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Artículo de método

Un modelo de xenoinjerto sin etiquetas para investigar el comportamiento de los esferoides de células madre humanas en embriones de pollo

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DOI:

10.3791/63067

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15 de octubre de 2021

 , 
1Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un método para trasplantar e identificar esferoides de células humanas en embriones de pollo. Este modelo de xenoinjerto utiliza el microambiente embrionario como fuente de señales instructivas para analizar la migración, la diferenciación y el tropismo celular, y es especialmente adecuado para el estudio de poblaciones celulares primarias y/o heterogéneas.

Resumen

Los xenoinjertos son métodos valiosos para investigar el comportamiento de las células humanas in vivo. En particular, el entorno embrionario proporciona pistas para la migración, diferenciación y morfogénesis de las células, con señales instructivas únicas y la identidad de la capa germinal que a menudo están ausentes en los modelos de xenoinjertos adultos. Además, los modelos embrionarios no pueden discriminar tejidos propios y no propios, lo que elimina el riesgo de rechazo del injerto y la necesidad de inmunosupresión del huésped. En este trabajo se presenta una metodología para el trasplante de esferoides de células humanas en embriones de pollo, que son accesibles, susceptibles de manipulación y se desarrollan a 37 °C.

Los esferoides permiten seleccionar una región específica del embrión para el trasplante. Después de ser injertadas, las células se integran en el tejido del huésped, lo que permite el seguimiento de su migración, crecimiento y diferenciación. Este modelo es lo suficientemente flexible como para permitir la utilización de diferentes poblaciones adherentes, incluidas poblaciones heterogéneas de células primarias y células cancerosas. Para evitar la necesidad de un marcaje celular previo, también se describe un protocolo para la identificación de células donantes a través de la hibridación de sondas de Alu específicas para humanos, que es particularmente importante cuando se investigan poblaciones celulares heterogéneas. Además, las sondas de ADN se pueden adaptar fácilmente para identificar otras especies donantes. Este protocolo describirá los métodos generales para la preparación de esferoides, el injerto en embriones de pollo, la fijación y el procesamiento de tejido para el corte de parafina y, finalmente, la identificación de las células humanas mediante hibridación in situ de ADN. Se discutirán los controles sugeridos, los ejemplos de interpretación de los resultados y los diversos comportamientos celulares que se pueden ensayar, además de las limitaciones de este método.

Introducción

Los xenoinjertos son herramientas útiles para investigar el comportamiento de las células humanas in vivo. Estos modelos han proporcionado información invaluable para una amplia gama de temas científicos, como la biología de las células madre humanas1, la observación de eventos celulares en tiempo real2 y la investigación de la angiogénesis tumoral y la metástasis3. Además, se han estudiado varios aspectos de la biología del cáncer, incluyendo la tumorigénesis de xenoinjertos específicos del paciente 4,5. Cada uno de estos modelos de xenoinjertos tiene sus ventajas y desventajas y, por lo tanto, cada uno es más adecuado para preguntas científicas específicas. Los embriones de pollo son un modelo popular de biología del desarrollo, ya que son un modelo de amniota accesible que es susceptible de manipulación quirúrgica. Los injertos heterólogos han permitido a los investigadores crear mapas de destino precisos6 o explorar si un rasgo es autónomo de la célula o está instruido por el entorno 7,8. Un razonamiento similar permite que el embrión de pollo se utilice como modelo de xenoinjerto para estudiar el comportamiento de las células humanas.

El entorno embrionario orquesta activamente la morfogénesis del tejido con señales de migración y diferenciación, así como interacciones célula-célula. Por lo tanto, en comparación con los modelos de xenoinjertos adultos, el embrión proporciona un entorno más instructivo para analizar el comportamiento de las células injertadas, por ejemplo, imitando las señales presentes en los nichos de células madre adultas (por ejemplo, BMP, WNT, NOTCH y SHH9). Además, la ausencia de un sistema inmune adaptativo durante el desarrollo temprano permite que los xenoinjertos se realicen sin el riesgo de una respuesta inmune o rechazo del tejido donante10. Estudios anteriores han investigado xenoinjertos de células humanas en embriones de pollo con este propósito. El potencial neurogénico de las células madre humanas se ha analizado después de la inyección en el tubo neural o en los vasos sanguíneos11 , además de la integración de las células madre embrionarias12 y las células madre pluripotentes inducidas13 en el embrión. También se han estudiado células de melanoma humano utilizando el entorno embrionario del pollito, que reveló vínculos entre su tumorigénesis y el comportamiento de las células de la cresta neural14, así como la reprogramación de las células tumorales con la información del embrión15. En este trabajo se describe un protocolo especialmente adecuado para estudiar el comportamiento de poblaciones humanas de células primarias y heterogéneas.

