El presente protocolo describe la inyección de células de osteosarcoma intratibia para generar modelos de ratón con osteosarcoma ortotópico y lesiones de metástasis pulmonar.
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Artículo de método
Inyección de células de osteosarcoma intratibial para generar osteosarcoma ortotópico y metástasis pulmonar modelos de ratón
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Resumen
Resumen
El osteosarcoma es el cáncer de hueso primario más común en niños y adolescentes, con los pulmones como el sitio metastásico más común. La tasa de supervivencia a cinco años de los pacientes con osteosarcoma con metástasis pulmonar es inferior al 30%. Por lo tanto, la utilización de modelos de ratón que imitan el desarrollo del osteosarcoma en humanos es de gran importancia para comprender el mecanismo fundamental de la carcinogénesis del osteosarcoma y la metástasis pulmonar para desarrollar nuevas terapias. Aquí, se informan procedimientos detallados para generar los modelos primarios de osteosarcoma y metástasis pulmonar en ratones a través de la inyección intratibia de células de osteosarcoma. Combinados con el sistema de imágenes en vivo de bioluminiscencia o rayos X, estos modelos de ratón vivo se utilizan para monitorear y cuantificar el crecimiento y la metástasis del osteosarcoma. Para establecer este modelo, se cargó una matriz de membrana basal que contenía células de osteosarcoma en una jeringa de microvolumen y se inyectó en una tibia de cada ratón atímico después de ser anestesiada. Los ratones fueron sacrificados cuando el osteosarcoma primario alcanzó la limitación de tamaño en el protocolo aprobado por la IACUC. Se separaron las piernas con osteosarcoma y los pulmones con lesiones de metástasis. Estos modelos se caracterizan por un corto período de incubación, crecimiento rápido, lesiones graves y sensibilidad en el monitoreo del desarrollo de lesiones metastásicas primarias y pulmonares. Por lo tanto, estos son modelos ideales para explorar las funciones y mecanismos de factores específicos en la carcinogénesis del osteosarcoma y la metástasis pulmonar, el microambiente tumoral y evaluar la eficacia terapéutica in vivo.
Introducción
El osteosarcoma es el cáncer óseo primario más frecuente en niños y adolescentes 1,2, que se infiltra principalmente en el tejido circundante, e incluso hace metástasis en los pulmones cuando se diagnostica a los pacientes. La metástasis pulmonar es el principal desafío para la terapia del osteosarcoma, y la tasa de supervivencia a cinco años de los pacientes con osteosarcoma con metástasis pulmonar sigue siendo tan baja como 20%-30%3,4,5. Sin embargo, la tasa de supervivencia a cinco años del osteosarcoma primario se ha incrementado a alrededor del 70% desde la década de 1970 debido a la introducción de la quimioterapia6. Por lo tanto, se necesita urgentemente comprender el mecanismo fundamental de la carcinogénesis del osteosarcoma y la metástasis pulmonar para desarrollar nuevas terapias. La aplicación de modelos de ratón que mejor imiten la progresión del osteosarcoma en humanos es de gran importancia7.
Los modelos animales de osteosarcoma se generan mediante ingeniería genética espontánea e inducida, trasplante y otras técnicas. El modelo de osteosarcoma espontáneo rara vez se utiliza debido al largo tiempo de formación del tumor, la tasa de ocurrencia de tumores inconsistentes, la baja morbilidad y la escasa estabilidad 8,9. Aunque el modelo de osteosarcoma inducido es más accesible de obtener que el osteosarcoma espontáneo, la aplicación del modelo de osteosarcoma inducido es limitada porque el factor inductor afectará el microambiente, la patogénesis y las características patológicas del osteosarcoma10. Los modelos transgénicos están ayudando a comprender la patogénesis de los cánceres, ya que pueden simular mejor los entornos fisiológicos y patológicos humanos; sin embargo, los modelos animales transgénicos también tienen sus limitaciones debido a la dificultad, el largo plazo y el alto costo de la modificación transgénica. Además, incluso en los modelos animales transgénicos más ampliamente aceptados generados por la modificación del gen p53 y Rb, solo el 13,6% del sarcoma ocurrió en los cuatro huesos de las extremidades11,12.
