Algoritmo de análisis de imágenes basado en áreas para la cuantificación de cocultivos de macrófagos y fibroblastos

Resumen

Presentamos un método, que utiliza un enfoque de análisis de imágenes basado en áreas generalizables para identificar los recuentos de células. El análisis de diferentes poblaciones celulares explotó las diferencias significativas de altura y estructura celular entre los distintos tipos de células dentro de un algoritmo adaptativo.

Resumen

La cuantificación de las células es necesaria para una amplia gama de estudios biológicos y bioquímicos. El análisis de imágenes convencional de las células generalmente emplea enfoques de detección de fluorescencia, como la tinción inmunofluorescente o la transfección con proteínas fluorescentes o técnicas de detección de bordes, que a menudo son propensas a errores debido al ruido y otras no idealidades en el fondo de la imagen.

Diseñamos un nuevo algoritmo que podría contar y distinguir con precisión macrófagos y fibroblastos, células de diferentes fenotipos que a menudo se colocalizan durante la regeneración de tejidos. SE UTILIZÓ MATLAB para implementar el algoritmo, que diferenció distintos tipos de células en función de las diferencias de altura del fondo. Se desarrolló un algoritmo primario utilizando un método basado en el área para tener en cuenta las variaciones en el tamaño / estructura de la célula y las condiciones de siembra de alta densidad.

Las no idealidades en las estructuras celulares se explicaron con un algoritmo secundario e iterativo que utiliza parámetros internos como la cobertura celular calculada utilizando datos experimentales para un tipo de célula determinado. Finalmente, se realizó un análisis de ambientes de cocultivo mediante un algoritmo de aislamiento en el que se excluyeron selectivamente varios tipos de células en base a la evaluación de las diferencias de altura relativa dentro de la imagen. Se encontró que este enfoque cuenta con precisión las células dentro de un margen de error del 5% para las células monocultivadas y dentro de un margen de error del 10% para las células cocultivadas.

Introducción

El software se implementa rutinariamente durante las técnicas de análisis de imágenes para garantizar que los resultados sean precisos, eficientes e imparciales. Para los ensayos basados en células, un problema común es la identificación errónea de las células. Las imágenes con ajustes focales y de contraste inadecuados pueden conducir a un desenfoque celular, en el que el límite de las células individuales se vuelve difícil de identificar¹. La presencia de características de imagen extrañas, como poros, burbujas u otros objetos no deseados, puede dificultar los procedimientos de conteo al ralentizar el proceso de conteo y provocar una identificación errónea. Además, el conteo de células puede ser oneroso, y contar cientos de réplicas puede llevar mucho tiempo. Además, existe un sesgo subjetivo inherente durante el conteo manual y, por lo tanto, la toma de decisiones con respecto a la identificación celular a menudo es inexacta². El software automatizado ofrece un potencial emocionante para evitar todos estos problemas al diferenciar rápida y precisamente las células de los objetos extraños, incluidos los objetos mucho más allá de la capacidad humana para una detección precisa, sobre la base de criterios de identificación bien definidos que reducen la influencia del sesgo del investigador. Las técnicas comunes para identificar células utilizando software automatizado implican dos métodos principales: segmentación y umbral³. Aquí, demostramos un protocolo generalizable basado en áreas que permite un conteo de células rápido, preciso y económico dentro de un marco de software ampliamente accesible.