En las últimas décadas, el componente estromal de diversos tejidos ha sido estudiado como fuente autóloga de células progenitoras/madre y por sus propiedades proangiogénicas e inmunorreguladoras, anteriormente conocidas como "células madre mesenquimales"16,17,18. La primera de estas poblaciones celulares en ser caracterizada fue la población de células madre y estromas de médula ósea (BMSC), que tienen potencial osteo-, adipo- y, en menor medida, condrogénico in vivo19,20. Las células estromales derivadas del tejido adiposo (ADSC) son una población heterogénea obtenida por digestión enzimática de las muestras de lipoaspirado o dermolipectomía, seguida del aislamiento de la fracción estromal-vascular (SVF) y finalmente de la expansión en cultivo21. En cultivo, estas células se caracterizan fenotípicamente por marcadores compartidos con otras poblaciones mesenquimales, como CD90, CD73, CD105 y CD44, marcadores únicos como CD36 y la ausencia de marcadores hematopoyéticos (CD45) o endoteliales (CD31)22. Además, las ADSC tienen potencial osteo, adipo y condrogénico in vitro, y el número de células madre/progenitoras en esta población puede definirse mediante el ensayo de la unidad formadora de colonias de fibroblastoides (UFC-F)22. In vivo, se ha reportado la existencia de células con el fenotipo ADSC en los compartimentos del estroma23 y/o perivascular24. Cada vez está más claro que, a pesar de compartir marcadores tras el cultivo in vitro, el compartimento estromal de los diferentes tejidos refleja características intrínsecas de un determinado órgano, y estas poblaciones celulares tienen propiedades distintas en función de su origen 17,25,26,27. Además, como estas células se aíslan en función de su adhesión a una placa de cultivo celular, pueden estar compuestas por células de diversas capas germinales28. Por lo tanto, el empleo de un método de xenoinjerto para estudiar el potencial de diferenciación y el tropismo de las células estromales de una manera imparcial puede proporcionar información valiosa sobre estas poblaciones celulares para guiar el desarrollo de futuras terapias celulares.

El protocolo descrito aquí (Figura 1) es un método de xenoinjerto que aprovecha el bajo costo y la facilidad de manipulación de los embriones de pollo. Se ha utilizado previamente para estudiar el comportamiento de ADSC29 humano, fibroblastos de piel29, células estromales derivadas de la sangre menstrual30 y células de glioblastoma31. Este método incluirá el trasplante de células como esferoides32, que pueden ser preparadas a partir de cualquier población de células adherentes (Figura 2). También se describirán los procedimientos quirúrgicos y la preparación de materiales quirúrgicos a medida, como los microbisturíes y los capilares de vidrio (Figura 3). Las células humanas se detectan en cortes histológicos mediante hibridación de sondas Alu específicas para humanos (Figura 4), eliminando así la necesidad de un marcaje previo de las células injertadas. Los resultados representativos describen el comportamiento de las ADSC humanas injertadas tanto en la región somítica a nivel de la yema del ala (Figura 5, Figura 6 y Figura 7) como en el primer arco faríngeo (Figura 8), así como de los esferoides de glioblastoma primario humano injertados en el prosencéfalo (Figura 8). Se describirá la migración celular, la diferenciación y la interacción con los tejidos embrionarios de pollo, así como los ensayos sugeridos para investigar más a fondo el comportamiento celular mediante la tinción conjunta o la tinción de secciones adyacentes.

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Protocolo

Todos los procedimientos in vivo utilizados en este estudio cumplieron con todas las directrices experimentales relevantes para la experimentación e investigación con animales, de acuerdo con las directrices brasileñas de uso de animales experimentales (L11794). Los protocolos utilizados para el manejo de embriones de pollo fueron aprobados por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales en la Experimentación Científica (Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Federal de Río de Janeiro). El uso de células humanas fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario Clementino Fraga Filho (números 043/09 y 088/04). Se utilizaron huevos libres de patógenos específicos (SPF) de pollo Leghorn blanco (Gallus gallus).

1. Preparación de esferoides celulares

NOTA: Los esferoides celulares se pueden preparar con una amplia gama de tipos de celdas siempre que sean adherentes. Para este protocolo, se aislaron células estromales derivadas del tejido adiposo humano (ADSC) como se describió anteriormente21,27 (Figura 2A). Las células se obtuvieron digiriendo fragmentos de tejido adiposo o lipoaspirados con colagenasa IA durante 1 h a 37 °C bajo agitación, seguido de siembra a 1−2 × 104 células/cm2 e incubación durante la noche. Las células no adherentes se descartaron y las células adherentes se expandieron de 3 a 6 pasajes. Las ADSC fueron homogéneas para la expresión de los antígenos de superficie CD105, CD90, CD13 y CD44 y negativas para los antígenos hematopoyéticos CD45, CD14, CD34, CD3 y CD1927. Si bien el método descrito aquí se puede realizar fácilmente con materiales mínimos más allá de los que se usan habitualmente para el cultivo celular, el tiempo de agregación óptimo y la necesidad de disociación parcial deben determinarse empíricamente. Pueden emplearse métodos alternativos para la preparación de esferoides celulares, como el método de la gota colgante33 o los pocillos recubiertos de agarosa34; Consulte la discusión para obtener más detalles. Todos los procedimientos deben realizarse en un banco limpio empleando técnicas asépticas.

