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Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

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DOI:

10.3791/63049

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8 de octubre de 2021

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1Department of Zoology and Physiology, University of Wyoming, 2School of Electrical Engineering & Computer Science, University of North Dakota, 3Department of Mathematics and Statistics, University of Wyoming

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Resumen

El miniscopio de imágenes de calcio in vivo es una técnica poderosa para estudiar la dinámica neuronal y los microcircuitos en ratones que se comportan libremente. Este protocolo describe la realización de cirugías cerebrales para lograr buenas imágenes de calcio in vivo utilizando un miniscopio.

Resumen

Un microscopio de fluorescencia en miniatura (miniscopio) es una herramienta potente para obtener imágenes de calcio in vivo de animales que se comportan libremente. Ofrece varias ventajas sobre los sistemas convencionales de imágenes de calcio multifotón: (1) compacto; (2) ligero; (3) asequible; y (4) permite la grabación de animales que se comportan libremente. Este protocolo describe las cirugías cerebrales para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo utilizando un sistema de grabación de miniscopio desarrollado a medida. El procedimiento de preparación consta de tres pasos, que incluyen (1) inyectar estereotáxicamente el virus en la región cerebral deseada del cerebro de un ratón para etiquetar un subgrupo específico de neuronas con un sensor de calcio codificado genéticamente; (2) implantación de lente de índice de gradiente (GRIN) que puede transmitir imágenes de calcio desde la región profunda del cerebro al sistema de miniscopio; y (3) colocar el soporte del miniscopio sobre el cráneo del ratón donde el miniscopio se puede unir más tarde. Para realizar imágenes de calcio in vivo , el miniscopio se sujeta al soporte y se recopilan imágenes de calcio neuronal junto con registros de comportamiento simultáneos. El protocolo de cirugía actual es compatible con cualquier sistema comercial o personalizado de imágenes de un solo fotón y dos fotones para imágenes de calcio in vivo del cerebro profundo.

Introducción

La señalización intracelular de Ca2+ es un regulador esencial del crecimiento celular, proliferación, diferenciación, migración, transcripción de genes, secreción y apoptosis1. En las neuronas, la señalización de Ca2+ se controla con precisión ya que su patrón espacio-temporal está relacionado con funciones cruciales como la excitabilidad de la membrana, la liberación de neurotransmisores y la plasticidad sináptica2.

Las imágenes de calcio in vivo son una técnica poderosa que se puede utilizar para decodificar la representación del circuito neuronal elemental a los comportamientos normales de los animales, identificar actividades neuronales aberrantes en modelos animales de trastornos cerebrales y desentrañar posibles objetivos terapéuticos que pueden normalizar estos circuitos alterados. Los dos sistemas comunes de imágenes de calcio in vivo son la microscopía de fluorescencia de barrido láser de dos fotones 3,4,5,6 y la microendoscopía miniaturizada montada en la cabeza (miniscopio)7,8,9,10,11,12,13 . La microscopía convencional de dos fotones ofrece ventajas imponentes como una mejor resolución, menor ruido y menor fotoblanqueo; sin embargo, se requiere que los animales de experimentación estén fijos en la cabeza, limitando los estudios de comportamiento que se pueden realizar 3,4,5,6. Por el contrario, el sistema de miniscopio montado en la cabeza es pequeño y portátil, lo que permite estudiar una amplia variedad de pruebas de comportamiento utilizando animales que se comportan libremente 7,8,9,10,11,12,13.

Existen dos indicadores principales de Ca2+, los indicadores químicos 5,14 y los indicadores de calcio codificado genéticamente (GECI)15,16. Las imágenes de Ca2+ se han facilitado mediante el uso de GECI altamente sensibles administrados con vectores virales que permiten el etiquetado específico de las neuronas en el circuito objetivo. El esfuerzo continuo para mejorar la sensibilidad, la longevidad y la capacidad de etiquetar incluso los compartimentos subcelulares, hace que los GECI sean ideales para varios estudios de imágenes de calcio in vivo 17,18,19.

La dispersión de la luz en el tejido cerebral durante las imágenes limita la penetración óptica en profundidad, incluso con la microscopía de dos fotones. Sin embargo, la lente de índice de gradiente (GRIN) supera este problema, ya que la lente GRIN se puede incrustar directamente en los tejidos biológicos y transmitir imágenes desde la región profunda del cerebro hasta el objetivo del microscopio. A diferencia de la lente convencional hecha de material ópticamente homogéneo y requiere una superficie de forma complicada para enfocar y crear imágenes, el rendimiento de la lente GRIN se basa en un cambio gradual del índice de refracción dentro del material de la lente que logra el enfoque con una superficie plana20. La lente GRIN se puede fabricar hasta 0,2 mm de diámetro. Por lo tanto, una lente GRIN miniaturizada se puede implantar en el cerebro profundo sin causar demasiado daño.

En este artículo, se presenta un protocolo completo de cirugía para el cerebro profundo in vivo por imágenes de calcio. Para el propósito de demostración, describimos cirugías cerebrales dirigidas específicamente a la corteza prefrontal medial (mPFC) del cerebro del ratón y el registro de imágenes de calcio in vivo a través de un sistema de miniscopio personalizado desarrollado por el grupo del Dr. Lin en el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (NIDA / IRP)7,12. El procedimiento experimental implica dos cirugías cerebrales principales. La primera cirugía consiste en inyectar estereotáxicamente un vector viral que expresa GCaMP6f (un GECI) en el mPFC. La segunda cirugía es implantar la lente GRIN en la misma región del cerebro. Después de la recuperación de estas cirugías cerebrales, el procedimiento posterior es colocar el soporte del miniscopio (base) en el cráneo del ratón con cemento dental. In vivo Lasimágenes Ca 2+ se pueden realizar en cualquier momento después de montar el miniscopio en su base. El protocolo de cirugía para la inyección viral y la implantación de lentes GRIN es compatible con cualquier sistema comercial o personalizado de imágenes de un solo fotón y dos fotones para el cerebro profundo imágenes de calcio in vivo.

Protocolo

El protocolo experimental sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Wyoming. El ratón utilizado en este estudio es un macho de 6 meses de edad C57BL/6J. El procedimiento se puede utilizar para dirigirse a cualquier región profunda del cerebro para imágenes de calcio in vivo . Aquí, para la demostración, el área cerebral objetivo es el mPFC del ratón (anterior y posterior (A / P): 1.94 mm, medial y lateral (M / L): 0.5 mm, dorsal y ventral (D / V): 1.8 mm). Este protocolo se modifica en función del protocolo21 publicado anteriormente.

