamente simples, rentables y, sin embargo, capaces de proporcionar información valiosa sobre el control del almacenamiento de glucógeno. Las técnicas requieren acceso a un espectrofotómetro, que opera en el rango de 330 a 800 nm, y se describen asumiendo que los usuarios emplearán cubetas de plástico desechables. Sin embargo, los procedimientos son fácilmente escalables y pueden modificarse para su uso en un lector de microplacas, lo que permite un análisis altamente paralelo.

Introducción

El glucógeno está ampliamente distribuido en la naturaleza, y el compuesto se encuentra en bacterias, muchos protistas, hongos y animales. En los microorganismos, el glucógeno es importante para la supervivencia celular cuando los nutrientes son limitantes y, en organismos superiores como los mamíferos, la síntesis y degradación del glucógeno sirven para amortiguar los niveles de glucosa en sangre ^1,2,3. El estudio del metabolismo del glucógeno es, por lo tanto, de importancia para campos tan diversos como la microbiología y la fisiología de los mamíferos. Comprender el metab....

Protocolo

1. Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa

1. Preparar soluciones madre de los reactivos necesarios como se indica en la Tabla 1 (antes del día experimental).

Componente	Indicaciones
50 mM Tris pH 8.0	Disuelva 0,61 g de base de Tris en ~ 80 ml de agua.  Enfriar a 4 °C.   Ajuste el pH a 8.0 con HCl y haga que el volumen sea de hasta 100 mL con agua.
Búfer HEPES de 20 mM	Disol....

Resultados

Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa
La Figura 1 muestra resultados representativos de ensayos de glucógeno sintasa utilizando enzimas purificadas. En el panel A, después de un ligero retraso, hubo una disminución lineal en la absorción a 340 nm con el tiempo durante un período de alrededor de 12 minutos. La tasa de cambio en la absorción en la Figura 1A fue ~0.12 unidades de absorbancia/min. Una tasa de cambio en la absorban.......

Discusión

En general, las ventajas clave de todos los métodos presentados son su bajo costo, facilidad, velocidad y falta de dependencia de equipos especializados. La principal desventaja que todos comparten es la sensibilidad en comparación con otros métodos disponibles. La sensibilidad de los procedimientos que implican la producción o el consumo de NADH/NADPH es fácil de estimar. Dado que el coeficiente de extinción de NADH/NADPH es 6.22 M-1 ^cm-1 , la aritmética simple indica que ~ ^10-20 μM cambios en la c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Amilopectina (libre de amilosa) de maíz ceroso	Fisher Scientific	A0456
Amilosa	Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, sal disódica	MilliporeSigma	A3377
D-Glucosa-1,6-bisfosfato, sal de potasio	MilliporeSigma	G6893
D-glucosa-6-fosfato, sal sódica	MilliporeSigma	G7879
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, Grado I, de levadura	MilliporeSigma	10127655001
Glucógeno, Tipo II de ostra	MilliporeSigma	G8751
Hexoquinasa	MilliporeSigma	11426362001
Cubetas de metacrilato, 1,5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Se requiere metacrilato ya que algunos procedimientos son conducido a 340 nm o menos
β-Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato sodio	sal MilliporeSigma	N0505
β-nicotinamida adenina dinucleótido, sal disódica reducida	MilliporeSigma	43420
Nucleósido 5'-difosfato quinasa	MilliporeSigma	N0379
Fosfoenolpiruvato, sal	monopotásicaMilliporeSigma	P7127
Fosfoglucomutasa del músculo de conejo	MilliporeSigma	P3397
Fosforilasa A del músculo de conejo	MilliporeSigma	P1261
Piruvato quinasa/enzimas lácticas deshidrogenasas del músculo de conejo	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucosa, sal disódica	MilliporeSigma	U4625