  1. Calentar PBS estéril (solución salina tamponada con fosfato), medio de cultivo y solución de tripsina a 37 °C antes de la manipulación celular.
  2. Cultivo de ADSCs en DMEM a baja glucosa suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina. Utilice un matraz confluente de 25cm2 de ADSC para la preparación de dos placas de esferoides. Deseche el medio de cultivo y lave la placa de cultivo tres veces con una cantidad adecuada de PBS estéril (5 mL de PBS por cada lavado si se utiliza un matraz de cultivo celular de25 cm2 ).
  3. Añada suficiente solución de tripsina (que contenga 0,78 mM de EDTA) para cubrir las células (1 mL de solución de tripsina si se utiliza un matraz de cultivo de25 cm2) y deje reposar el matraz de cultivo durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Pipetea suavemente las células hacia arriba y hacia abajo para disociarlas. Agregue la misma cantidad de medio de cultivo que contenga FBS para inactivar la tripsina y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL.
  5. Centrifugar durante 10 min a 180 × g. Deseche el sobrenadante y golpee el tubo para aflojar el pellet.
  6. Vuelva a suspender las células en 500 μL-2 mL de medio de cultivo adecuado para el tipo de célula (ver paso 1.2).
    NOTA: La concentración mínima es de 5 × 105 células/mL para las células adherentes como las ADSC y los fibroblastos. Un matraz confluente de 25cm2 de ADSC debe resuspenderse en 2 mL de medio y cubrirse en 2 placas de Petri, utilizando 1 mL cada una. Las células menos adheridas, como la glía, pueden beneficiarse de la siembra a ~2 × 106 células/mL en un volumen menor.
  7. Transfiera con cuidado la suspensión celular a un lado de una placa de Petri estéril de 60 mm (sin recubrimiento y sin tratar, como las que se usan para preparar placas de agar). Trate de restringir el medio de cultivo al área más pequeña posible (Figura 1B) apoyando el plato sobre un trozo de gasa limpia y doblada para mantenerlo inclinado en la incubadora.
  8. Incubar la suspensión celular a 37 °C, 5% CO2, hasta que se formen los agregados celulares (6-8 h después de sembrar los ADSC).
    NOTA: El tiempo de agregación de esferoides puede variar según el tipo de célula.
  9. Si es necesario (consulte la discusión), disocie parcialmente los agregados de células grandes pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con puntas de 1000 μL. Disociar los esferoides ADSC 6-8 h después del recubrimiento.
  10. Coloque la placa en la incubadora hasta que los esferoides estén listos para ser trasplantados: redondos con bordes definidos y que no se dispersen fácilmente (Figura 1C, D).
    NOTA: Los esferoides ADSC están listos 2 días después de la disociación parcial.

