Algoritmo de análisis de imágenes basado en áreas para la cuantificación de cocultivos de macrófagos y fibroblastos

Summary

Presentamos un método, que utiliza un enfoque de análisis de imágenes basado en áreas generalizables para identificar los recuentos de células. El análisis de diferentes poblaciones celulares explotó las diferencias significativas de altura y estructura celular entre los distintos tipos de células dentro de un algoritmo adaptativo.

Abstract

La cuantificación de las células es necesaria para una amplia gama de estudios biológicos y bioquímicos. El análisis de imágenes convencional de las células generalmente emplea enfoques de detección de fluorescencia, como la tinción inmunofluorescente o la transfección con proteínas fluorescentes o técnicas de detección de bordes, que a menudo son propensas a errores debido al ruido y otras no idealidades en el fondo de la imagen.

Diseñamos un nuevo algoritmo que podría contar y distinguir con precisión macrófagos y fibroblastos, células de diferentes fenotipos que a menudo se colocalizan durante la regeneración de tejidos. SE UTILIZÓ MATLAB para implementar el algoritmo, que diferenció distintos tipos de células en función de las diferencias de altura del fondo. Se desarrolló un algoritmo primario utilizando un método basado en el área para tener en cuenta las variaciones en el tamaño / estructura de la célula y las condiciones de siembra de alta densidad.

Las no idealidades en las estructuras celulares se explicaron con un algoritmo secundario e iterativo que utiliza parámetros internos como la cobertura celular calculada utilizando datos experimentales para un tipo de célula determinado. Finalmente, se realizó un análisis de ambientes de cocultivo mediante un algoritmo de aislamiento en el que se excluyeron selectivamente varios tipos de células en base a la evaluación de las diferencias de altura relativa dentro de la imagen. Se encontró que este enfoque cuenta con precisión las células dentro de un margen de error del 5% para las células monocultivadas y dentro de un margen de error del 10% para las células cocultivadas.

Introduction

El software se implementa rutinariamente durante las técnicas de análisis de imágenes para garantizar que los resultados sean precisos, eficientes e imparciales. Para los ensayos basados en células, un problema común es la identificación errónea de las células. Las imágenes con ajustes focales y de contraste inadecuados pueden conducir a un desenfoque celular, en el que el límite de las células individuales se vuelve difícil de identificar¹. La presencia de características de imagen extrañas, como poros, burbujas u otros objetos no deseados, puede dificultar los procedimientos de conteo al ralentizar el proceso de conteo y provocar una identifi....

Protocol

1. Cultivo celular y adquisición de imágenes

1. Cultivo raw264.7 macrófagos a 37 °C y 5% de CO₂ en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 5 μM de β-mercaptoetanol.
   1. Para imágenes de monocultivo, cultive células RAW264.7 a una densidad de 25.000 células/cm² en un matraz de cultivo celular de 5 ml con 1 ml de medio.
2. Cultivo de células NIH/3T3 a 37 °C y 5% de CO₂ en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina^....

Results

El análisis de macrófagos RAW264.7 no bulbosos se realizó en un entorno de monocultivo a 25.000 células/^cm2. Se tomaron imágenes representativas del cultivo celular y se procesaron en MATLAB tras la conversión a tiff de 8 bits en ImageJ. Las salidas del algoritmo a lo largo del proceso se registraron y documentaron en la Figura 2 para la imagen representativa. En esta imagen, el algoritmo contó 226 celdas, y este recuento de imágenes se verificó en comparación con un recuento manu.......

Discussion

Diseñamos un procedimiento general basado en el área que contó las células de manera precisa y eficiente sobre la base de la altura de la célula, lo que permite la cuantificación sin manchas de las células incluso en sistemas de cocultivo. Los pasos críticos para este procedimiento incluyeron la implementación de un sistema de intensidad relativa por el cual las células podrían diferenciarse. El uso de un análisis de altura relativa sirvió para dos propósitos: la necesidad de parámetros externos se hizo innecesaria, ya q.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio invertido Axio Observer 7	Zeiss 1028290770
β-mercaptoetanol	Technologies	21985023
Raspadores	CellTreat	229310
Águila modificada de Dublecco	Fisher Scientific	12430047
PBS de Dublecco	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
Células NIH/3T3	ATCC ATCC	CRL - 1658
Penicilina– Estreptomicina	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Células	ATCC ATCC	TIB - 71
Bicarbonato de Sodio	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Matraz de cultivo celular	Corning	CLS3814-24EA