1. Inyección estereotáxica del virus en el mPFC (Figura 1)

  1. Preparación para la cirugía
    1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con un autoclave y colocarlos sobre una superficie estéril.
    2. Prepare una jeringa de 10 μL cebiéndola con solución salina y prellenándola con 5 μL de solución salina. Conecte la jeringa a una microbomba (consulte la Tabla de materiales).
    3. Encienda la almohadilla térmica y mantenga la temperatura a 35 °C.
  2. Coloque el ratón en la cámara de inducción (5" x 10" x 4", largo x ancho x alto) con 5% de isoflurano y 1 L/min de caudal de oxígeno. Observe y cuente cuidadosamente la frecuencia respiratoria del ratón. Saque el ratón una vez que su frecuencia respiratoria disminuya a 1 respiración/s.
    NOTA: La frecuencia respiratoria del ratón se puede controlar fácilmente observando el movimiento hacia abajo y hacia arriba del músculo de la espalda durante cada inhalación.
  3. Permita que el ratón se asiente en un área de sobremesa separada del área quirúrgica. Con un cortapelos de afeitar, afeite el pelo desde la cabeza del ratón hasta las primeras vértebras cervicales.
  4. Coloque el ratón en el escenario estereotáxico (consulte la Tabla de materiales) y asegure su posición con barras para los oídos y clip para la nariz. Mantener el flujo de isoflurano a la etapa estereotáxica al 1,5% de isoflurano y 0,5 L/min de caudal de oxígeno.
  5. Aplique el ungüento oftálmico lubricante en ambos ojos con un hisopo de algodón limpio para evitar la sequedad de los ojos durante la cirugía. Evalúe los reflejos del pedal en el ratón para confirmar que el ratón está completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía.
  6. Desinfecte el área sin pelo con una solución de povidona yodada al 7,5% (ver Tabla de materiales) y etanol al 70% tres veces cada uno con hisopos de algodón estériles.
  7. Inyecte un pequeño volumen (50 μL) de lidocaína al 2% debajo de la piel del área sin pelo.
  8. Haga una incisión de 2 cm a través de la piel a lo largo de la línea media con un bisturí para exponer la lambda y el bregma del cráneo.
  9. Retire la fascia del cráneo con la ayuda de hisopos de algodón seco y fórceps puntiagudos.
  10. Después de que el bregma y la lambda sean visibles, use la punta de una rebaba de taladro dental (0,5 mm de diámetro) para medir las coordenadas Z de bregma y lambda (consulte la Tabla de materiales). Ajuste la altura del soporte de la nariz hasta que el bregma y la lambda se encuentren en la misma posición Z.
  11. Ubique la rebaba de taladro dental de 0,5 mm en una posición de A/P: 1,94 mm, M/L: 0,5 mm desde el bregma. Perfora el cráneo.
    NOTA: Aquí, para demostración, la región cerebral objetivo es el mPFC del ratón. Este protocolo se puede utilizar para apuntar a cualquier otra región profunda del cerebro. Por ejemplo, si el área cerebral objetivo es el Núcleo Accumbens (NAc), la posición correspondiente debe ser A/P: 0,9 mm, M/L: 1,2 mm.
  12. Retire la duramadre con una punta de aguja de 30 G y limpie todos los pedazos de restos óseos con pinzas afiladas en ángulo de 45 °.
    NOTA: El sangrado es común ya que los vasos sanguíneos pequeños pueden romperse durante la etapa de limpieza. Use hisopos de algodón estériles para detener el sangrado y aplique solución salina para lavar el área. Aplique solución salina en el área expuesta del cráneo para mantenerla húmeda.
  13. Cargue el virus en la jeringa de microlitro utilizando el panel de control de la microbomba. Retire 500 nL de burbuja de aire seguido de 800 nL del virus a un caudal de 50 nL/s.
    NOTA: Para fines de demostración, aquí, se inyecta un serotipo 1 de virus adenoasociado (AAV1) que expresa GCaMP6f (un GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, en el mPFC (consulte la Tabla de materiales). El título del virus es de 2,8 x 1013 GC/mL. Se diluye 1:2 en solución salina antes de la inyección.
  14. Coloque la punta de la aguja en la parte superior del bregma para tocar el bregma y anote la coordenada Z del bregma. Mueva la aguja por encima del orificio perforado e inyecte 100 nL del virus para asegurarse de que la aguja no esté obstruida.
  15. Desplácese lentamente por la aguja hacia el tejido cerebral hasta la coordenada Z objetivo de D / V: 1.75 mm y luego muévala ligeramente hasta la coordenada Z de D / V: 1.65 mm.
    NOTA: Esto es para crear un pequeño bolsillo para que la solución viral se infunda. Si la región cerebral objetivo es el NAc, la coordenada Z objetivo correspondiente de D / V debe ser de 4,2 mm, y luego moverse ligeramente hasta 4,1 mm.
  16. Utilice el panel de control para configurar la microbomba para inyectar 500 nL del virus a un caudal de 50 nL/min. Presione el botón EJECUTAR en el panel de control para inyectar el virus.
    NOTA: La inyección tardará unos 10 minutos. Después de que termine la inyección, espere 5-10 minutos adicionales antes de sacar la aguja del cerebro. Aplique con frecuencia solución salina para mantener húmeda el área expuesta del cráneo durante el período de inyección.
  17. Mueva la aguja hacia arriba y fuera del cerebro. Inyecte 500 nL de volumen dos veces al caudal de 50 nL/s.
    NOTA: Este paso confirma que se ha administrado un volumen adecuado del virus en el cerebro. Durante las primeras inyecciones de 500 nL, se libera el virus, seguido de burbujas de aire. Durante la segunda inyección de 500 nL, primero aparecen burbujas de aire, seguidas de solución salina. La jeringa ahora está lista para cargar el virus para el próximo ratón. Una vez que se realiza la cirugía, la jeringa y la aguja del microlitro se limpian a fondo con acetona seguida de solución salina.
  18. Alinee los bordes de la piel y cierre cuidadosamente la incisión con una sutura (tamaño 4.0). Aplique ungüento antibiótico en el área cosida para prevenir la infección.
  19. Retire el ratón de la etapa estereotáxica y devuélvalo a su jaula de origen. Coloque la jaula casera en una incubadora de 33 °C hasta que el ratón sea ambulatorio.
    NOTA: Por lo general, un ratón tarda de 10 a 15 minutos en despertarse de la anestesia con isoflurano antes de que comience a moverse.
  20. Después de que el ratón comience a moverse, administre medicamentos antiinflamatorios no esteroideos durante 3 días postquirúrgicos (ver Tabla de materiales). Deje que el ratón se recupere de la cirugía durante 14 días antes de buscar la implantación de la lente GRIN.