2. Trasplante de esferoides en embriones de pollo

  1. Preparación
    1. Preparar los huevos de gallina incubando 15-30 huevos en una incubadora húmeda a 37,5 °C hasta alcanzar la etapa deseada de Hamburger-Hamilton (HH)35: 40-45 h para injertos en somitas a nivel de la yema de las extremidades (HH11-12 o 13-19 somitas) o 29-33 h para injertos en la región cefálica (HH8-9 o 5-8 somitas). Coloque los huevos horizontalmente y dibuje una línea con un lápiz en la parte superior de los huevos antes de la incubación (Figura 3D).
      NOTA: Los tiempos de incubación pueden variar ligeramente según las incubadoras individuales. Dibujar una línea asegurará que la parte superior del óvulo, donde se encuentra el embrión, se pueda identificar fácilmente si el óvulo se gira antes del experimento.
    2. Prepare agujas afiladas ("microbisturíes") colocando una aguja de coser en un portaagujas de metal (Figura 3B). Con una piedra de afilar aceitada, afile la aguja hasta que se asemeje a un pequeño bisturí con un borde delgado (Figura 3C). Alternativamente, prepare una aguja de tungsteno afilada por electrólisis36.
    3. Prepare capilares de vidrio con la llama de un mechero Bunsen para derretir brevemente la porción delgada de una pipeta Pasteur de vidrio. Retire la parte fundida de las llamas y estírela para formar un capilar delgado. Divida cuidadosamente el capilar en dos partes rompiéndolo con micropinzas. Prepare un capilar delgado para la inyección de tinta china y un capilar grueso para transferir esferoides (Figura 3B).
      NOTA: Al variar la fuerza de tracción, es posible crear diferentes calibres capilares. Los capilares deben prepararse justo antes de la cirugía.
    4. Prepare la superficie de trabajo y otros materiales para la manipulación de huevos (Figura 3A). Esterilice todo el material quirúrgico en un horno a 100 °C durante la noche o con etanol al 70% inmediatamente antes de su uso. Calentar PBS estéril a 37 °C. Conecte una punta de 200 μL (con barrera) al conjunto del tubo del aspirador para la inyección de tinta china y la transferencia de esferoides.
      NOTA: Utilice puntas con barreras cuando transfiera esferoides de células humanas.
    5. Justo antes del experimento, agregue 2 gotas de solución de tinta china a la placa de Petri de 30 mm y mezcle con 1 ml de PBS estéril. Retire la placa esferoide de la incubadora y colóquela sobre una nevera durante el resto del experimento.
  2. Preparación de cada huevo
    1. Retire un huevo de la incubadora y colóquelo sobre un soporte para huevos. Haga un pequeño agujero en el extremo afilado del huevo (Figura 2D) y aspire 1,5 mL de albúmina con una jeringa y una aguja. Inserte la aguja perpendicular al huevo para evitar dañar la yema de huevo. Sella el agujero con cinta adhesiva. Opcionalmente, repita este paso para todos los huevos antes del experimento y vuelva a incubar el resto de los huevos.
    2. Corta con cuidado una ventana en la parte superior del huevo con unas tijeras (Figura 3D). Con la pipeta, agregue 1-2 gotas de PBS sobre la yema. Si es necesario, retire las burbujas grandes de albúmina (como las que se ven en la Figura 3F) con la pipeta.
    3. Conecte el capilar delgado al conjunto del tubo del aspirador. Llene parcialmente el capilar de vidrio con la solución de tinta china por aspiración. Inyecte suficiente tinta china en la yema debajo del embrión hasta que se vean las estructuras embrionarias (Figura 3E, F).
    4. Usando el microscopio estereoscópico, cuente el número de somitas (Figura 4A). Numere individualmente los huevos con un lápiz (Figura 4B).
  3. Trasplante de esferoides
    1. Identifique la región del injerto: mesodermo paraxial a nivel de layema del ala (mesodermo presomítico delos presuntos somitas 15 a 2037) (Figura 3G y Figura 5A) o presuntiva primera región del arco faríngeo (entre el ectodermo y el endodermo lateral al mesencéfalo posterior/primer rombómero38) (Figura 8A).
    2. Corte la membrana vitelina sobre la región objetivo con un microbisturí.
    3. Con un par de microbisturíes, haga un corte poco profundo en la región donde se implantará el esferoide (Figura 3H).
      NOTA: Evite dañar el endodermo subyacente; De lo contrario, la yema goteará (si esto sucede, deseche el huevo).
    4. Retire el capilar delgado del aspirador y reemplácelo con el capilar grueso. Observe los esferoides bajo el microscopio estereoscópico y elija un esferoide aproximadamente del mismo tamaño que el somita (Figura 2D). Aspire este esferoide en el capilar.
    5. Deposite suavemente el esferoide junto a la región de corte (Figura 3H). Con las agujas afiladas, empuje el esferoide en la región de corte (Figura 3I, J).
    6. Agregue 1-2 gotas de PBS sobre el embrión usando la pipeta para asegurarse de que el esferoide esté firmemente insertado.
      NOTA: Si el injerto se desprende, se debe trasplantar un nuevo esferoide (pasos 2.3.4 y 2.3.5).
    7. Limpie cualquier fuga de albúmina de la cáscara del huevo con papel de seda para asegurarse de que el huevo pueda sellarse por completo, evitando la contaminación. Selle la ventana en el huevo con cinta adhesiva.
    8. Tome nota de la región injertada (Figura 4A). Regrese con cuidado el huevo a la incubadora húmeda a 37,5 °C para evitar que se desprenda el esferoide insertado.
    9. Incubar el huevo hasta la etapa deseada.
      NOTA: Cuando el xenoinjerto se realiza en somitas a nivel de la yema de la extremidad, la migración y la muerte celular se han ensayado con éxito en embriones de 3,5 días de edad (HH21), y se ha observado diferenciación celular y tropismo en embriones de 6 días de edad (HH29) (Figura 5A). La integración en los tejidos del huésped también se ha realizado en embriones de 8 días de edad (HH33). Se han estudiado células de donantes injertadas en el territorio del arco faríngeo en embriones de 4,5 días de edad (HH25) (Figura 8A).

