Artículo de método

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

DOI:

10.3791/63062

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16 de diciembre de 2021

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1Division of Gastroenterology & Hepatology, Mayo Clinic, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Mayo Clinic

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Resumen

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Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC) son células endoteliales especializadas ubicadas en la interfaz entre la circulación y el parénquima hepático. Los LSEC tienen una morfología distinta caracterizada por la presencia de fenestras y la ausencia de membrana basal. Los LSEC desempeñan un papel esencial en muchos trastornos patológicos en el hígado, incluida la desregulación metabólica, la inflamación, la fibrosis, la angiogénesis y la carcinogénesis. Sin embargo, poco se ha publicado sobre el aislamiento y la caracterización de los LSEC. Aquí, este protocolo discute el aislamiento de LSEC de ratones sanos y sin enfermedad del hígado graso (NAFLD). El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y perlas magnéticas de selección positiva de células no pares para purificar LSEC. Este estudio caracteriza los LSEC utilizando marcadores específicos por citometría de flujo e identifica las características fenotípicas características mediante microscopía electrónica de barrido. Los LSEC aislados siguiendo este protocolo se pueden utilizar para estudios funcionales, incluidos ensayos de adhesión y permeabilidad, así como estudios posteriores para una vía particular de interés. Además, estos LSEC se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos, incluida la generación de datos RNA-seq a granel o unicelular, proteómica o fosfoprotómica, y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq), entre otros. Este protocolo será útil para los investigadores que estudian la comunicación de los LSEC con otras células hepáticas en la salud y la enfermedad y permitirá una comprensión profunda del papel de los LSEC en los mecanismos patógenos de la lesión hepática aguda y crónica.

Introducción

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Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSAC) recubren las paredes sinusoides hepáticas y son las células no parenquimatosas más abundantes en el hígado1. Los LSEC se distinguen de otras células endoteliales capilares en otras partes del cuerpo por la presencia de fenestras y la falta de una membrana basal clásica o un diafragma 2,3. Por lo tanto, los LSEC poseen características fenotípicas y estructurales distintivas que mejoran su permeabilidad y capacidad endocítica para eliminar una variedad de macromoléculas circulantes, incluidos los lípidos y las lipoproteínas. Los LSEC desempeñan un papel fundamental en la diafonía entre las células parenquimatosas y no parenquimatosas, como las células estrelladas y las células inmunes. Los LSEC son clave para mantener la homeostasis hepática al mantener las células estrelladas y las células de Kupffer en un estado de reposo4. Los LSEC modulan la composición de las poblaciones de células inmunes hepáticas mediando la adhesión y la migración transendotelial de los leucocitos circulantes 5,6. Durante la lesión hepática aguda y crónica 7, incluidala lesión por isquemia-reperfusión (IRI)8, la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA)9 y el carcinoma hepatocelular (CHC), los LSEC experimentan cambios fenotípicos conocidos como capilarización caracterizados por la defenestración y la formación de la membrana basal10. Estos cambios fenotípicos en los LSEC están asociados con la disfunción de los LSEC y la adquisición de propiedades protrombóticas, proinflamatorias y profibrogénicas.

Se han desarrollado varios métodos para el aislamiento de LSECs del hígado de ratón11. Algunas técnicas dependen de la separación de células no parenquimatosas y parenquimatosas seguidas de centrifugación por gradiente de densidad para purificar los LSEC de las fracciones no paresquimatosas. La limitación de este método es la presencia de macrófagos contaminantes en los pasos finales del aislamiento de LSECs, lo que podría afectar la pureza de los LSECs aislados12. Este protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y en la selección positiva de perlas magnéticas CD146+ de células no paresquimatosas para purificar LSAC. Los LSEC aislados utilizando este método muestran alta pureza y conservan morfología y viabilidad. Estos LSEC son óptimos para estudios funcionales, incluidos los ensayos de permeabilidad y adhesión, así como para estudios posteriores para vías de interés. Además, con el creciente interés en generar grandes conjuntos de datos tanto en la investigación clínica como en la ciencia del descubrimiento, estos LSEC de alta calidad aislados de hígados sanos y enfermos con esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) u otras afecciones se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos y la comparación entre la salud y la enfermedad13,14 . Además, los LSEC aislados se pueden emplear para desarrollar modelos bidimensionales y tridimensionales in vitro como organoides para descifrar la vía de señalización activada en LSEC y su comunicación intercelular con otras células hepáticas bajo diferentes estímulos nocivos y en respuesta a diversas intervenciones terapéuticas.