Las técnicas de segmentación, como la detección de bordes, buscan aislar células individuales utilizando diferencias de intensidad dentro de una imagen. Los cambios de intensidad que distinguen una celda del resto de la imagen consisten con mayor frecuencia en cambios bruscos en el brillo⁴. La detección de bordes implica un paso de filtrado de regularización, seguido de un paso de diferenciación en el que se detectan cambios de intensidad. El proceso de diferenciación identifica bordes y contornos dentro de la imagen de cambios de alta intensidad, y estos bordes y contornos se correlacionan con la presencia celular. Aunque las imágenes con ruido se pueden ejecutar a través de algoritmos de denoising⁴, las técnicas de detección de bordes se utilizan idealmente para analizar imágenes con bajo ruido de fondo. El proceso funciona de manera óptima cuando los límites celulares son clara y fácilmente distinguibles y no se ven obstaculizados por contornos de brillo no relacionados con la presencia celular, el desenfoque celular, los objetos extraños o las estructuras celulares internas definidas ^1,2. Si una imagen es particularmente ruidosa, las células pueden distinguirse aún más a través de la tinción fluorescente o la transfección con proteínas fluorescentes ^2,5. Aunque esto mejora significativamente la precisión de las técnicas de segmentación, requiere costos adicionales e inversiones de tiempo adicionales para preparar cultivos celulares para imágenes.

Las técnicas de umbral implican la división de una imagen en dos categorías: el primer plano y el fondo, con celdas asignadas al primer plano³. Estas técnicas utilizan cambios de color/contraste para definir la altura aparente de un objeto; los objetos que son rutinariamente "más altos" que el fondo se pueden identificar fácilmente como células. La transformación de la divisoria de aguas funciona de esta manera asociando superficies con píxeles claros como primer plano y aquellos con píxeles oscuros como fondo ^6,7. A través de la identificación basada en la altura, las técnicas de umbral pueden distinguir rutinariamente el ruido de los objetos deseados, siempre que existan dentro del mismo plano focal. Cuando se combina con una cuantificación basada en el área, una transformación de cuenca puede identificar con precisión grupos de objetos en entornos donde las técnicas de segmentación típicas, como la detección de bordes, serían inexactas.

Las transformaciones de cuencas hidrográficas se combinan comúnmente con técnicas de segmentación para preparar imágenes para un análisis más limpio, lo que resulta en una mayor precisión del conteo de células. Para este proceso, la transformación de la cuenca se utiliza para resaltar las regiones potenciales de interés antes de la segmentación. Una transformada de cuenca proporciona beneficios únicos al identificar células en primer plano de las imágenes, lo que puede mejorar la precisión del análisis de segmentación al eliminar posibles falsos positivos para las células, como parches desiguales de fondo. Sin embargo, pueden surgir dificultades cuando se intenta adaptar imágenes basadas en células a una transformación de cuenca. Las imágenes con alta densidad celular pueden estar plagadas de subsegmentación, en la que los agregados de células se identifican como un grupo singular en lugar de como componentes individuales. La presencia de ruido o cambios bruscos de intensidad también pueden dar lugar a una sobresegmentación, en la que el algoritmo sobreisola las células, lo que resulta en recuentos celulares excesivos e inexactos⁸.

A continuación, detallamos un método para minimizar los inconvenientes primarios de la transformada de cuenca mediante la incorporación de componentes de un análisis de umbral dentro de un algoritmo de cuantificación basado en áreas, como se muestra en la Figura 1. En particular, este algoritmo se implementó con software de código abierto y / o ampliamente disponible, y la aplicación de este marco de conteo de células fue posible sin costosos reactivos o técnicas complejas de preparación celular. Se utilizaron macrófagos RAW264.7 para demostrar el método debido a su papel crítico en la regulación del mantenimiento del tejido conectivo y los procesos de cicatrización de heridas⁹. Además, se analizaron los fibroblastos NIH/3T3 debido a su papel clave en el mantenimiento y la reparación de tejidos. Las células de fibroblastos a menudo coexisten y apoyan a los macrófagos, generando la necesidad de distinguir estos tipos de células fenotípicamente distintas en los estudios de cocultivo.