3. Disección de tejidos, fijación, procesamiento y preparación de secciones histológicas

  1. Disección y fijación
    1. Prepare el fijador (al menos 1 mL/embrión): etanol 100%-formaldehído 37%-ácido acético glacial en una proporción de 6:3:1. Limpie la superficie de trabajo, un par de micropinzas, tijeras quirúrgicas o tijeras de iris y una cuchara ranurada. Llene una placa de Petri de vidrio de 60 mm con PBS frío y colóquela bajo un microscopio estereoscópico.
    2. Abre el huevo cortando la cinta adhesiva.
    3. Corta las membranas alrededor del embrión y retíralo con la espumadera.
    4. Transfiere el embrión a la placa de Petri. Si el embrión tiene 5 días de edad (HH26) o más, decapitarlo de inmediato antes de cualquier manipulación ex ovo.
    5. Retire las membranas restantes con micropinzas y tijeras. Agite suavemente la muestra en PBS para lavar las gotas de yema restantes.
    6. Si el xenoinjerto se realizó a nivel del ala, deseche la cabeza. Si se injertaron células en la región cefálica, corte y deseche la mitad inferior del cuerpo, asegurándose de que la región cardíaca se mantenga intacta.
    7. Transfiera cada muestra a un tubo separado de 2.0 mL que contenga 1 mL del fijador. Identifique los tubos individualmente como antes (Figura 4B). Incubarlos durante la noche a 4 °C con agitación.
    8. Utilice una bolita de células o esferoides (Figura 4F) como control positivo. Para ello, centrifugar una suspensión celular (paso 1.5) o esferoides celulares (paso 1.10) a 180 × g durante 10 min en un tubo de 1,5 mL, desechar el medio de cultivo y añadir 1 mL del fijador sin alterar el pellet. Incubar el tubo durante la noche a 4 °C sin agitar, y proceder de la misma manera que para las muestras de pollitos.
  2. Deshidratación e incrustación
    1. Deshidratar los embriones mediante lavados sucesivos de 1 mL de etanol al 70%, 80%, 90% y 100% en 1x PBS durante al menos 1 h cada uno con agitación.
    2. Incubar las muestras durante la noche en 1 mL de etanol 100% a temperatura ambiente con agitación.
    3. Incubar las muestras en 1 mL de xileno al 100% durante 1 h en una campana extractora. Repite dos veces más.
    4. Transfiera el contenido del tubo al bloque de tinción y deseche el xileno. Agregue suficiente parafina fundida para cubrir el embrión y cubra el bloque de tinción con su tapa de vidrio. Incubar durante la noche en un horno a 65 °C.
    5. Prepare una placa caliente y un molde para bloques de parafina para incrustar.
      NOTA: Un par de clips estirados son útiles para colocar el embrión.
    6. Llene el molde con parafina fundida y transfiera el embrión a él. Posicionar el embrión para obtener una sección transversal del tronco (Figura 5A) o una sección coronal de la cabeza (Figura 8A).
    7. Inserte una etiqueta de papel con el nombre en la parafina, opuesta a la superficie que se va a seccionar, para ayudar a cortar el embrión en la orientación correcta (Figura 4C).
    8. Si se está utilizando, coloque el casete de inclusión sobre la muestra. Deje que el bloque se enfríe por completo antes de sacarlo del molde. Alternativamente, conecte el bloque de parafina endurecida al casete u otro soporte de bloque con parafina fundida y deje que se enfríe nuevamente.
  3. Seccionamiento
    1. Prepare los materiales para el seccionamiento. Caliente una placa calefactora a 42 °C y cubra una placa de cartón o espuma de poliestireno con papel de aluminio limpio de aproximadamente 30 cm x 20 cm. Limpie todas las superficies antes de usar.
      NOTA: Utilice guantes para evitar la contaminación con nucleasas, especialmente si algunas secciones se van a utilizar para la hibridación in situ de ARN. Evite usar un baño de histología para estirar las secciones de parafina por la misma razón, a menos que el agua y las superficies se puedan limpiar a fondo de antemano.
    2. Recorta el exceso de parafina con una cuchilla de micrótomo. Cree un bisel en ambos lados, en forma trapezoidal, para facilitar la separación de cada sección con una hoja de bisturí en un paso posterior (Figura 3A).
    3. Conecte el bloque al micrótomo. Coloque el bloque con cuidado para asegurarse de que los lados izquierdo y derecho estén paralelos entre sí. Realice un ajuste más fino después de cortar algunas secciones de la muestra y observarlas bajo un microscopio.
    4. Cuando se haya alcanzado la región objetivo (ya sea la yema de la extremidad o el primer arco faríngeo), corte secciones de 7 μm y coloque las cintas de parafina sobre la placa cubierta con papel de aluminio. Corte toda la región objetivo (Figura 4C).
    5. Para la preparación de secciones en serie, cubra el número adecuado de vasos portaobjetos con gotas de agua desionizada estéril. Transfiera secciones individuales a las diapositivas secuencialmente, usando pinceles y un bisturí. Transfiera las secciones adyacentes a diferentes portaobjetos para crear secciones en serie (Figura 4D). Prepare una serie de 3 portaobjetos para embriones de 3,5 días, 4 portaobjetos para embriones de 4,5 días y 5 portaobjetos para embriones de 6 días. Tiñe las secciones adyacentes con diferentes sondas, anticuerpos o tinciones histológicas clásicas.
      NOTA: La misma serie puede contener múltiples portaobjetos adyacentes si se secciona una gran parte del embrión. Se pueden transferir varias secciones a cada diapositiva, dejando algo de espacio entre las secciones para permitir que se estiren. No coloque el portaobjetos sobre la placa caliente todavía.
    6. Después de que todas las secciones se hayan transferido a los toboganes, agregue más agua hasta que todas las secciones estén flotando sobre una sola gota de agua. Coloque el portaobjetos en un plato caliente y deje que las secciones se estiren. Retire el portaobjetos de la placa tibia y retire el agua inclinando el vaso del portaobjetos con cuidado contra el papel de seda.
      NOTA: No permita que las secciones toquen directamente el vidrio antes de que se estiren.
    7. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche en una incubadora a 37 °C.

4. Síntesis de sondas de Alu marcadas con digoxigenina mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

  1. Prepare una solución madre de los siguientes cebadores específicos para humanos39: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' y AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. Prepare 50 μL de la siguiente reacción de PCR40: 1x tampón de PCR, 2,0 mM MgCl2, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dATP, 0,065 mM dTTP, 0,035 mM dig-11-dUTP, 0,4 μM cebadores AluFw, 0,4 μM cebadores AluRev, 0,05 U/μL de Taq polimerasa y 1 ng/μL de ADN genómico humano.
  3. Ejecute la PCR con los siguientes ajustes: desnaturalización inicial a 94 °C durante 4 minutos, seguida de 40 ciclos de 94 °C durante 20 s, 60 °C durante 20 s y 72 °C durante 20 s, seguida de una desnaturalización final de 72 °C durante 5 min.
  4. Mida la concentración de la sonda con un espectrofotómetro. Almacene las sondas a -20 °C.
    NOTA: El producto de PCR debe tener un largo de 200-300 pb después de la electroforesis en un gel de agarosaal 29% 29.