El trasplante es uno de los métodos de producción de modelos de cáncer metastásico primario y a distancia más utilizados en los últimos años debido a su maniobra simple, tasa de formación de tumores estable y mejor homogeneidad13. El trasplante incluye el trasplante heterotópico y el trasplante ortotópico según los sitios de trasplante. En el trasplante heterotópico de osteosarcoma, las células de osteosarcoma se inyectan fuera de los sitios primarios de osteosarcoma (hueso) de los animales, comúnmente debajo de la piel, por vía subcutánea14. Aunque el trasplante heterotópico es sencillo sin la necesidad de realizar cirugía en animales, los sitios donde se inyectan las células del osteosarcoma no representan el microambiente real del osteosarcoma humano. El trasplante ortotópico de osteosarcoma es cuando las células de osteosarcoma se inyectan en los huesos de los animales, como la tibia15,16. En comparación con los injertos heterotópicos, los injertos de osteosarcoma ortotópico se caracterizan por un período de incubación corto, un crecimiento rápido y una fuerte naturaleza erosiva; por lo tanto, son modelos animales ideales para estudios relacionados con el osteosarcoma17.
Los animales más utilizados son ratones, perros y peces cebra18,19. El modelo espontáneo de osteosarcoma se suele utilizar en caninos porque el osteosarcoma es uno de los tumores más comunes en caninos. Sin embargo, la aplicación de este modelo es limitada debido al largo tiempo de formación del tumor, la baja tasa de tumorigénesis, la escasa homogeneidad y la estabilidad. Los peces cebra se utilizan a menudo para construir modelos tumorales transgénicos o knockout debido a su rápida reproducción20. Pero los genes del pez cebra son diferentes de los genes humanos, por lo que sus aplicaciones son limitadas.
Este trabajo describe los procedimientos detallados, las precauciones y las imágenes representativas para producir el osteosarcoma primario en la tibia con metástasis pulmonar a través de la inyección intratibia de células de osteosarcoma en ratones atímicos. Este método se aplicó para crear el osteosarcoma primario en tibia de ratón para evaluación de eficacia terapéutica, que mostró una alta reproducibilidad21,22.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de bienestar animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghai. Los ratones acrímicos BALB/c machos de cuatro semanas de edad fueron aclimatados durante una semana antes de la cirugía para la inyección ortotópica de células de osteosarcoma. Los ratones fueron alojados en jaulas de ratones ventiladas individualmente con cinco ratones por jaula en un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas con acceso ad libitum a la alimentación SPF y agua estéril.
1. Preparación de las células
- El día de la inyección de células de osteosarcoma (143B-Luciferasa), lave 80%-90% de las células confluentes cultivadas en una placa de cultivo celular de 10 cm dos veces con PBS (pH 7.4) y tripsinize con 1.5 mL de tripsina al 0.25% durante 3 min. Luego, agregue 6 ml de medios MEM que contengan suero al 10% para apagar la tripsina y recolectar las células en un tubo centrífugo de 15 ml.
NOTA: La línea celular 143B-Luciferasa se obtiene de la línea celular 143B transfectada con el vector pLV-luciferasa23. - Aspire 20 μL de suspensión celular en la cámara de la placa de conteo celular y calcule la concentración celular utilizando un contador automático de celdas (ver Tabla de Materiales).
- Centrifugar las células a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspire el sobrenadante con una pipeta y resuspenda el pellet celular en una matriz de membrana basal de 8,5 mg/ml (ver Tabla de Materiales) a una concentración final de 2 x 107 células/ml.
- Manteniendo las células en hielo, llévelas a la sala de cirugía. Las células deben usarse dentro de las 2 h.
NOTA: Para evitar dosis de inyección inexactas (por ejemplo, debido al espacio muerto en las jeringas), se prepara una suspensión celular adicional (generalmente dos veces el volumen requerido de suspensión celular). La matriz de la membrana basal se mantiene en hielo todo el tiempo, ya que tiene propiedades de coagulación por encima de la temperaturaambiente 24.
2. Cirugía para la inyección ortotópica de las células del osteosarcoma
NOTA: Las herramientas de cirugía se muestran en la Figura 1.
- Los ratones fueron criados en condiciones específicas libres de patógenos. Todos los procedimientos se realizaron en un gabinete aséptico con herramientas estériles.