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Protocolo

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Los protocolos con animales se llevaron a cabo según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Mayo Clinic. Los ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad fueron comprados en el Laboratorio Jackson. Los ratones fueron alojados en una instalación de ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con temperatura controlada con acceso gratuito a la dieta.

1. Preparación de un plato o plato de cultivo recubierto de colágeno

  1. Para producir 50 ml de ácido acético de 0,02 mol/L, añadir 0,6 ml de ácido acético glacial a 49,4 ml de H2O.
  2. Hacer 50 μg/ml de colágeno tipo I en ácido acético 0.02 mol/L. La dilución depende de la concentración del lote.
  3. Cubra los platos de cultivo de 10 cm con 3 ml de solución de colágeno. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
    NOTA: Cuando se utiliza un plato o plato diferente para el cultivo, el volumen de la solución de recubrimiento debe ajustarse en función del área de cultivo, generalmente use 6-10 μg / cm2.
  4. Retire el exceso de líquido de la superficie recubierta y lávese con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 3 veces. Deje que los platos se sequen al aire.
  5. Si la solución de colágeno no es estéril, esterilice los platos recubiertos de colágeno mediante la exposición a la luz ultravioleta (UV) durante 10 minutos en una campana de cultivo de tejidos estériles.

2. Configuración del equipo

  1. Configure el aparato de perfusión de recirculación calentado y humidificado como se muestra en la Figura 1B.
  2. Enjuague el sistema de perfusión con lejía al 10% durante 5 minutos, seguido de agua estéril durante otros 10 minutos.
  3. Escurra el líquido de enjuague tanto como sea posible antes de perfundir la solución de colagenasa.
  4. Infundir solución de colagenasa a través del sistema de perfusión (como se muestra en la Figura 1B) para precalentarla a 37 °C. Ajuste la velocidad de la bomba a la velocidad 1 como se muestra en el dial de control de velocidad (igual a 40 ml/min).
  5. Mantenga esta velocidad igual durante todo el procedimiento. Reutilizar la solución de colagenasa en circuito cerrado durante el día del aislamiento de LSEC.
    NOTA: La velocidad de la bomba se fija en 1 para evitar la presión mecánica que podría perturbar la condición biológica de LSEC.