5. Hibridación in situ de la sección con sondas de aluminio

  1. Día 1: Permeabilización e hibridación
    NOTA: Se debe usar un frasco de vidrio esterilizado para todos los pasos realizados el día 1.
    1. Precalentar un lavado de PBT (0,1% Tween 20 en PBS) en un baño de agua a 37 °C y preparar una cámara húmeda con 50% de formamida/50% de agua desionizada.
      NOTA: Calcule el volumen de todos los lavados en función del tamaño del frasco de vidrio. A menos que se especifique, todos los lavados se realizan por inmersión de los portaobjetos en la solución.
    2. Retirar la parafina mediante tres lavados sucesivos en xileno, de 5 min cada uno, en una campana extractora.
    3. Rehidratar la serie mediante dos lavados en etanol al 100% durante 5 minutos cada uno, seguidos de lavados con etanol al 90/70/30% en PBS durante 2 minutos cada uno.
    4. Lavar en PBT (0.1% Tween 20 en PBS) tres veces durante 5 minutos cada una.
    5. Para la permeabilización, agregue 2 μg/mL de proteinasa K al PBT precalentado, sumerja los portaobjetos en la solución e incube durante 14 minutos en un baño de agua a 37 °C.
    6. Fijar las secciones por inmersión en paraformaldehído/PBS al 4% durante 20 min a temperatura ambiente.
    7. Lavar con PBS durante 5 min.
    8. Después de limpiar el exceso de PBS de cada portaobjetos, cubra las secciones con 300 μL de tampón de hibridación (50% de formamida desionizada, 4x SSC pH 5.0, 1x solución de Denhardt, 5% de sulfato de dextrano, 100 μg/mL de ADN de esperma de salmón) (Tabla 1). Incubar durante 1 h a 42 °C en la cámara de formamida.
    9. Prepare una solución de sonda de Alu de 0,2 ng/mL en tampón de hibridación. Incline el portaobjetos para eliminar el tampón de hibridación y agregue 120 μL de la solución de sonda de Alu sobre las secciones. Cubra con un cubreobjetos de vidrio, teniendo cuidado de evitar burbujas.
      NOTA: No se debe utilizar parafilm para cubrir los portaobjetos en este paso, ya que se derretirá a temperaturas superiores a 70 °C.
    10. Calentar los portaobjetos en una placa calefactora a 95 °C durante 5 min.
      NOTA: No respire los vapores de formamida.
    11. Incubar los portaobjetos a 42 °C en la cámara de formamida durante la noche.
  2. Día 2: Lavados de rigor e inmunohistoquímica
    1. Prepare 20 tampones SSC (3 M de NaCl, 0,3 M de citrato de sodio, pH 7,5) (Tabla 1). Precalentar dos lavados con tampón de citrato de sodio (SSC) 0,1x solución salina, pH 7,5, a 42 °C.
    2. Llene un frasco de vidrio deslizante con 2x tampón SSC, pH 7.5. Coloque suavemente los portaobjetos en la solución y espere a que los cubreobjetos se desprendan. Retire los cubreobjetos con pinzas e incube los portaobjetos en 2x tampón SSC durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    3. Vuelva a lavar los portaobjetos con tampón SSC 2x, pH 7,5, durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    4. Lave los portaobjetos dos veces con tampón SSC 0,1x, pH 7,5, a 42 °C durante 5 minutos cada uno.
    5. Lave los portaobjetos dos veces con MABT (tampón de ácido maleico con Tween; 0,1 M de ácido maleico, 0,15 M de cloruro de sodio, 0,1% Tween 20, pH 7,5) (Tabla 1) durante 30 min cada uno a temperatura ambiente.
    6. Limpie el exceso de tampón de cada portaobjetos y cubra las secciones con 400 μL de solución bloqueante (10% de suero de cabra normal inactivado, 2% de reactivo bloqueante en MABT). Incubar durante 2 h en una cámara húmeda (preparada con agua desionizada) a temperatura ambiente.
    7. Incline los portaobjetos para eliminar el líquido y agregue 150 μL de fragmentos Fab anti-DIG conjugados con fosfatasa alcalina a una dilución de 1:2.000 en solución de bloqueo. Cubrir con un cubreobjetos de vidrio o parafilm e incubar en la cámara húmeda a 4 °C durante 16 h.
  3. Día 3: Desarrollo del color
    1. Retire suavemente los cubreobjetos o el parafilm dentro de un frasco con MABT (como en el paso 5.2.2) e incube los portaobjetos en MABT durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    2. Lavar con MABT tres veces más durante 30 minutos cada una.
    3. Lavar con MAB (tampón de ácido maleico; 0,1 M de ácido maleico, 0,15 M de cloruro de sodio, pH 7,5) (Tabla 1) durante 30 min.
    4. Lavar dos veces con NTM (tampón NaCl-Tris-MgCl2 ; 100 mM de Tris-HCl pH 9,5, 100 mM de cloruro de sodio, 50 mM de cloruro de magnesio) (Tabla 1) durante 10 min cada una.
    5. Añadir la solución de tinción (0,45 μL/mL de cloruro de tetrazolio azul 4-Nitro, 3,5 μL/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato p-toluidina en NTM) (Tabla 1) al frasco de tinción y sumergir los portaobjetos en la solución. Cubra el frasco con papel de aluminio y deje que el color se desarrolle durante la noche a 37 °C.
  4. Día 4: Contratinción y montaje
    1. Lave los portaobjetos tres veces con PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno.
      NOTA: Asegúrese de que la solución de tinción se deseche correctamente como residuo de halógeno.
    2. Monte las guías tal como están agregando gotas de un medio de montaje acuoso y cubriendo las secciones con un cubreobjetos de vidrio. Alternativamente, proceda a la contratinción con rojo nuclear rápido o azul alcián.
    3. Limpie el exceso de PBS y agregue 500 μL de una solución de contratinción nuclear de 0,1% de rojo nuclear rápido41 (Tabla 1) sobre las secciones e incube los portaobjetos en una cámara húmeda durante 10 min. Consejo para eliminar el exceso de rojo nuclear rápido y proceder a la deshidratación (paso 5.4.5).
    4. Sumerja las secciones en una solución de azul alcián al 0,5% (contratinción de cartílago)42 durante 10 min; Enjuagar en agua destilada e incubar en ácido fosfomolíbdico al 1% durante 10 min. Enjuagar con agua nuevamente y proceder a la deshidratación.
      NOTA: Si se omite el lavado con ácido fosfomolíbdico, el azul alcián se convierte en una contratinción nuclear.
    5. Deshidratar en etanol al 70/95/100/100% durante 5 minutos cada uno.
    6. Lave con xileno tres veces durante 5 minutos cada vez en una campana extractora.
    7. Móntelo con un medio de montaje a base de xileno y cubreobjetos de vidrio.
    8. Deje que los portaobjetos se sequen durante al menos 16 horas en una campana extractora.

