Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.
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Artículo de método
Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC) son células endoteliales especializadas ubicadas en la interfaz entre la circulación y el parénquima hepático. Los LSEC tienen una morfología distinta caracterizada por la presencia de fenestras y la ausencia de membrana basal. Los LSEC desempeñan un papel esencial en muchos trastornos patológicos en el hígado, incluida la desregulación metabólica, la inflamación, la fibrosis, la angiogénesis y la carcinogénesis. Sin embargo, poco se ha publicado sobre el aislamiento y la caracterización de los LSEC. Aquí, este protocolo discute el aislamiento de LSEC de ratones sanos y sin enfermedad del hígado graso (NAFLD). El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa del hígado de ratón y perlas magnéticas de selección positiva de células no pares para purificar LSEC. Este estudio caracteriza los LSEC utilizando marcadores específicos por citometría de flujo e identifica las características fenotípicas características mediante microscopía electrónica de barrido. Los LSEC aislados siguiendo este protocolo se pueden utilizar para estudios funcionales, incluidos ensayos de adhesión y permeabilidad, así como estudios posteriores para una vía particular de interés. Además, estos LSEC se pueden agrupar o utilizar individualmente, lo que permite la generación de datos multiómicos, incluida la generación de datos RNA-seq a granel o unicelular, proteómica o fosfoprotómica, y el ensayo de cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq), entre otros. Este protocolo será útil para los investigadores que estudian la comunicación de los LSEC con otras células hepáticas en la salud y la enfermedad y permitirá una comprensión profunda del papel de los LSEC en los mecanismos patógenos de la lesión hepática aguda y crónica.
Introducción
Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSAC) recubren las paredes sinusoides hepáticas y son las células no parenquimatosas más abundantes en el hígado1. Los LSEC se distinguen de otras células endoteliales capilares en otras partes del cuerpo por la presencia de fenestras y la falta de una membrana basal clásica o un diafragma 2,3. Por lo tanto, los LSEC poseen características fenotípicas y estructurales distintivas que mejoran su permeabilidad y capacidad endocítica para eliminar una variedad de macromoléculas circulantes, incluidos los lípidos y las lipoproteínas. Los LSEC ....
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Protocolo
Los protocolos con animales se llevaron a cabo según lo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Mayo Clinic. Los ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad fueron comprados en el Laboratorio Jackson. Los ratones fueron alojados en una instalación de ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h con temperatura controlada con acceso gratuito a la dieta.
1. Preparación de un plato o plato de cultivo recubierto de colágeno
- Para producir 50 ml de ácido acético de 0,02 mol/L, añadir 0,6 ml de ácido acético glacial a 49,4 ml de H2O.
- Hacer 50 μg/ml de colágeno tipo I e....
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Resultados
Esquemas experimentales y configuración de equipos:
En este protocolo, el hígado de ratón se digirió utilizando un circuito de perfusión cerrado, luego las células no parentales y los hepatocitos se separaron mediante centrifugación de baja velocidad a 50 x g durante 2 min. Los LSEC primarios se aislaron utilizando la selección de perlas magnéticas CD146 de la fracción no parnquimatosa. Los esquemas experimentales se muestran en la Figura 1A. La cánula se colocó .......
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Discusión
En el manuscrito actual, describimos un protocolo para el aislamiento de LSEC del hígado de ratón que consiste en la perfusión de colagenasa de dos pasos y la posterior clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Este protocolo consta de los siguientes tres pasos: (1) Perfusión a través del PV con un tampón libre de calcio seguido de un tampón que contiene colagenasa para lograr la dispersión de las células hepáticas; (2) Exclusión de hepatocitos con centrifugación de baja velocidad; y (3) selección positiva ba.......
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Divulgaciones
Todos los autores no tienen conflictos que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales de los NIH (1RO1DK122948 a SHI) y el mecanismo de subvención P30 de los NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers (DK084567). La Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) también prestó apoyo a KF en las becas de investigación en el extranjero. También nos gustaría reconocer al Dr. Gregory J. Gores y Steven Bronk por su diseño original y optimización del aparato de perfusión de colagenasa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Catéter intravenoso (IV) de 2,0 pulgadas y 20 g | Terumo, SOmerset, NJ, EE. UU | SR-OX2051CA | |
| 2– Bandeja de perfuion de 3 pulgadas con un orificio en el centro | personalizada; hecho en casa | ||
| Tinte de viabilidad 405/520 | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-110-205 | |
| pinza de vendaje curva regular de 4 pulgadas | Fisher Brand | FS16-100-110 | |
| 5-0 Perma-Hand sutura de seda | Ethicon, Raritan, NJ, EE. UU | A182H | |
| Anti-stabilin-2 (Ratón) mAb-Alexa Fluorà 488 | MBL International, Woburn, MA, EE. UU. | D317-A48 | |
| Acciones de BSA | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-091-376 | |
| Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-ratón | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-118-407 | |
| CD146 (LSEC) MicroBeads, ratón | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-092-007 | |
| Anti-CD45-Viogreen, anti-ratón | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-110-803 | |
| Colágeno tipo I | Corning, Corning, Nueva York, EE. UU. | 354236 | |
| Colagenasa II | Gibco, Waltham, MA, EE. UU | . 17101-015 | |
| Medio de crecimiento de células endoteliales | ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, EE. UU. | de bloqueo 211-500 | |
| FcR, ratón | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-092-575 | |
| Software FlowJo, versión 10.6 | Becton, Dickinson and Company | ||
| Tijeras finas endurecidas | F.S.T, Foster city, CA, EE. UU | . 14091-11 | |
| Calefactadas (37 ° C) y aparato de perfusión recirculante humidificado equipado con inyección de oxígeno a una velocidad de 10 psi. | hecho en casa | ||
| Microscopio electrónico de barrido Hitachi S 4700 | Hitachi Inc, Pleasanton, CA, EE. UU | Columnas SEM096 | |
| LS | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-042-401 | |
| Filtros de preseparación MACS (70 μ m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-095-823 | |
| Tampón de enjuague MACS | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-091-222 | |
| MACS Smart Strainer (70 μ m) | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | 130-098-462 | |
| MACSQuntímetro de flujo | Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania | ||
| Inserto de cultivo celular de milicélulas | Millipore Sigma, Burlington, MA, EE. UU | PITP01250 | |
| Contador de células Nexcelom Nexcelom | bioscience, Lawrence, MA, EE. UU | Celómetro Auto T4 Plus | |
| Percoll | GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU. | 17-0891-01 | |
| Tijeras quirúrgicas | F.S.T, Foster city, CA, EE. UU. | 14001-12 | |
| Pinzas de vendaje curvo muy pequeñas | F.S.T, Foster city, CA, EE. UU | 11063-07 |
Referencias
- Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
- Ibrahim, S. H.
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Reimpresiones y permisos