3. Procedimiento quirúrgico

  1. Pesa el ratón.
  2. Inyecte 90 mg/kg de peso corporal de ketamina y 10 mg/kg de peso corporal de xilazina por vía intraperitoneal (IP).
  3. Una vez que el ratón no sea reactivo a los estímulos dolorosos, asegure el ratón a la superficie quirúrgica, como se muestra en la Figura 1B.
  4. Rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%. Usando tijeras quirúrgicas, haga una incisión de ~ 5 cm de largo a partir de la parte inferior del abdomen hasta el proceso xifoide.
  5. A continuación, haga dos cortes laterales con pequeñas tijeras de iris a cada lado del abdomen para exponer completamente los órganos abdominales.
  6. Coloque la vaina del catéter intravenoso (IV) debajo de la espalda del animal para levantar y nivelar el abdomen.
  7. Usando un apósito curvo regular, tire suavemente de los intestinos y el estómago hacia la izquierda del animal.
  8. Coloque una sutura quirúrgica 5-0 debajo de la vena cava inferior (IVC) justo debajo del riñón izquierdo expuesto. Ata un enganche suelto en la sutura.
  9. Coloque otra sutura quirúrgica 5-0 alrededor de la vena porta hepática (PV) justo encima del punto de ramificación de la vena esplénica fuera de la PV hepática. Ata un enganche suelto en la sutura.
  10. Usando la sutura PV como tensión, inserte el catéter 20 G IV en el PV hepático 1 cm por debajo de donde se ramifica a la PV hepática derecha e izquierda.
  11. Deslice el catéter por la vena, pero manténgalo debajo del área de ramificación. Permita que la sangre viaje por el catéter hasta que comience a gotear.
  12. Con parte del tampón A (Tabla 1) en un frasco intravenoso (IV) colocado sobre el área quirúrgica, use una línea IV y conéctela al catéter. Enjuague el hígado con esta solución mientras evita la entrada de aire en el sistema.
  13. Ate la sutura alrededor de la vena cava inferior debajo del riñón. Esto permitirá que el hígado retrofunda la perfusión.
  14. Corte el IVC debajo de la sutura para permitir que el animal se desangre.
    NOTA: Este paso debe realizarse rápidamente para evitar la congestión del hígado.
  15. Asegure el catéter intravenoso con la sutura PV.
  16. Una vez perfundido, corte el estómago, los intestinos, el bazo y otras entrañas adheridas al hígado.
  17. Corte el diafragma y los vasos principales de la cavidad torácica. Retire el hígado del animal y colóquelo en la bandeja de perfusión.
  18. Retire con cuidado la línea IV y conecte la solución de colagenasa en la cámara de recirculación.
    NOTA: Los pasos 3.16-3.18 deben realizarse dentro de los 5 minutos, para que el hígado no se perfunda demasiado tiempo con Buffer A. Tenga mucho cuidado de no permitir que entren burbujas de aire en el hígado.
  19. Permita que el hígado se perfunda hasta que la cápsula se motee y aparezca blanda (10-15 minutos o más, el período varía según los diferentes lotes de colagenasa).
  20. Mientras el hígado está en perfusión, asegúrese de que el animal haya fallecido antes de desecharlo en una bolsa de necropsia.
  21. Una vez digerido, retire el hígado de la cámara y colóquelo en una placa de Petri de 10 cm con aproximadamente 20 ml de Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco sin suero.
  22. Separe suavemente el hígado con un par de puntas de pipeta y deseche el árbol biliar.
  23. Filtre la suspensión hepática a través de un colador celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml.
  24. Centrifugar la suspensión celular a 50 x g durante 2 min en RT. Recoger el sobrenadante que contiene células hepáticas no parenquimatosas.
    NOTA: Los hepatocitos se precipitan en el pellet, que se puede purificar aún más mediante centrifugación por gradiente como se describió anteriormente15.

4. Separación de células hepáticas no paresquimatosas y purificación de LSEC

NOTA: Purifique los LSEC CD146+ utilizando las perlas inmunomagnéticas, siguiendo las instrucciones del fabricante.