6. Adquisición de imágenes

  1. Después de que los portaobjetos montados se hayan secado completamente, examine todas las secciones para detectar la presencia de células humanas injertadas utilizando un microscopio de campo claro vertical (Figura 4E). Busque células Alu-positivas de color azul-púrpura (Figura 4F,G) y marque las secciones que contienen células Alu-positivas con un rotulador (Figura 4E).
    NOTA: Marcar las secciones con celdas positivas de aluminio hará que sea más fácil encontrarlas mientras las fotografía y compara las diapositivas adyacentes teñidas con otros marcadores.
  2. Tenga cuidado de fotografiar las secciones que contienen el xenoinjerto en el mismo orden en que se colocaron en el portaobjetos (dirección antero-posterior). Nombra cada foto con toda la información relevante, como [fecha del xenoinjerto]_[tipo de célula]_[edad embrionaria]_[tipo de sonda]_[número de sección]_001. Incluya archivos de metadatos para agregar la barra de escala más adelante.
  3. Si otros portaobjetos de la misma serie se tiñen con otro marcador, por ejemplo, hibridación in situ de ARN o inmunohistoquímica, fotografíe y asigne un nombre a las secciones adyacentes (Figura 6) de la misma manera.

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Resultados

Identificación de ADSCs Alu-positivas en cortes histológicos
Las secuencias de Alu son elementos repetitivos que comprenden ~10% del genoma humano y, por lo tanto, son excelentes objetivos para identificar células humanas de una manera específica de la especie43. La hibridación in situ con sondas de ADN se puede utilizar para identificar elementos genómicos en secciones histológicas, incluidas células humanas primari...

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Discusión

El protocolo descrito aquí (Figura 1) presenta una opción factible para el cribado del comportamiento de poblaciones primarias de células humanas in vivo, utilizando embriones de pollo como modelo. En este trabajo se describe la formación de esferoides celulares (Figura 2), el trasplante del esferoide en el embrión de pollo (Figura 3), el procesamiento de los especímenes y la hibridación

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Universidade Federal de Rio de Janeiro (UFRJ para J.B.), el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq para J.B.) y la Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ para J.B.). Agradecemos a T. Jaffredo (CNRS, París, Francia) por la sonda Runx2 (Cbfa1). El anticuerpo HNK1 se obtuvo del Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Ciencias Biológicas, Iowa City, IA 52242 EE. UU. Agradecemos a V. Moura-Neto por conceder el acceso al micrótomo y a R. Lent por conceder el acceso al microscopio. Agradecemos a E. Steck por la ayuda en la síntesis de sondas de Alu .