- Anestesiar a los ratones exponiéndolos a un 2% de isoflurano y un 98% de oxígeno (caudal de oxígeno, 2 L/min).
- Aplique una pequeña cantidad de ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
NOTA: Realice todo el procedimiento en un área bien ventilada. Antes de la inyección de células de osteosarcoma, asegúrese de que cada ratón esté bajo anestesia profunda por un pellizco en el dedo del pie; si el ratón todavía tiene respuestas, como contracción o sacudida, espere mucho tiempo hasta que desaparezcan las respuestas anteriores. - Mantenga cada ratón en posición supina. Sostenga el tobillo del ratón con el pulgar y el dedo índice y desinfecte el sitio de inyección de la tibia con un hisopo de etanol al 70%.
NOTA: Para sujetar firmemente el tobillo del ratón, tanto la punta del pulgar como la punta del índice son de gran importancia para los procedimientos posteriores. - Gire la articulación del tobillo de cada ratón hacia afuera para mover la tibia y el peroné, y doble la articulación de la rodilla a una posición adecuada hasta que la meseta tibial proximal (la parte superior de la tibia) sea claramente visible a través de la piel (Figura 2A).
- Conecte la aguja a una jeringa de 1 ml y apunte la punta de la aguja hacia el lugar de la inyección. Asegúrese de que la aguja de la jeringa esté paralela al eje largo de la tibia.
- Inserte percutáneamente la aguja a través o adyacente al ligamento rotuliano a medida que pasa a través de la cápsula de la piel / articulación; th0en, gire la jeringa (1/2 a 3/4 de círculo) para perforar un orificio a través de la plataforma tibial hacia el extremo distal de la tibia (cavidad medular) para la inyección de células de osteosarcoma con una jeringa de microvolumen (Figura 2B, C).
NOTA: La rotación simultánea de la tibia se puede sentir durante la perforación si la punta de la aguja es precisa. Asegúrese de que la punción se mueva hacia adelante con la rotación de la jeringa en lugar de ser empujada directamente hacia adelante hasta que aproximadamente la mitad de la aguja esté en la tibia.
- Inserte percutáneamente la aguja a través o adyacente al ligamento rotuliano a medida que pasa a través de la cápsula de la piel / articulación; th0en, gire la jeringa (1/2 a 3/4 de círculo) para perforar un orificio a través de la plataforma tibial hacia el extremo distal de la tibia (cavidad medular) para la inyección de células de osteosarcoma con una jeringa de microvolumen (Figura 2B, C).
- Verifique si la aguja de la jeringa hizo un movimiento prominente en el canal medular para garantizar una perforación exitosa.
NOTA: Realice un examen de rayos X (consulte la Tabla de materiales) para confirmar la posición correcta de la aguja y recoger las imágenes. - Cargue la suspensión de células de osteosarcoma 143B (a partir del paso 1.5) en una jeringa de microvolumen y reemplace la jeringa de 1 ml en la tibia con la jeringa de microvolumen cargada de células 143B (Figura 2D). Inyecte lentamente ~ 10 μL (ignore la solución preexistente en la aguja) de suspensión de células 143B en la tibia de cada ratón atímico (aproximadamente 2 x 105 células) sin aplicar alta presión.
- Presione el sitio de inyección con un hisopo de algodón durante 20-30 s cuando se retire la jeringa de microvolumen.
- Vuelva a colocar a cada ratón en una jaula limpia y monitoree de cerca hasta que el ratón esté completamente recuperado de la anestesia (aproximadamente 10 minutos).
- Monitoree el crecimiento del tumor in vivo usando un sistema de imágenes de rayos X. Mida el diámetro más largo (a) y el diámetro corto (b) de la masa cancerosa cada semana con un calibrador para el cálculo del volumen tumoral (V): V = 1/2 x a x b2.
NOTA: Anestesiar a los ratones exponiéndolos a un 2% de isoflurano y un 98% de oxígeno. Los ratones fueron anestesiados para imágenes de rayos X. La inyección intratibia de luciferasa o células de osteosarcoma marcadas con proteína fluorescente permite el seguimiento de las lesiones de osteosarcoma primario y metastásico.