  1. Centrifugar el sobrenadante a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
  2. Recoja el pellet de celda y vuelva a suspenderlo en 1 ml de tampón de aislamiento (Tabla 1), determine el número de celda utilizando un contador de celda automático siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C, aspirar el sobrenadante por completo.
  4. Resuspend el pellet con 90 μL de tampón de aislamiento por 107 células totales.
  5. Añadir 10 μL de perlas magnéticas CD146 por cada 107 células totales. Mezclar bien e incubar durante 15 min a 4 °C.
  6. Para lavar las células, agregue 1-2 ml de tampón de aislamiento por cada 107 células, centrífuga a 300 x g durante 10 minutos y luego aspire el sobrenadante por completo.
  7. Resuspendir hasta 109 celdas en 500 μL de tampón de aislamiento (Tabla 1).
    NOTA: Para números de celda más altos, escale el volumen del búfer en consecuencia.
  8. Prepare la columna de separación, enjuáguela con 3 ml de tampón de aislamiento.
  9. Aplique la suspensión de celda sobre la columna apilada con filtros de preseparación de 70 μm.
  10. Lave la columna con los 3 ml de tampón de aislamiento 3 veces.
    NOTA: Al lavar la columna, el búfer de aislamiento debe agregarse tan pronto como el depósito de la columna esté vacío.
  11. Retire la columna del separador y colóquela sobre un tubo centrífugo de 15 ml. Pipeta 5 ml de tampón de aislamiento sobre la columna.
  12. Para recuperar las células marcadas con cuentas magnéticas, empuje firmemente el émbolo hacia la columna para eliminar las células.
  13. Centrífuga a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Los LSEC están listos para el examen microscópico y el análisis posterior.

5. Inmunofenotipificación de LSEC y evaluación de la pureza por citometría de flujo

  1. Determine los números de celda de los LSEC aislados utilizando un contador de celdas automático siguiendo las instrucciones del fabricante.
  2. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min, aspirar el sobrenadante por completo.
  3. Tomar 1 x 106 células/tubo y resuspend con 90 μL de tampón de tinción (Tabla 1).
  4. Añadir 10 μL/tubo de bloque FcR de ratón y 1 μL de colorante de viabilidad, incubar a 4 °C durante 10 min.
  5. Mante las células con una combinación de anticuerpos CD45, CD146 y estabilina-2 diluidos a 1:50 con tampón de tinción. Incubar a 4 °C durante 20 min.
  6. Lave las células con 5 ml de tampón de tinción y centrífuga a 300 x g durante 10 min, luego aspire el sobrenadante por completo.
  7. Resuspend las células con 300 μL de tampón de tinción y correr a través del citómetro de flujo.

6. Cultura y examen de LSECs

  1. Sembrar 1 x 106 células/pocillo en una placa de 6 pocillos y cultivarlo con medio de crecimiento de células endoteliales que consiste en 5% de suero fetal bovino (FBS), 1% de suplemento de crecimiento de células endoteliales y solución de primocina al 1%.
  2. Examinar los LSEC aislados mediante microscopía de luz. Adquiera imágenes de campo brillante con un aumento de 10x.

7. Examen de morfología y fenestra de LSECs mediante microscopía electrónica de barrido

  1. Cubra previamente los insertos de cultivo celular (tamaño de poro de 3 μm) con solución de colágeno.
  2. Cultivo aislado de LSEC (120.000 células) en el inserto con medio de crecimiento de células endoteliales en una placa de 24 pocillos a 37 °C atmósfera cálida y humidificada. Deje que las células se asienten y se adhieran durante 2 h.
  3. Para la fijación celular, agregue un volumen equivalente de fijador de Trump precalentado a 37 ° C a los medios de cultivo celular.
  4. Después de la incubación durante 10 minutos, reemplace el fijador de Trump diluido al 50% con el fijador de Trump sin diluir.
  5. Fije las células en el fijador Trump durante 2 h, luego incube durante 1 h en tetróxidos de osmio al 1%.
  6. Proceda con la deshidratación de las muestras, el secado en un dispositivo de secado de punto crítico, el montaje, el recubrimiento por pulverización y el examen con un microscopio electrónico de barrido.

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Resultados

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Esquemas experimentales y configuración de equipos:
En este protocolo, el hígado de ratón se digirió utilizando un circuito de perfusión cerrado, luego las células no parentales y los hepatocitos se separaron mediante centrifugación de baja velocidad a 50 x g durante 2 min. Los LSEC primarios se aislaron utilizando la selección de perlas magnéticas CD146 de la fracción no parnquimatosa. Los esquemas experimentales se muestran en la Figura 1A. La cánula se colocó ...