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Animals
Gallus gallushuevos Granja TolomeiSPF-free Polloleghorn blanco
Reactivos
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw imprimacionesSigma-aldrichOLIGO5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3'
Imprimaciones AluRevSigma-aldrichOLIGO5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
Sulfato de aluminioSigma-aldrich368458para la preparación nuclear rápida de solución roja
Anti-Digoxigenina-AP, Fab fragmentos Roche11093274910ID de registro de anticuerpos: AB_514497
Anticuerpo anti-Asesino Natural Humano 1 (HNK1, CD57)Estudios de Desarrollo Banco de Hibridomas3H5ID de registro de anticuerpos: AB_2314644
Anti-ratón, cabra IgM-HRPSanta Cruz Biotecnologíasc-2973ID de registro de anticuerpos: AB_650513
Anti-ratón, cabra IgG (H + L)-HRPNovexG-21040 ID deregistro de anticuerpos: AB_2536527
Anticuerpo anti-músculo liso Actina/ACTA2DakoM085129ID de registro de anticuerpos:
AB_2811108 AquatexMerck1085620050Agente de montaje acuoso
5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato Sal de p-toluidina (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Reactivo bloqueanteRoche11096176001
Ácido cítricoVETEC238Para la preparación de tampones SSC
Colagenasa tipo IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP setRoche11969064001
Denhardt solución 50XInvitrogen750018Para la preparación de tampones de hibridación
Sulfato de dextrano sal sódicaThermo Scientific 15885118Para la preparación de tampones de hibridación
Mezcla de etiquetado de ARN DIGRoche11277073910Contiene Dig-11-dUTP
DMEM de baja glucosaSigma-aldrichD5523
3,3′-Diaminobencidina tetraclorhidrato (DAB)Sigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimetilformamida (DMF)Sigma-aldrich227056Para la preparación de soluciones NBT y BCIP
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)Sigma-aldrichE6758Para la preparación de soluciones de tripsina
Entellan nuevoMerck107961Medio de montaje no acuoso
EtanolProquí miosN/A Suero
fetal bovinoThermoFisher12657029Inactivate a 56 ° C antes
de usar la solución de formaldehído al 37%Proquí miosN/A Formamida
VetecV900064
Ácido acético glacialProquí mios N/A Tinta
chinaPelikan221143
solución de L-glutamina (200 mM)Gibco25030-149
Cloruro de magnesioMerck8147330100Para la preparación de tampones NTM
Ácido maleicoSigma-aldrichM0375-500GPara la preparación de tampones MAB
Metanol Proquí mios
Suero de CabraNormal Sigma-aldrichNS02LInactivar a 56 ° C antes de usar
Cloruro de tetrazolio 4-Nitro blue (NBT)Roche11585029001
Nuclear rojo rápidoSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Penicilina G sal sódicaSigma-aldrichP3032
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-aldrichP3813
Ácido fosfomolíbdicoMerck100532
Proteinasa KGibco BRL25530-015
Esperma de salmón ADNInvitrogen15632011Para la preparación de tampones de hibridación
Cloruro de sodioSigma-aldrichS9888Para la preparación de tampones SSC, MAB y NTM
Sulfato de estreptomicinaSigma-aldrichS6501
Taq Kit de polimerasaCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TripsinaSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
Xileno Proquí miosN/A
y equipos
Microscopio vertical AxioplanCarl Zeiss MicroscopíaN/A
AxiovisionMicroscopía Carl ZeissN/A
Incubadora de célulasThermoForma3110
Incubadora de huevos- 50 huevosGP
Lámpara de cuello de cisneBiocamN/APara la manipulación de huevos
software Fiji; Plugin Cell CounterImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Campana de flujo laminarTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Microtomo rotatorioLeica BiosystemsRM2125 RTSPara el seccionamiento
Microscopio estereoscópicoLabomedLuxeo 4DPara la manipulación
de huevosHorno de esterilizaciónREALIS7261690Para la esterilización de materiales quirúrgicos
consumibles
0,2 mL (PCR) tubos de centrífuga de polipropilenoEppendorf30124707
15 mL tubos de centrífuga cónicos de polipropilenoCorningCLS430791
1,5 mLAxygenMCT-150-C
Tubos de centrífuga de polipropileno de 2 mLAxygenMCT-200-C
Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno de 50 mLPuntas de
, 200 μ Tamaño LInvitrogenAM12655Para la manipulación de huevos
Bloque de vidrio excavado (bloque de tinción) con cubreobjetosHecht Karl42020010
Casetes de incrustaciónSimportM480Utilizado como soporte de bloques de parafina
Cubreobjetos de vidrio, 24 x 40 mmKasviK5-2440
Pipetas Glass Pasteur 230 mmNORMAX5426023Para la preparación de capilares de vidrio
Cuchillas de micrótomoLeica BiosystemsCUCHILLAS DESECHABLES DE ALTO PERFIL-818Para el corte
Parafilm MParafilmP7793
Placa de Petri de plástico, 30 mmKasviK13-0035Para la manipulación de huevos
Placa de Petri de plástico, 60 mmProlab0303-8Para la preparación de esferoides celulares. No debe tratarse para la adhesión celular. 
Portaobjetos de vidrio silanizado (Starfrost)Knittel Glass198Para seccionar
Jeringa 1 mL , Agujas 26 G (0,45 x 13 mm)Descarpack32972Para la manipulación de huevos (aspiración de albúmina)
Herramientas quirúrgicas
Tubo aspiradorDrummond2-000-000Para la manipulación de huevos
Tijeras dedisecciónFine Science Tools14061-11Para la manipulación de huevos
Micropinzas (pinzas)Fine Science Tools00108-11Para la manipulación de huevos y la preparación de capilares de vidrio
Portaagujas (mandril de aguja de disección ajustable)Fisherbrand8955Para la manipulación de huevos
Piedra de afilar de aceite, grano 10.000N/AN/APara afilar agujas
Par de pequeños pincelesN/AN/APara la manipulación de secciones de parafina. Se puede utilizar cualquier marca.
Agujas de coserN/AN/APara afilar en microbisturíes. Se puede utilizar cualquier marca.
Bisturí desechable estéril n.º 23Swann-Norton110Para seccionar
Mango de bisturí quirúrgicoSwann-Norton914Para seccionar
Tijeras de iris Wecker, afiladas/afiladasSurtexSS-641-11Para la manipulación de huevos
barrera (filtro) de CLS430829 Corning

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