Aquí, describimos un método de monitoreo no invasivo que involucra la expresión de luciferasa y proteína fluorescente verde en varias líneas celulares de cáncer de mama. Este protocolo proporciona una técnica para monitorizar la formación tumoral y la colonización metastásica en tiempo real en ratones.
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Artículo de método
Monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia
En este artículo
Resumen
Resumen
El cáncer de mama es una neoplasia maligna heterogénea frecuente y la segunda causa de mortalidad en las mujeres, principalmente debido a la metástasis de órganos a distancia. Se han generado varios modelos animales, incluidos los modelos de ratón ortotópicos ampliamente utilizados, donde se inyectan células cancerosas en la almohadilla de grasa mamaria. Sin embargo, estos modelos no pueden ayudar a monitorear la cinética de crecimiento tumoral y la colonización metastásica. Las herramientas de vanguardia para monitorear las células cancerosas en tiempo real en ratones avanzarán significativamente en la comprensión de la biología del tumor.
Aquí, se establecieron líneas celulares de cáncer de mama que expresan de manera estable luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP). Específicamente, esta técnica contiene dos pasos secuenciales iniciados por la medición de la actividad de la luciferasa in vitro y seguidos por la implantación de las células cancerosas en almohadillas de grasa mamaria de ratones de inmunodeficiencia combinada (NOD-SCID) diabéticos-graves no obesos. Después de la inyección, tanto el crecimiento del tumor como la colonización metastásica son monitoreados en tiempo real por el sistema de imágenes de bioluminiscencia no invasiva. Luego, la cuantificación de las metástasis que expresan GFP en los pulmones se examinará mediante microscopía de fluorescencia para validar los resultados de bioluminiscencia observados. Este sofisticado sistema que combina luciferasa y herramientas de detección basadas en fluorescencia evalúa la metástasis del cáncer in vivo, que tiene un gran potencial para su uso en la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de enfermedades.
Introducción
Los cánceres de mama son tipos frecuentes de cáncer en todo el mundo, con aproximadamente 250,000 nuevos casos diagnosticados cada año en los Estados Unidos1. A pesar de su alta incidencia, un nuevo conjunto de medicamentos contra el cáncer ha mejorado significativamente los resultados de las pacientes con cáncer de mama2. Sin embargo, estos tratamientos siguen siendo inadecuados, ya que muchos pacientes experimentan recaída de la enfermedad y diseminación metastásica a órganos vitales2, que es la causa principal de morbilidad y mortalidad del paciente. Por lo tanto, uno de los principales desafío....
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Protocolo
Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo bajo el protocolo MD-21-16429-5 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Hebrea. Además, la Universidad Hebrea está certificada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC).
1. Mantenimiento de la línea celular
NOTA: Las líneas celulares de cáncer de mama humano (MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231) se utilizaron en este protocolo.
- Cultive todas las líneas celulares de cáncer de mama en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero bovi....
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Resultados
Generamos líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-231, MCF-7 y MDA-MB-468) que expresan vectores de GFP y luciferasa. Específicamente, esto se logró mediante una infección secuencial. Primero, las líneas celulares de cáncer de mama se infectaron con un vector de lentivirus que expresa GFP fluorescente. Las células GFP-positivas (GFP+) se clasificaron 2 días después de la infección (Figura 1A, B) y se infectaron con el vector pLX304 Luciferasa-V5. Luego, se util.......
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Discusión
Los experimentos con animales son obligatorios para la investigación del cáncer 7,8,9, y de hecho se han desarrollado muchos protocolos 3,6,10,11,12,13,14. Sin embargo, la mayoría de estos estudios .......