Los recuentos de células a partir de imágenes con alta densidad celular viable (VCD) podrían cuantificarse de manera confiable y eficiente calculando el área cubierta por las células y el área promedio ocupada por una célula singular. El uso de umbrales en lugar de segmentación para la identificación celular también permitió análisis más complejos, como experimentos en los que se analizaron simultáneamente diferentes tipos de células en cocultivos. Se encontró que los fibroblastos NIH/3T3, que a menudo se encuentran para colocalizarse con macrófagos RAW264.7 dentro de un sitio de curación de heridas, crecen en un plano focal que era distinto del plano focal de los macrófagos¹⁰. En consecuencia, se ejecutaron múltiples algoritmos de umbral para definir el fondo y el primer plano dependiendo del tipo de celda que se estaba analizando, lo que permitió un conteo preciso de dos tipos de celdas diferentes dentro de la misma imagen.

Protocolo

1. Cultivo celular y adquisición de imágenes

1. Cultivo raw264.7 macrófagos a 37 °C y 5% de CO₂ en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 5 μM de β-mercaptoetanol.
   1. Para imágenes de monocultivo, cultive células RAW264.7 a una densidad de 25.000 células/cm² en un matraz de cultivo celular de 5 ml con 1 ml de medio.
2. Cultivo de células NIH/3T3 a 37 °C y 5% de CO₂ en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina¹¹.
3. Para la obtención de imágenes de cocultivo, cultive macrófagos RAW264.7 y fibroblastos NIH/3T3 juntos en proporciones variadas, a una densidad total de 25.000 células/cm². Use medio de cocultivo que sea 1 parte de raw264.7 medio (DMEM suplementado con 10% fbS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1.5 g / L de bicarbonato de sodio y 5 μM de β-mercaptoetanol) y 1 parte de NIH / 3T3 medio (DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina).
4. Después de la siembra, incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂ para alcanzar una densidad celular viable de confluencia celular del 80%.
5. Células de imagen con un microscopio invertido equipado con un objetivo 40x. Adquiera todas las imágenes en escala de grises y expórtelas en el archivo '.czi' sin procesar.
   1. Determine la capacidad del algoritmo para evaluar con precisión las imágenes con una gama de calidades de imagen. Adquirir imágenes con diferentes focos, produciendo tanto imágenes "no bulbosas" (Figura 2) como imágenes "bulbosas" (Figura 3).
   2. Exporte y convierta imágenes de celda al formato de imagen tiff (.tiff) de 8 bits utilizando ImageJ mediante la función 'Batch Convert' en los archivos raw '.czi' antes del análisis de MATLAB. Almacene las imágenes convertidas en una carpeta local y transfiera manualmente estos archivos de imagen a la papelera de MATLAB correspondiente.

2. Análisis de imágenes-monocultivo utilizando el archivo "monocultivo.m" principalmente

NOTA: Los siguientes pasos se realizaron con MATLAB. Se utilizaron tres archivos para el protocolo MATLAB: "process.m" (Supplemental coding file 1), el archivo que contiene el algoritmo, "monoculture.m" (Supplemental coding file 2), el archivo que se ejecutará para analizar imágenes de monocultivo, y "coculture_modified.m" (Supplemental coding file 3), el archivo que se ejecutará para analizar imágenes de cocultivo.