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Discusión

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En el manuscrito actual, describimos un protocolo para el aislamiento de LSEC del hígado de ratón que consiste en la perfusión de colagenasa de dos pasos y la posterior clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este protocolo consta de los siguientes tres pasos: (1) Perfusión a través del PV con un tampón libre de calcio seguido de un tampón que contiene colagenasa para lograr la dispersión de las células hepáticas; (2) Exclusión de hepatocitos con centrifugación de baja velocidad; y (3) selección positiva ba...

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Divulgaciones

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Todos los autores no tienen conflictos que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales de los NIH (1RO1DK122948 a SHI) y el mecanismo de subvención P30 de los NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers (DK084567). La Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) también prestó apoyo a KF en las becas de investigación en el extranjero. También nos gustaría reconocer al Dr. Gregory J. Gores y Steven Bronk por su diseño original y optimización del aparato de perfusión de colagenasa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Catéter intravenoso (IV) de 2,0 pulgadas y 20 gTerumo, SOmerset, NJ, EE. UUSR-OX2051CA
2– Bandeja de perfuion de 3 pulgadas con un orificio en el centropersonalizada; hecho en casa
Tinte de viabilidad 405/520Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-110-205
pinza de vendaje curva regular de 4 pulgadasFisher BrandFS16-100-110
5-0 Perma-Hand sutura de sedaEthicon, Raritan, NJ, EE. UUA182H
Anti-stabilin-2 (Ratón) mAb-Alexa Fluorà 488MBL International, Woburn, MA, EE. UU.D317-A48
Acciones de BSAMiltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-ratónMiltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, ratónMiltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-ratónMiltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-110-803
Colágeno tipo ICorning, Corning, Nueva York, EE. UU.354236
Colagenasa IIGibco, Waltham, MA, EE. UU. 17101-015
Medio de crecimiento de células endotelialesScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EE. UU.de bloqueo 211-500
FcR, ratónMiltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-092-575
Software FlowJo, versión 10.6Becton, Dickinson and Company
Tijeras finas endurecidasF.S.T, Foster city, CA, EE. UU. 14091-11
Calefactadas (37 ° C) y aparato de perfusión recirculante humidificado equipado con inyección de oxígeno a una velocidad de 10 psi.hecho en casa
Microscopio electrónico de barrido Hitachi S 4700Hitachi Inc, Pleasanton, CA, EE. UUColumnas SEM096
LSMiltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-042-401
Filtros de preseparación MACS (70 μ m)Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-095-823
Tampón de enjuague MACSMiltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μ m)Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania130-098-462
MACSQuntímetro de flujoMiltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania
Inserto de cultivo celular de milicélulasMillipore Sigma, Burlington, MA, EE. UUPITP01250
Contador de células Nexcelom Nexcelombioscience, Lawrence, MA, EE. UUCelómetro Auto T4 Plus
PercollGE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU.17-0891-01
Tijeras quirúrgicasF.S.T, Foster city, CA, EE. UU.14001-12
Pinzas de vendaje curvo muy pequeñasF.S.T, Foster city, CA, EE. UU11063-07
. . Reactivo . . . .

Referencias

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  1. Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
  2. Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
  3. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  4. Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
  5. Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
  6. Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
  7. DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
  8. Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
  9. Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395(2020).
  10. Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
  11. Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945(2016).
  12. Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
  13. Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
  14. Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
  15. Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599(2013).
  16. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  17. Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284(2021).
  18. DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
  19. DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
  20. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  21. Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649(2019).
  22. Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
  23. Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
  24. Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
  25. Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
  26. Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
  27. Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060(2015).
  28. Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
  29. Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
  30. Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
  31. Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356(2017).
  32. Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).

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LSEC IsolationCollagenase PerfusionMagnetic Bead SelectionFlow CytometryScanning Electron MicroscopyNonparenchymal Cell PurificationCD146 MarkerStabilin 2 MarkerIntercellular Communication

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