2. Implantación de lente GRIN en el mPFC (Figura 1)

  1. Preparación para la cirugía
    1. Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contiene 124 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 1,2 mM de MgCl2, 25 mM de glucosa, 26 mM de NaHCO3 y 2,4 mM de CaCl2.
    2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con un autoclave y colocarlos sobre una superficie estéril.
    3. Encienda la almohadilla térmica y mantenga la temperatura a 35 °C.
    4. Derretir el 1% de agarosa y mantenerla en un baño de agua a 42 °C hasta su uso.
      NOTA: La agarosa derretida se puede mantener en el baño de agua durante un par de horas.
    5. Desinfecte una lente GRIN (1 mm de diámetro, 4,38 mm de longitud, Figura 2A) en etanol al 70% durante 15 min, transfiérala a un tubo lleno de solución salina para enjuagarla adecuadamente antes de implantarla.
      NOTA: Las lentes GRIN (ver Tabla de Materiales) se producen a través del intercambio de iones de plata y litio en vidrios especiales, lo que las hace no tóxicas y amigables con las neuronas 6,7. Sin embargo, muchas lentes GRIN disponibles comercialmente pueden lixiviar residuos tóxicos, causando neurodegeneración, lo que las hace inadecuadas para la implantación en el cerebro vivo para estudios de imágenes in vivo a largo plazo. Estas lentes GRIN pueden requerir recubrimiento con agentes biocompatibles como el parileno-C para prevenir efectos secundarios tóxicos en las neuronas vecinas22.
  2. Pesar el ratón y anestesiarlo mediante una inyección intraperitoneal de la mezcla de ketamina/xilazina (ver Tabla de Materiales) (Ketamina: 100 mg/kg; Xilazina: 15 mg/kg).
    NOTA: Un ratón que pesa 30 g requiere 300 μL de mezcla de ketamina/xilazina (ketamina 100 mg/ml y xilazina 1,5 mg/ml) para la dosis inicial y 150 μL de ketamina (10 mg/ml) para dosis adicionales durante la cirugía. Para mantener al ratón anestesiado durante todo el proceso quirúrgico, se deben administrar dosis adicionales de ketamina (50 mg / kg) al menos una vez por hora. La etapa de anestesia del ratón debe ser monitoreada con frecuencia mediante la evaluación de los reflejos del pedal.
  3. Afeitar el cabello del área quirúrgica con una afeitadora y limpiar el cabello con una toalla de papel mojada.
  4. Coloque el ratón en la etapa estereotáxica y asegure su posición apretando el clip de la nariz y las barras de la oreja. Aplique ungüento oftálmico lubricante para los ojos en ambos ojos con un hisopo de algodón estéril. Confirme que el ratón está completamente anestesiado mediante la evaluación de los reflejos del pedal.
  5. Desinfecte el área sin pelo con una solución de povidona yodada al 7,5% y etanol al 70% tres veces cada uno con hisopos de algodón estériles. Administrar 2 mg/kg de dexametasona por vía intramuscular en el muslo para reducir el riesgo de hinchazón e inflamación relacionadas con la cirugía.
  6. Inyecte 50 μL de lidocaína al 2% debajo de la piel del área de cirugía.
  7. Use una tijera fina para extirpar un área triangular de la piel de 1,5 cm (altura) x 1,0 cm (base), desde el lado anterior entre los ojos hasta el lado posterior detrás de la lambda.
  8. Retire el tejido del periostio del cráneo con fórceps finos, micro-cuchillas e hisopos de algodón.
    NOTA: El cráneo debe limpiarse y secarse a fondo antes de seguir el siguiente paso.
  9. Aplique cianoacrilato (ver Tabla de materiales) en los bordes de la piel y adhiera la piel al cráneo. Espere 5 minutos hasta que el cianoacrilato se seque.
  10. Con la ayuda de una punta de rebaba de taladro de 0,5 mm, alinee el bregma y la lambda en el mismo plano horizontal ajustando la altura del clip de la nariz.
  11. Ubique una rebaba de taladro dental (1,2 mm de diámetro) en una posición de A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm desde el bregma. Perfora el cráneo. Retire la duramadre con una punta de aguja de 30 G y limpie todos los pedazos de restos óseos con pinzas afiladas en ángulo de 45 °.
    NOTA: Estos restos óseos pueden bloquear el paso de aspiración posterior si no se eliminan por completo.
  12. Conecte una aguja de extremo romo pulida manualmente de 27 G (Figura 2B) al soporte de la aguja acoplado a un brazo robótico inclinado con un ángulo de 10° (Figura 2C). Conecte el otro extremo del soporte de la aguja al sistema de vacío de la casa.
    NOTA: El brazo robótico (ver Tabla de Materiales) es desarrollado por el grupo del Dr. Lin en el NIDA/IRP y está controlado por un software de acceso abierto desarrollado a medida, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23
  13. Ubique la punta de la aguja con solo tocar el bregma. Establezca la coordenada Z de bregma en 0 haciendo clic en el botón Bregma en AutoStereota.
  14. Establezca el valor de la entrada X en 0.8, el valor de la entrada Y en 1.94, el valor de la entrada Z en 1.0, luego haga clic en el botón Buscar para mover la aguja a la parte superior del orificio perforado en el cráneo.
  15. Ajuste la posición de la aguja al centro del área de tejido cerebral expuesta a través de AutoStereota.
    NOTA: Para mover la aguja en direcciones laterales o mediales, introduzca el valor Paso y haga clic en los botones Lateral o Medial en AutoStereota. Del mismo modo, para mover la aguja en direcciones anterior o posterior y dorsal o ventral, haga clic en los botones Rostral o Caudal y Dorsal o Ventral , respectivamente.
  16. Encienda la aspiradora y comience a enjuagar el área expuesta del cerebro con ACSF a través de un sistema de tubos controlado por gravedad (consulte la Tabla de materiales) conectado a una aguja de 30 G con una punta doblada. ACSF se burbujea continuamente con una mezcla de gases de 95% O2 y 5% de CO2 y se filtra a través de un filtro de 0,2 μm.
    NOTA: El caudal acSF es de ~ 1,5 ml/min. La presión de salida de la mezcla de gas se mantiene en ~ 3 psi.
  17. Aspirar tejido cerebral capa por capa con la ayuda del software AutoStereota (Figura 3).