1. Utilice el método basado en áreas para obtener imágenes de celdas que muestren variaciones relativas de altura. Salidas de imagen para cada subpaso utilizando la función 'imshow()' para cada subimagen. Copie y pegue el archivo de imagen para su análisis en la papelera e introduzca el nombre del archivo en el siguiente comando. Presione ejecutar para iniciar el programa.
   imread('nombre de archivo.tiff')
   1. Analice las imágenes mediante "apertura por reconstrucción" seguido de "cierre por reconstrucción" utilizando las funciones de fuente⁸ para ampliar el primer plano desde el fondo. Utilice el primer comando para abrir por reconstrucción y la segunda y tercera secuencias para cerrar por reconstrucción
      «imopen()»
      «imerode()»
      «imreconstruct()»
2. Binarize las imágenes reconstruidas a píxeles negros puros y blancos puros utilizando un sistema de identificación basado en percentiles. Tenga en cuenta que las celdas se convierten a un valor de píxel blanco puro de '255' en este sistema, mientras que los objetos de fondo y extraños (no celulares) se convierten a un valor de píxel negro puro de '0'.
   1. Distinga las celdas del fondo utilizando una diferencia de percentil del "píxel máximo relevante", el valor de píxel más grande que comprende al menos el 0,5% de una imagen dada.
   2. Analice y evalúe los valores de píxeles para macrófagos RAW264.7. Si estos valores están dentro del 4,5% del píxel máximo relevante, marque el píxel como celular.
      Nota : este comando se puede emitir mediante una instrucción if simple.
   3. Para las imágenes que contienen perfiles de células bulbosas, como las que se ven en la Figura 2, implemente un procedimiento iterativo para corregir la binarización errónea en los centros de las celdas (denominadas 'islas'; ver más abajo), de la siguiente manera.
   4. Determinar una suposición inicial para la cobertura total de la célula; El 60% se utilizó para este estudio. Tenga en cuenta que el número de células presentes en la imagen debe depender de la cobertura celular; por lo tanto, la relación entre el número de células y la cobertura celular se puede determinar experimentalmente. Usando esta relación, determine las variables 'Alfa' y 'kappa'.
      NOTA: 'Alfa' representa un vector 3 x 1 que contiene los siguientes percentiles de altura relativa: el percentil de altura en el que se identificaron las células, el percentil de altura en el que se identificó el fondo y el percentil de altura en el que las islas-regiones en las que los valores de intensidad fueron significativamente más bajos que los valores celulares, típicamente residían. 'Kappa' representa el área total cubierta por las celdas en la imagen.
   5. Ejecute el algoritmo, que (i) analizará imágenes utilizando estimaciones iniciales de alfa y kappa para llenar una parte de las islas, y (ii) utilizará los recuentos de células y la cobertura posteriores al análisis para recalcular kappa. Si el valor kappa está dentro del 10% de la conjetura inicial, continúe con el siguiente paso.
      NOTA: Para las imágenes que contienen células RAW264.7 y NIH/3T3, se encontró que alfa era [4.3, 5.5, 10]. En otras palabras, una diferencia del 4,3% con respecto al píxel máximo relevante determinó el percentil de altura en el que se identificaron las células, una diferencia del 5,5% con respecto al píxel máximo relevante determinó el percentil de altura en el que se identificó el fondo. Una diferencia del 10% con respecto al píxel máximo relevante determinó el percentil de altura en el que normalmente residían las islas.
3. Después de la binarización de la imagen, determine el área celular promedio automáticamente utilizando el algoritmo de búsqueda de círculos de código abierto, que realiza una transformada de Hough en la imagen binarizada 12,13,14. Utilice el siguiente comando para obtener un vector de todas las ubicaciones centrales y radios de círculos que se encuentran dentro de la imagen.
   '[centros, radios] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
   'A' en este comando es la imagen de elección, y [minradius, maxradius] es el rango de radios que el algoritmo intentará detectar.
   NOTA: Este procedimiento para determinar el área celular promedio asume que la morfología de las células de macrófagos era circular y consistente entre las células¹⁰. A partir de datos experimentales, se observa que los radios de los macrófagos son más comúnmente entre 30 y 50 píxeles con un aumento de 40x. Este rango de píxeles se define como el rango aceptable para el algoritmo de búsqueda de círculos. Los radios podrían ser significativamente diferentes para otros tipos de células y requerirían determinación mediante análisis experimentales.
   1. Utilice las salidas de radios para calcular el área celular promedio promediando. Analice al menos 10 células para garantizar una identificación precisa del área.
4. Determine el número total de celdas dentro de la imagen utilizando el área celular promedio.
   1. Recorra la matriz de la imagen y cuente el número total de píxeles de celda. Determine la cobertura total de celdas dividiendo el número de píxeles de celda por el número total de píxeles dentro de la imagen. Determine el número total de celdas dentro de la imagen dividiendo el número de píxeles de celda por el área promedio de una celda.

3. Análisis de imágenes-cocultura utilizando el archivo "coculture_modified.m" principalmente

NOTA: Los siguientes pasos se realizaron con MATLAB.