NOTA: Los criterios de valoración humanitarios de los ratones con osteosarcoma debido al crecimiento tumoral de la rodilla y la metástasis pulmonar se basaron en los siguientes criterios: (1) Puntuación de condición corporal, (2) umbral de pérdida de peso del 20%, (3) diámetro máximo promedio de los tumores de 2 cm, o (4) comportamiento animal severamente limitado.
3. Examen patológico (recolección de muestras de osteosarcoma metastásico primario y pulmonar para su análisis)
- Seis semanas después de la inyección de células de osteosarcoma, sacrifique a los ratones por dislocación cervical después de exponerlos para la inhalación de CO2 .
- Mantenga al ratón en posición supina y estire ambas extremidades posteriores.
- Separe todas las piernas que llevan osteosarcoma de la zona inguinal.
NOTA: Asegúrese de que todas las piernas estén separadas del mismo sitio anatómico. - Prepare la muestra histológica de patas con osteosarcoma eliminando la piel, los músculos y los pies, y luego fije la muestra de cada ratón en un tubo de 50 ml con 20 ml de solución de formalina (10%) durante 24 h, seguido de descalcificación en solución de EDTA al 10% durante 14 días con cambio de tampón ocasional.
- Incrustar la muestra en parafina y preparar secciones para el examen histológico después del trabajo publicado previamente25.
- Separe suavemente los pulmones y colóquelos en un tubo de 50 ml lleno de solución de formalina de 20 ml (10%). Después de 24 h, transfiera los pulmones de cada ratón a un tubo de 15 ml con etanol al 70%. Incrustar los pulmones en parafina para tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y ensayo de inmunohistoquímica25.
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Resultados
El éxito del osteosarcoma ortotópico (primario) y de los modelos pulmonares metastásicos depende de la inyección ortotópica precisa de las células del osteosarcoma. Aquí, se desarrolló con éxito un modelo de osteosarcoma ortotópico (primario) a través de la inyección de células de osteosarcoma intratibial. La Figura 3A muestra un ratón representativo que contiene osteosarcoma ortotópico (primario), y la Figura 3B muestra un osteosarcoma ortotópico (prim...
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Discusión
La inyección ortotópica de células de osteosarcoma es un modelo ideal para estudiar la función y el mecanismo de factores específicos en la carcinogénesis y el desarrollo del osteosarcoma para evaluar la eficacia terapéutica. Para evitar diferencias en el crecimiento tumoral, la mayoría de las células activas de osteosarcoma al 80% -90% confluentes con el mismo número se inyectan cuidadosamente en la tibia de cada ratón, y el tiempo de tripsinización celular se controla estrictamente sin afectar la viabilidad celular. Co...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por subvenciones de (1) El Programa Nacional Clave de I + D de China (2018YFC1704300 y 2020YFE0201600), (2) la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza (81973877 y 82174408).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Contador automático de células | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Células de conteo |
| Máquina de anestesia | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | El equipo de ratones de anestesia |
| BALB / c ratones atímicos | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | |
| animal Matriz de membrana basal | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspender células Sistema de imagen de |
| bioluminiscencia | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | seguimiento del crecimiento tumoral y la metástasis pulmonar, si la célula de inyección está marcada por luciferasa |
| Tubo de centrífuga (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, | Centrífuga de Corning las células |
| isoflurano | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia ratones |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 Medio de | cultivo celular |
| Jeringa de microvolumen | Shanghai alta paloma industria y comercio Co., Ltd | 0-50 μ L | Inyecte células precisas en la tibia |
| Solución salina tamponada con fosfato | Beyotime Biotechnology | ST447 | lave las células de osteosarcoma humano |
| Jeringas de 1 ml | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | perforación |
| 143B línea celular | ATCC | CRL-8303 | línea celular de osteosarcoma |
| Tripsina (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | tratamiento con tripsina de las células |
| Azul de tripano | Beyotime Biotechnology | ST798 | Células de tinción para evaluar el |
| vector de actividad (pLV-luciferasa) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | plásmido |
| 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027, Thermo fisher | Reactivo de transfección de plásmidos |
| Imágenes de rayos X Brook | (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | obtuvieron imágenes de rayos X para detectar el crecimiento tumoral |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