    NOTA: La aspiración del tejido cerebral se completa en 4 rondas para que se genere un bolsillo de columna (1,8 mm de profundidad y 1 mm de diámetro).
    1. En la sesión "zStep", haga clic y verifique la primera y la segunda fila. Establezca los valores de la primera fila en 0,2 y 1. Establezca los valores de la segunda fila en 0,15 y 4 (Figura 3A).
    2. En la sesión "Modo", establezca Needle size 27 Gauge y 1.2, establezca Dims 0.9. Todos los demás valores utilizan valores predeterminados (Figura 3A).
    3. Haga clic secuencialmente en los botones Establecer, Mantener cero e Inicio para iniciar la aspiración.
      NOTA: Esta es la1ª ronda de aspiración. Los valores de entrada indican que la profundidad de aspiración es de 0,2 mm (desde la coordenada Z de 0) durante el primer paso con 1 capa; durante el segundo paso, la profundidad de aspiración es de 0,15 mm, repetida continuamente durante 4 capas. La resolución de aspiración es de 1,2 y el diámetro es de 0,9 mm. Durante la aspiración, la ubicación instantánea de la punta de la aguja se puede monitorear a través del panel de gráfico de seguimiento. Tras completar esta ronda de aspiración, se genera un bolsillo de columna con 0,8 mm de profundidad y 1 mm de diámetro. La punta de la aguja volverá al centro con la coordenada Z de 0.
    4. En la sesión "zStep", haga clic y verifique la primera y la segunda fila. Establezca los valores de la primera fila en 1 y 1. Establezca los valores de la segunda fila en 0,15 y 4 (Figura 3B).
    5. En la sesión "Modo", mantenga todos los valores iguales que la ronda anterior (Figura 3B).
    6. Haga clic secuencialmente en los botones Establecer, Mantener cero e Inicio para iniciar la aspiración.
      NOTA: Esta es la2ª ronda de aspiración. Los valores de entrada indican que la profundidad de aspiración es de 1 mm (a partir de la coordenada Z de 0) durante el primer paso con 1 capa; durante el segundo paso, la profundidad de aspiración es de 0,15 mm, repetida continuamente durante 4 capas. Tras completar esta ronda de aspiración, se genera el bolsillo de la columna con 1,6 mm de profundidad y 1 mm de diámetro.
    7. En la sesión "zStep", haga clic y marque solo la primera fila. Establezca los valores de la primera fila en 1.8 y 1 (Figura 3C).
    8. En la sesión "Modo", configure Needle size 27 Gauge y 2.2. Todos los demás valores siguen siendo los mismos que los de la ronda anterior (Figura 3C).
    9. Haga clic secuencialmente en los botones Establecer, Mantener cero e Inicio para iniciar la aspiración.
      NOTA: Esta es la3ª ronda de aspiración. Los valores de entrada indican que la profundidad de aspiración es de 1,8 mm (desde la coordenada Z de 0) con 1 capa. La resolución de la aspiración es 2.2. Tras completar esta ronda de aspiración, se genera el bolsillo de la columna con 1,8 mm de profundidad y 1 mm de diámetro.
    10. En la sesión "zStep", haga clic y marque solo la primera fila. Establezca los valores de la primera fila en 1,6 y 1 (Figura 3D).
    11. En la sesión "Modo", establezca Needle size 27 Gauge y 2.2, establezca Dims 0.6 (Figura 3D).
    12. Haga clic secuencialmente en los botones Establecer, Mantener cero e Inicio , para iniciar la aspiración.
      NOTA: Esta es la4ª ronda de aspiración. El propósito de este paso es limpiar la sangre acumulada en el bolsillo. El sangrado es común a medida que los vasos sanguíneos pequeños se rompen durante el proceso de aspiración. Para limpiar a fondo la sangre, detenga la irrigación de ACSF durante 5 minutos y luego vuelva a encender la irrigación. Repita la4ª ronda de aspiración varias veces hasta que el bolsillo esté libre de sangre. Este protocolo se puede utilizar para apuntar a cualquier otra región profunda del cerebro. Por ejemplo, si el área cerebral objetivo es el NAc, la coordenada Z final correspondiente de D/V debe ser de 4,4 mm.
  18. Detener el vacío y el riego de ACSF. Lleve la aguja a +2 mm de coordenada Z y 0,5 mm antes del centro. Coloque la lente GRIN estéril de 1 mm en el bolsillo.
  19. Mantenga la punta de la aguja en contacto con la lente GRIN expuesta para asegurarse de que la lente GRIN se asiente en un ángulo de 10°. Presione suavemente la superficie superior de la lente GRIN con papel de seda blanda estéril para asegurarse de que la superficie inferior de la lente GRIN esté en contacto con el tejido cerebral.
  20. Aplique la agarosa derretida en el espacio entre la lente GRIN y el tejido cerebral con la ayuda de una espátula. Después de que la agarosa forme un gel, retire el exceso de agarosa con una micro-cuchilla.
  21. Limpie el cráneo a fondo con hisopos de solución salina y algodón. Deje que el cráneo se seque antes de la posterior aplicación de cemento dental (ver Tabla de Materiales).
  22. Saque bien la mezcla del congelador de -20 °C. Mezcle el polvo de cemento dental y el líquido catalizador y aplique una capa de cemento de resina adhesiva autocurable sobre el cráneo; primero, rodea la lente GRIN y luego cubre todo el cráneo expuesto.
  23. Espere 5 minutos y deje que se endurezca por completo. Retire la aguja de aspiración con cuidado.
  24. En un pozo de plástico limpio, mezcle polvo de cemento dental, carbón negro con líquido y aplique una capa delgada de la mezcla sobre la 1ª capa de cemento dental. Espere 5 minutos para dejar que se endurezca.
  25. Proteja la lente GRIN expuesta cubriéndola con una tapa personalizada hecha de un tubo de PCR (Figura 2D). Aplique cianoacrilato para unir la tapa al cemento dental.
  26. Inyecte 1 ml de solución salina precalentada por vía subcutánea en el ratón seguido de 0,1 mg/kg de buprenorfina. Coloque el ratón de nuevo en su jaula de origen. Coloque la jaula casera en una incubadora de 33 °C y controle al ratón hasta que sea ambulatorio. Por lo general, un ratón tarda de 20 a 40 minutos en despertarse de la anestesia antes de que comience a moverse.
  27. Administre medicamentos antiinflamatorios no esteroideos y controle al ratón durante al menos 3 días postquirúrgicos. Deje que el ratón se recupere de la cirugía durante 30 días.