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Divulgaciones
Todos los autores han revelado que no tienen ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio Y.D.S. Nos gustaría agradecer al Instituto Wohl de Medicina Traslacional en el Centro Médico Hadassah, Jerusalén, por proporcionar la instalación de imágenes de animales pequeños. Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo de Carrera de Investigación del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos eppendorf de 1,7 mL Lifegene | LMCT1.7B-500 | ||
| 10 y micro; Puntas L | Lifegene | LRT10 | |
| 1000 µ Puntas en L | Lifegene LRT1000 | ||
| tubos de 15 mL | Lifegene | LTB15-500 | |
| 200 µ Puntas L | Lifegene | LRT200 | |
| placa de cultivo celular de 6 pocillos | COSTAR | 3516 | |
| Placas de 96 pocillos NEGRO Fondo plano | Barra Naor BN30496 | ||
| Contadores de celdas automatizados | Thermofisher | A50298 | |
| BD FACSAria III clasificador | BD | ||
| BD BD Microlance 3 Agujas 27 G (3/4'') | BD | 302200 | |
| BD Plastipak Jeringas 1 mL x 120 | BD | 303172 | |
| Corning 100 mm x 20 mm Plato | estilo CORNING | 430167 | |
| Corning 150 mm x 20 mm Plato estilo | CORNING | 430599 | |
| Countess portaobjetos de cámara de recuento de células | Thermofisher | C10228 | |
| modificado de Dulbecco (DMEM), alto en glucosa, sin glutamina | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Microscopio Eclipse 80i | Centrífuga Nikon | ||
| Eppendorf 5810 R | Sigma Aldrich | EP5820740000 | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
| FUW GFP | Obsequiado por el laboratorio del Dr. Yossi Buganim (Universidad Hebrea de Jerusalén) | ||
| HEK293T | Otorgado por el laboratorio del Dr. Lior Nissim (Universidad Hebrea de Jerusalén) | ||
| Isoflurano, USP Terrell | Piramal | NDC 66794-01-25 | |
| Sistema de imagen in vivo IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| de L-glutamina | Industrias biológicas | 03-020-1A | |
| Living Image Software | PerkinElmer | bioluminiscencia medición | |
| MCF-7 | ATCC | ATCC HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| MDA-MB-468 | ATCC | ATCC HTB-132 | |
| Pipetas Pasteur | NORMAX | 2430-475 | |
| PBS | Hylabs | BP655/500D | |
| pCMV-dR8.2-dvpr | Addgene | #8455 | Proporcionado por David M. Sabatini' s lab (Whitehead Institute, Boston, EE.UU.) |
| pCMV-VSV-G | Addgene | #8454 | Proporcionado por David M. Sabatini' s lab (Instituto Whitehead, Boston, EE. UU.) |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Biological Industries | 03-031-1B | |
| Placa de Petri 90 mm (90x15) | MINI PLAST | 820-090-01-017 | |
| Pipetas 10ml | Lifegene | LG-GSP010010S | |
| Pipetas 25ml | Lifegene | LG-GSP010050S | |
| Pipetas 5ml | Lifegene | LG-GSP010005S | |
| pLX304 Luciferasa-V5 plásmido de explosión | Addgene | #98580 | |
| Polybrene | Sigma Aldrich | #107689 | |
| Prisma 9 | GraphPad | ||
| Reservorios de reactivos | Bar Naor BN20621STR200TC | ||
| SMZ18 Microscopios estereoscópicos | Nikon | ||
| Cloruro de sodio | Bio-Lab | ||
| Filtros de jeringa | Lifegene | LG-FPV403030S | |
| Trypan Blue 0,5% | solución Industrias biológicas | 03-102-1B | |
| Tripsina EDTA Solución B (0,25%), EDTA (0,05%) | Industrias Biológicas | 03-052-1a | |
| Filtros accionados por vacío | SOFRA LIFE SCIENCE | SPE-22-500 | |
| Virusolve | desinfectante | ||
| VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade | Promega | P1043 | |
| X-tremeGENE HP DNA Reactivo de transfección | Sigma Aldrich | #6366236001 |
Referencias
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast cancer treatment: A review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Jin, X., Mu, P. Targeting breast cancer metastasis. Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, Suppl 1 23-34 (2015).
- Saha, D., et al.
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