1. Utilice el método basado en áreas para obtener imágenes de celdas que muestren variaciones relativas de altura. Salidas de imagen para cada subpaso utilizando la función 'imshow()' para cada subimagen. Copie y pegue el archivo de imagen para su análisis en la papelera e introduzca el nombre del archivo en el siguiente comando. Presione ejecutar para iniciar el programa.
   'imread('nombre de archivo.tiff')'
   1. Analice las imágenes mediante "apertura por reconstrucción" seguido de "cierre por reconstrucción" utilizando las funciones de fuente¹⁰ para ampliar el primer plano desde el fondo. Utilice el primer comando para abrir por reconstrucción y la segunda y tercera secuencias para cerrar por reconstrucción.
      «imopen ()»
      «imerode()»
      «imreconstruct()»
2. Realizar un análisis de cocultivos que contengan células RAW264.7 y NIH/3T3 mediante el uso de dos binarizaciones selectivas, obtenidas explotando las diferencias de altura entre los dos tipos de células.
   1. Determinar experimentalmente un parámetro 'phi' utilizando imágenes de células RAW264.7 y NIH/3T3, con phi representando la diferencia de altura proporcional entre los dos tipos de células. Adivine un valor phi inicial e itere hasta que los recuentos de células y la cobertura coincidan estrechamente con los recuentos manuales, específicos del cocultivo RAW264.7 y NIH/3T3.
      NOTA: Se encontró que el valor de phi utilizado en estos estudios fue de 3.2. Phi se utiliza para filtrar selectivamente una imagen para que parezca contener solo celdas RAW264.7, como se ve en la Figura 4C.
   2. Determine los recuentos de células RAW264.7 y la cobertura celular total de manera similar a las imágenes de monocultivo.
3. Analice la imagen transformada de la cuenca nuevamente sin el parámetro phi, detectando tanto macrófagos como fibroblastos. Adquiera datos de fibroblastos NIH/3T3 restando selectivamente los píxeles celulares RAW264.7, obtenidos utilizando los métodos estándar de umbral y cuantificación basada en área descritos en el paso 2.
   1. Una vez que se haya analizado toda la imagen, determine el número total de píxeles NIH/3T3 restando el número total de píxeles celulares del número de píxeles RAW264.7. Calcule la cobertura de las celdas NIH/3T3 y RAW264.7 dividiendo por el número de píxeles celulares para cada línea celular por el número total de píxeles de imagen.

Resultados

El análisis de macrófagos RAW264.7 no bulbosos se realizó en un entorno de monocultivo a 25.000 células/^cm2. Se tomaron imágenes representativas del cultivo celular y se procesaron en MATLAB tras la conversión a tiff de 8 bits en ImageJ. Las salidas del algoritmo a lo largo del proceso se registraron y documentaron en la Figura 2 para la imagen representativa. En esta imagen, el algoritmo contó 226 celdas, y este recuento de imágenes se verificó en comparación con un recuento manu...

Discusión

Diseñamos un procedimiento general basado en el área que contó las células de manera precisa y eficiente sobre la base de la altura de la célula, lo que permite la cuantificación sin manchas de las células incluso en sistemas de cocultivo. Los pasos críticos para este procedimiento incluyeron la implementación de un sistema de intensidad relativa por el cual las células podrían diferenciarse. El uso de un análisis de altura relativa sirvió para dos propósitos: la necesidad de parámetros externos se hizo innecesaria, ya q...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio invertido Axio Observer 7	Zeiss 1028290770
β-mercaptoetanol	Technologies	21985023
Raspadores	CellTreat	229310
Águila modificada de Dublecco	Fisher Scientific	12430047
PBS de Dublecco	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
Células NIH/3T3	ATCC ATCC	CRL - 1658
Penicilina– Estreptomicina	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Células	ATCC ATCC	TIB - 71
Bicarbonato de Sodio	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Matraz de cultivo celular	Corning	CLS3814-24EA