3. Fijación del soporte del miniscopio (base) en el cráneo del ratón (Figura 1)

  1. Anestesiar al ratón en una cámara de inducción con 5% de isoflurano y 1 L/min de flujo de oxígeno hasta que su frecuencia respiratoria disminuya a 1 respiración/s.
  2. Coloque el ratón en el escenario estereotáxico y asegure su posición con barras para los oídos y clips para la nariz. Mantener un flujo continuo de isoflurano (1,5%) y oxígeno (0,5 L/min).
  3. Aplique ungüento oftálmico en sus ojos para mantenerlos húmedos. Encienda la almohadilla térmica y mantenga la temperatura a 35 °C. Confirme que el ratón está completamente anestesiado mediante la evaluación de los reflejos del pedal.
  4. Retire la tapa que cubre la lente GRIN suavemente con fórceps puntiagudas. Perfore los residuos secos de cianoacrilato del cemento dental completamente usando un microdrill (ver Tabla de Materiales).
  5. Corta el cabello alrededor del área de cemento dental con tijeras pequeñas. Limpie los escombros con la ayuda de un plumero de aire comprimido. Use un hisopo de algodón sumergido en acetona para limpiar la superficie superior de la lente GRIN.
  6. Prepare el miniscopio con su soporte (base).
    1. Coloque una tuerca hexagonal #00-90 (ver Tabla de Materiales) en la ranura presente en la base y aplique cianoacrilato para asegurarla allí (Figura 2E).
    2. Aplique una cinta de politetrafluoroetileno (PTFE) firmemente alrededor de la rosca del miniscopio y recorte la cinta adicional (Figura 2F).
    3. Sujete el miniscopio a la base y use el tornillo de bloqueo para asegurar el miniscopio a la base (Figura 2G).
    4. Conecte el miniscopio a su cable y encienda el software de acceso abierto desarrollado a medida, Actualmente de acceso abierto, NeuView (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: El software NeuView está desarrollado a medida para imágenes de calcio in vivo de miniscopio del grupo del Dr. Lin en el NIDA / IRP 7,12. Es de acceso abierto (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
    5. En NeuView, haga clic en Hardware, marque LED1 y haga clic en el botón Transmitir para ver las imágenes en vivo (Figura 4A). Para detener la transmisión en vivo, haga clic en el botón Detener .
    6. Coloque el miniscopio en un brazo de sujeción de miniscopio personalizado (Figura 2H) cuya posición XYZ se puede manipular utilizando controladores motorizados (Figura 2I).
  7. Ubique el miniscopio justo encima de la lente GRIN expuesta y hágalo paralelo a la superficie de la lente. Baje lentamente el miniscopio hacia la lente GRIN y ajuste su posición Z hasta que se encuentre el mejor plano de enfoque.
    NOTA: El mejor plano focal se determina comparando varias posiciones Z posibles y seleccionando el plano focal con una visualización clara de la mayoría de los cuerpos celulares.
  8. Aplique la primera capa de cemento dental alrededor de la base del miniscopio con cuidado sin alterar la posición del miniscopio. Después de endurecer el cemento, retire suavemente el brazo de sujeción para que el miniscopio pueda pararse por sí solo en la cabeza del mouse.
    NOTA: El cemento dental tiende a encogerse después del endurecimiento, y arrastrará hacia abajo el miniscopio lejos del plano de enfoque original. Por lo general, la posición Z del miniscopio se eleva ligeramente por encima del plano focal original antes de aplicar cemento dental para compensar el cambio potencial.
  9. Aplique una segunda capa de cemento dental alrededor de la base para llenar todos los huecos y asegurarse de que no haya fugas de luz LED de los huecos. Deja que el cemento dental se endurezca.
  10. Retire el ratón de la etapa estereotáxica. Afloje el tornillo de bloqueo y desmonte el miniscopio de la base. Coloque una tapa protectora impresa en 3D en la base para proteger la lente GRIN expuesta y apriete el tornillo de bloqueo en la base (Figura 2J).
  11. Coloque el ratón de nuevo en su jaula de origen.
    NOTA: Por lo general, un ratón tarda de 10 a 15 minutos en despertarse de la anestesia con isoflurano antes de que comience a moverse.

4. Montaje del miniscopio e imágenes In vivo de Ca2+ (Figura 1)

  1. Monta el miniscopio en su base
    1. Anestesiar brevemente al ratón en la cámara de inducción (5% de isoflurano y 1 L/min de caudal de oxígeno). Coloque el ratón sobre una superficie de banco limpia.
    2. Afloje el tornillo de bloqueo con un destornillador pequeño, retire la tapa protectora y limpie la superficie de la lente GRIN con un hisopo de algodón empapado en acetona.
    3. Envuelva una cinta de PTFE firmemente alrededor de la rosca del miniscopio y fije el miniscopio a su base en la cabeza del mouse.
    4. Conecte el miniscopio al cable (Figura 2K), encienda el software NeuView.
    5. En NeuView, haga clic en Hardware, marque LED1 y haga clic en el botón Transmitir para ver las imágenes en vivo (Figura 4A).
    6. Identifique el mejor plano focal ajustando la posición del miniscopio en relación con la base, ya sea apretando ligeramente o aflojando con la ayuda de fórceps contundentes.
      NOTA: El mejor plano focal se determina comparando varias ubicaciones posibles y seleccionando la que tenga una visualización clara de la mayoría de los cuerpos celulares.
    7. Apriete el tornillo de bloqueo y vuelva a colocar el ratón en su jaula de casa.
    8. En NeuView, ajuste la potencia de la luz LED al nivel óptimo. Haga clic en Capturar y luego en los botones Activar para comenzar a grabar y presione Detener después de 150 cuadros.
      NOTA: La potencia más baja posible determina el nivel óptimo de potencia del LED para lograr una imagen lo suficientemente brillante. El propósito de grabar un video corto es facilitar la identificación del mismo plano focal en el futuro para imágenes repetitivas.
    9. Desconecte el cable del miniscopio. Deje que el ratón se recupere durante al menos 30 minutos antes de comenzar el experimento.
      NOTA: Para proteger el miniscopio, por lo general, la botella de agua y el alimentador de alimentos de alambre se retiran durante este corto período de tiempo. Si el ratón necesita permanecer en su jaula doméstica por más tiempo, se recomienda suministrar gel dietético disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en la jaula doméstica.
  2. Adquisición de datos para imágenes de calcio in vivo
    NOTA: Las imágenes de calcio in vivo se pueden realizar simultáneamente junto con cualquier prueba de comportamiento que el investigador desee. Para el propósito de demostración, el ejemplo aquí es la imagen in vivo de Ca2+ durante una prueba de campo abierto. Para lograr este objetivo, se requieren dos computadoras. Una computadora está equipada con software comercial (consulte la Tabla de materiales) para controlar una cámara para registrar el comportamiento del mouse automáticamente. La otra computadora está equipada con NeuView para controlar el miniscopio y grabar las imágenes ca2+ .
    1. Encienda el software de la cámara de comportamiento (consulte la Tabla de materiales) para ver el campo de comportamiento del mouse a través de una función de transmisión en vivo. Ajuste manualmente el enfoque de la cámara superior (Figura 2L).
    2. Seleccione Trigger/Strobe y marque "Enable/disable trigger" (Figura 4B). Haga clic en el botón Grabar , use Examinar para seleccionar la ubicación donde se guardarán las grabaciones de comportamiento, seleccione el formato de imagen deseado.
      NOTA: La función "Trigger Control" está habilitada para permitir que el software NeuView active la grabación del comportamiento para que los fotogramas de comportamiento y los fotogramas de imagen de calcio correspondientes se acoplen temporalmente. La grabación del comportamiento se puede guardar en cualquier formato deseado. La grabación del comportamiento generalmente se guarda en formato JPEG en la carpeta designada.
    3. Acerque el ratón a la arena y conecte el miniscopio al cable conectado al sistema de adquisición de datos (Figura 2L) (consulte la Tabla de materiales). El ratón se coloca en el centro de la arena.
    4. Con la función Livestream del software NeuView, ajuste la potencia del LED para optimizar el brillo de la imagen de calcio.
      NOTA: Para las imágenes de calcio, la velocidad de fotogramas de grabación es de 10 fotogramas/s de forma predeterminada.
    5. En NeuView, desmarque LED1, haga clic en Capturar y luego en los botones Activar para comenzar a grabar, y presione Detener después de 100 cuadros.
      NOTA: Esto es para grabar imágenes de fondo para aproximadamente 100 cuadros con luz LED apagada.
    6. En el software de la cámara de comportamiento, haga clic en Iniciar grabación (Figura 4C). En NeuView, marque LED1, haga clic en Capturar y luego en los botones Activar para comenzar a grabar. Pulsa Detener después de 3000 fotogramas.
      NOTA: Esto es para registrar imágenes de calcio y comportamiento simultáneamente. La prueba de campo abierto dura 15 minutos, generalmente se divide en tres sesiones de grabación cada una de 5 minutos. Esto es para evitar que el miniscopio se sobrecaliente debido al uso continuo.
    7. Guarde las imágenes de calcio y las grabaciones de comportamiento en las carpetas designadas. Repita la grabación durante dos sesiones más mientras graba el fondo antes de cada sesión y guarde todas las grabaciones en la carpeta designada.
  3. Separe el miniscopio de su base.
    1. Una vez completada la grabación, desconecte el cable del miniscopio.
    2. Anestesiar brevemente al ratón en la cámara de inducción (5% de isoflurano y 1L/min de caudal de oxígeno). Coloque el ratón sobre una superficie limpia y cálida.
  4. Desenrosque el tornillo de bloqueo en la base y separe el miniscopio de la base. Vuelva a colocar la tapa protectora sobre la base y apriete el tornillo de bloqueo. Vuelva a colocar el ratón en su jaula de origen.

Resultados

La Figura 1 muestra el procedimiento experimental esquemático, incluida la inyección viral, la implantación de lentes GRIN, la fijación de la base del miniscopio al cráneo del ratón y las imágenes de calcio in vivo a través de un miniscopio. Todo el procedimiento toma ~ 2 meses. La Figura 2 muestra los principales componentes descritos en el protocolo para imágenes de calcio in vivo de miniscopio. La Figura 3 muestra las interfaces del software AutoStereota durante la implantación de la lente GRIN. La Figura 4 muestra las interfaces de NeuView y el software de grabación de comportamiento durante las imágenes de calcio in vivo.

El resultado de las imágenes de calcio in vivo depende del éxito de las cirugías de inyección viral e implantación de lentes GRIN. La Figura 5 muestra una variedad de resultados (es decir, no exitosos, subóptimos y buenos) de los registros de imágenes de calcio in vivo . En casos fallidos, la imagen de calcio podría aparecer oscura o brillante, pero generalmente revela ninguna o muy pocas neuronas activas. Por lo general, no realizamos experimentos de registro de calcio in vivo si hay menos de cinco neuronas activas. Una buena imagen de calcio in vivo generalmente revela varios cientos de neuronas activas. Si una grabación contiene menos de cien neuronas activas, la consideramos una grabación subóptima.

Tanto en los registros subóptimos como en los buenos registros se llevaron a cabo experimentos de imágenes de calcio in vivo, y se realizó el análisis de datos posterior. La película 1 muestra una grabación representativa de imágenes de calcio in vivo del mPFC del ratón. Los videos de comportamiento y los datos de imágenes de calcio generalmente se procesan por separado. Los videos de comportamiento del mouse se pueden calificar manualmente. Los archivos de imágenes de calcio se procesan utilizando la caja de herramientas de procesamiento de imágenes de calcio CaImAn24. La Figura 6 muestra un mapa celular representativo y varios rastros de calcio de un buen registro de imágenes de calcio in vivo .

Después de completar las imágenes de calcio in vivo , el paso final es confirmar si la inyección viral y la implantación de la lente GRIN se han producido en la región cerebral deseada. Para este propósito, el ratón fue perfundido con solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguida de paraformaldehído al 4% (PFA). El cerebro del ratón se recolectó, se colocó en PFA al 4% durante 12 h y se almacenó en PBS a 4 ° C. El cerebro del ratón se seccionó en rodajas de 50 μm de grosor con un vibratome. Las rebanadas cerebrales fueron teñidas con DAPI y observadas bajo el microscopio (no descritas en el protocolo)12. La Figura 7 es una rebanada de cerebro de ratón ~ 1.94 mm anterior a bregma de un ratón experimental, que muestra la pista donde se implantó la lente GRIN. La región de fluorescencia verde debajo y alrededor de la pista de la lente GRIN indica la expresión de GCaMP6f en la región mPFC.

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Figura 1: Visión general esquemática del procedimiento experimental. (A) Inyección estereotáxica del virus en el mPFC. (B) Implantación de lente GRIN en el mPFC. (C) Fijación de la base del miniscopio al cráneo del ratón. (D) Montaje del miniscopio e imágenes de calcio in vivo . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Principales componentes necesarios para la obtención de imágenes de calcio in vivo . (A) Una lente GRIN con 1 mm de diámetro y 4,38 mm de longitud. (B) Una aguja de extremo romo pulida manualmente de 27 G utilizada para la aspiración de tejido cerebral. (C) El brazo robótico acoplado al soporte de la aguja. (D) Una tapa hecha a medida de un tubo de PCR para proteger la lente GRIN expuesta hasta la fijación de la base del miniscopio en el cráneo del ratón. (E) El soporte del miniscopio (base) con una tuerca hexagonal. (F) Un miniscopio cuya parte de rosca está envuelta con la cinta de PTFE. (G) Un miniscopio sujeto a su base con un tornillo de bloqueo. (H) El brazo de sujeción del miniscopio. (I) Un controlador motorizado 3D personalizado utilizado para facilitar el movimiento del miniscopio en posiciones XYZ. (J) Una tapa protectora sujeta a la base para proteger la lente GRIN expuesta mientras el ratón no está realizando imágenes de calcio in vivo . (K) El miniscopio conectado al cable. (L) El sistema de adquisición de datos para imágenes In vivo Ca2+ . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Interfaces del software AutoStereota durante la aspiración de tejido cerebral capa por capa. (A) La interfaz correspondiente a los pasos 2.17.1 a 2.17.3. (B) La interfaz correspondiente a los pasos 2.17.4 a 2.17.6. (C) La interfaz correspondiente a los pasos 2.17.7 a 2.17.9. (D) La interfaz correspondiente a los pasos 2.17.10 a 2.17.12. Los cuadros rojos resaltan los valores de entrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Interfaces del software NeuView y el software de registro de comportamiento durante la obtención de imágenes de calcio in vivo . (A) La interfaz de NeuView. (B,C) Las interfaces del software de registro de comportamiento. Los cuadros rojos resaltan los botones en los que es necesario hacer clic. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Mapas celulares de fluorescencia de proyección máxima para mostrar el rango de posibles resultados. (A, B) Imágenes de calcio in vivo sin éxito que no son aceptables para el análisis de datos posterior. (A) es oscuro y contiene menos de 5 neuronas activas. (B) es brillante pero no tiene neuronas activas. (C) El mapa celular de una imagen de calcio in vivo subóptima que contiene algunas neuronas activas. (D) El mapa celular de una buena imagen de calcio in vivo que incluye varios cientos de neuronas activas. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Mapa celular representativo y transitorios de calcio de una imagen de calcio in vivo exitosa. El panel izquierdo es el mapa celular de fluorescencia de proyección máxima de un registro de imágenes de calcio in vivo en el mPFC durante una prueba de campo abierto. La grabación dura 5 min. El panel derecho muestra los transitorios de calcio de 15 regiones de interés (de color emparejado). Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Evaluación post mortem de un ratón experimental. La evaluación post mortem para la expresión de GCaMP6f y la implantación de lente GRIN en el mPFC de un ratón experimental. El área rectangular indica la ruta para la implantación de la lente GRIN. El área verde debajo de la región implantada de la lente GRIN confirma que GCaMP6f se expresó, y la lente GRIN se implantó con precisión en la región cerebral deseada. Cg, corteza cingulada; PrL: corteza prelímbica; IL: corteza infralímbica. Barra de escala: 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparaciones del sistema de miniscopios hecho a medida en el NIDA con otros sistemas de miniscopios 7,8,9,10,11,13,25,26. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Película 1: Una grabación de imágenes de calcio in vivo del mPFC del ratón durante una prueba de campo abierto. Para fines de demostración, este video muestra solo 1 minuto de grabación. La velocidad de fotogramas de grabación original es de 10 fotogramas/s. El video es 6 veces más rápido que la grabación original. Haga clic aquí para descargar esta película.

Discusión

Una pregunta central en neurociencia es comprender cómo las dinámicas y los circuitos neuronales codifican y almacenan información, y cómo se alteran en las enfermedades cerebrales. Utilizando un sistema de imágenes Ca2+ in vivo miniscopio, la actividad neuronal individual de varios cientos de neuronas dentro de un microcircuito local puede ser monitoreada simultáneamente desde un animal que se comporta libremente. Aquí, se describe un protocolo de cirugía detallado para la inyección viral y la implantación de lentes GRIN para preparar a los roedores para un cerebro profundo in vivo Ca2 + imágenes a través de un sistema de grabación de miniscopio desarrollado a medida. La Tabla 1 muestra las comparaciones de nuestro sistema de miniscopio con otros sistemas de miniscopio disponibles comercialmente y personalizados 7,8,9,10,11,13,25,26. Vale la pena señalar que la implantación de lentes GRIN utilizando el protocolo quirúrgico actual es compatible con cualquier sistema comercial o personalizado de imágenes de un solo fotón y dos fotones para un cerebro profundo con imágenes de calcio in vivo.

Desde la inyección viral hasta la adquisición de datos de imágenes de calcio in vivo del miniscopio, todo el procedimiento experimental tarda al menos 2 meses en completarse. Es un proceso complicado y laborioso. El éxito final del experimento depende de múltiples factores, incluida la elección adecuada de gecoci, la inyección de virus con precisión en el área cerebral objetivo, la expresión viral suficiente en la población neuronal deseada, la implantación de la lente GRIN precisamente en la ubicación deseada, la recuperación adecuada de las cirugías, así como, si se produce una inflamación grave después de la cirugía y si el comportamiento del animal se ve gravemente afectado por las cirugías. y así sucesivamente.

Dos pasos críticos incluyen la inyección estereotáxica del virus y la implantación de lentes GRIN. Para el propósito de demostración, la microinyección estereotáxica se realizó en el mPFC de ratón, con el virus adenoasociado (AAV1) codificando GCaMP6f bajo el control del promotor CaMKII que etiqueta selectivamente las neuronas piramidales en el mPFC. Se eligió GCaMP6f ya que es uno de los indicadores de calcio más rápidos y sensibles con un tiempo de descomposición de la mitad de 71 ms15. Además, la expresión viral AAV de GCaMP6f es duradera (es decir, varios meses), por lo que es ideal para realizar imágenes repetitivas in vivo de Ca2+ durante un largo período para estudios longitudinales en modelos de ratón de enfermedades neurodegenerativas27. El protocolo de cirugía actual se puede adaptar para dirigirse a diferentes poblaciones celulares en cualquier otra región del cerebro. Varias herramientas virales disponibles permiten el etiquetado selectivo de poblaciones neuronales específicas en la región cerebral deseada a la edad deseada. Además, los investigadores pueden aprovechar el sistema de recombinación Cre-LoxP y varios modelos de ratones transgénicos disponibles para llevar a cabo modificaciones genéticas y estudiar el resultado de los circuitos conductuales y neuronales28,29.

Una característica única del protocolo presentado es que la aspiración automatizada de tejido cerebral capa por capa se realizó antes de la implantación de la lente GRIN (1 mm de diámetro). Esto se logra a través de una aguja de 27 G conectada a un sistema de vacío, controlado por un brazo robótico personalizado y un software23. Según nuestra experiencia, este método genera una superficie uniforme para que la lente GRIN entre en contacto y causa menos daño al tejido vecino que la aspiración manual de tejido23. Por esta razón, este procedimiento aporta una ventaja obvia para las lentes GRIN con un diámetro relativamente más amplio (por ejemplo, 1 mm). Sin embargo, la aspiración de tejido puede no ser necesaria para implantar una lente GRIN con un diámetro más pequeño (0,5 mm o 0,25 mm). En su lugar, se puede plantar directamente a lo largo de la pista principal hecha con una aguja de 30 G21.

Además de los dos pasos críticos discutidos anteriormente, muchos otros factores deben considerarse cuidadosamente para una operación exitosa. (1) Todos los instrumentos que entran en contacto con el cerebro deben ser esterilizados para prevenir la infección. (2) Todos los pasos de la cirugía deben realizarse para minimizar el daño al cerebro para prevenir una mayor inflamación y la formación excesiva de tejido cicatricial. (3) Las dosis de anestesia administradas inicialmente y mantenidas durante la cirugía, especialmente las administradas por vía intraperitoneal, deben considerarse cuidadosamente. Las dosis de anestesia pueden modificarse de acuerdo con diferentes cepas de ratón, ya que algunas pueden ser más susceptibles. (4) La condición del ratón debe ser monitoreada constantemente durante la cirugía. Por último, (5) los ratones necesitan ser monitoreados regularmente después de la cirugía, ya que pueden ocurrir muchas complicaciones después de la cirugía.

Aunque un trozo de tejido cerebral se extrae unilateralmente durante la etapa de implantación de la lente GRIN, no observamos ningún déficit de comportamiento obvio 7,12. El peso del miniscopio es de alrededor de 2 gramos y el cable está diseñado a medida para hacerlo ligero y para garantizar que el mouse pueda transportarlo fácilmente. El miniscopio y el cable solo se conectan al animal antes de la obtención de imágenes in vivo y se separan después de la imagen. Todo el proceso de obtención de imágenes generalmente no toma más de 30 minutos. Por lo tanto, estas instrumentaciones no impiden que el ratón se comporte libremente. Los pasos de instalación y desinstalación del miniscopio necesitan una anestesia breve (menos de 2 minutos) con isoflurano con el fin de restringir a los animales. Por lo general, dejamos que el ratón se recupere de la breve exposición de isoflurano durante 30 minutos antes de realizar imágenes in vivo. Hemos realizado imágenes de calcio miniscopio in vivo una vez por semana durante unas semanas sin notar ningún impacto en la salud del ratón y el comportamiento social del ratón12.

Una limitación importante del sistema de grabación de miniscopio actual es la necesidad de conectar el microscopio a un cable para la adquisición de datos. La presencia del cable a veces restringe el rendimiento de la tarea del mouse y limita la grabación de un animal a la vez. Recientemente, se ha desarrollado un miniscopio inalámbrico25,26. Esto ampliará el rendimiento de la tarea y permitirá imágenes simultáneas in vivo de múltiples animales en un grupo. Además, el desarrollo de GECI más sensibles con longitudes de onda espectralmente separables combinadas con un miniscopio de doble color ofrecerá posibilidades más emocionantes para la investigación en neurociencia.

Divulgaciones

Los autores informan que no hay intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo está respaldado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 y UG3NS115608.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fresas de 0,6 mm y 1,2 mmTecnología KF8000037800Para craneotomía
Aguja de 27-G y 30-G AgujaBD PrecisionGlideREF 305109 y REF305106Para ambas cirugías
45 pinzas en ánguloHerramientas Fine Science11251-35Para cirugías
Solución de povidona yodada al 7,5% (Betadine)Purdue Products L.P.NDC 67618-151-17Desinfectante de superficies
AcetonaSigma-Aldrich179124-1L Limpiador delentes GRIN
AgarosaSigma-AldrichA9539-25GPara implante de lentes GRIN
Pomada antibióticaHeliDerm Technology81073087Para inyección
de virus Medicamento antiinflamatorio (ibuprofeno)Johnson & Johnson Consumer Inc30043308Actúa como analgésico después de las cirugías
AutoStereotagithub.com/liang-bo/autostereota NIDA/IRPpara la implantación de lentes GRIN
Software de recodificación de comportamiento (Point Grey FlyCap2)Point GreyPoint Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2CPara registrar el comportamiento
Tuerca hexagonal de latónMcMASTER-CARR92736A112para la implantación de lentes GRIN
BuprenorfinaParPharmaceuticals NDC 4202317905para la implantación de lentes GRIN
Cloruro de calcioSigma10043-52-4Para la preparación de un
conmutadorNIDA/IRPde diseño personalizadodel sistema de adquisición de imágenes
Tanque de oxígeno comprimido y óxido de Caxbondióxido Solucionesde aire de las Montañas RocosasBI-OX-CD5C-Kpara lentes GRIN Tanque de
oxígeno comprimidoRocky Mountain Air SolutionsOX-M-KPara inyección de virus
MicrodrillTecnología KF8000037800Para craneotomía
CianoacrilatoHenkel Coorporation# 1811182Para la implantación de lentes GRIN
Controlador de adquisición de datosNIDA/IRPDiseñado a medidaComponente de adquisición de imágenes sistema
Cable de transmisión de datosNIDA/IRPDiseñado a medidaComponente del sistema de adquisición de imágenes
Juego de cemento dentalC& B Metabond y CatalystA00253revA306 y A00168revB306Para la implantación de lentes GRIN
Juego de cemento dentalDuralay2249DPara la implantación de lentes GRIN
DexametasonaVEToneNDC 1398503702para la implantación de lentes GRIN
DextrosaSigma50-99-7Para la preparación de aCSF
Gel dietéticoClear H2072-06-5022Suplemento dietético para ratón
Lente GRINGRINTECHNEM-100-25-10-860-SPara la implantación de lentes GRIN
Almohadilla térmicaPhysitemp Instruments LLC.#10023Para mantener el cuerpo del ratón caliente durante las cirugías
IsofluranoVEToneV1502017 Anestesia
KetaminaVEToneV1 501072Para la implantación de lentes GRIN
LidocaínaWEST-WARDNDC 0143-9575-01Anestesia local
Cloruro de magnesio hexahidratadoSigma7791-18-6Para la preparación de un
microlitro de CSF jeringa (Hamilton)Hamilton7653-01Para inyección de virus
MicroSyringe Pump ControllerWorld Precision Instrument#178647Para inyección de virus
MiniscopeNIDA/IRPDiseñadoa medida Para la obtención de imágenes
de miniscopio Protolabs Diseñadoa medida Para montar la basede
sujeción del miniscopioNIDA/IRPDiseño a medidaPara el montaje de la base
Tapa de protección del miniscopioProtolabsDiseño a medidaPara proteger el miniscopio
Controlador motorizadoThorlabs KMTS50EPara el montaje de la base
NeuViewhttps://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 NIDA/IRPPara la obtención de imágenes in vivo
Pomada oftálmicaPuralube Pomada veterinariaNDC 17033-211-38oftálmico
Thermo ScientificAB-0622Para la implantación de lentes GRIN
Pinza de pellizcoWorld Precision Instrument14040Para sujetar el tubo Cinta
politetrafluoroetileno (PTFE)TegaSeal Cinta de PTFEA-A-58092Para la fijación de miniScope a la base
Cloruro de potasio Sigma7447-40-7Para la preparación de un brazo
robóticoSCF NIDA/IRPDiseñadoa medida Para la implantación de lentes GRIN
Solución salinaHospiraRL 7302Para ambas cirugías
Tornillo de fijaciónDECORAH LLC.3BT-P9005-00-0025Para atornillar la tuerca hexagonal de latón en la base del miniscopio
  Tubo de caucho de silicona, 0.062" ID, 1/8" ODMcMaster2124T3Para la irrigación de aCSF
Bicarbonato de sodioSigma144-55-8Para la preparación de aCSF
Cloruro de sodioSigma7647-14-5Para la preparación de aCSF
Fosfato de sodio monobásicoSigma7558-80-7Para la preparación de aCSF
Etapa estereotáxicaKOPFModelo 962 Dual Ultra Precise Pequeño Animal EstereotáxicoPara ambas cirugías
Hisopo de algodón estérilPuritanREF 806-WCPara ambas cirugías
Herramientas quirúrgicasHerramientas de ciencia fina11251-35Para cirugías
SuturaSofsilkREF SS683Para inyección de virus
  Filtro de jeringa (0,22 y micro; m)MillexSLGVR33RSPara filtrar aCSF durante la implantación de lentes GRIN
Suspensión viral (AAV1-CamKII-GCamp6f)Addgene100834-AAV1Para inyección
Título: 2.8 X 10^13 GC/ml
XilacinaVEToneV1 510650Para implantación de lentes GRIN
de CSF Componente para implantación inalámbrico Base Brazo Tubo de PCR de de virus

Referencias

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Reimpresiones y permisos

Erratum


Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 5/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.

The following paragraph was added to the end of the Discussion:

Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

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Implantación de lentes GRINimágenes con miniscopioimágenes cerebrales profundassensor de calcio codificado genéticamenteratones en comportamiento libreanálisis de circuitos neuronalesimágenes de un solo fotónimágenes de dos fotones
Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo
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