Fractura transversal del fémur del ratón con pasador estabilizador

Las fracturas, roturas en la continuidad de la superficie ósea, ocurren en todos los segmentos de la población. Se vuelven graves en personas que tienen huesos frágiles debido al envejecimiento o la enfermedad, y se espera que los costos de atención médica de las fracturas por fragilidad superen los $ 25 mil millones en 5 años 1,2,3,4,5. Comprender los mecanismos biológicos involucrados en la reparación de fracturas sería un punto de partida en el desarrollo de nuevas terapias destinadas a mejorar el proceso de curación. Investigaciones anteriores han demostrado que, tras la fractura, se producen cuatro pasos significativos que permiten que el hueso sane: (1) formación del hematoma; (2) formación de un callo fibrocartilaginoso; (3) mineralización del callo blando para formar hueso; y (4) remodelación del hueso curado ^6,7. Muchos procesos biológicos se activan para curar la fractura con éxito. En primer lugar, se inicia una respuesta proinflamatoria aguda inmediatamente después de una fractura ^6,7. Luego, el periostio se activa y se expande, y las células periósticas se diferencian en condrocitos para formar un callo de cartílago que crece para llenar el espacio dejado por los segmentos óseos interrumpidos 6,7,8,9. Las células neurales y vasculares invaden el callo recién formado para proporcionar células adicionales y moléculas de señalización necesarias para facilitar la reparación ^6,7,8,9,10. Además de contribuir a la formación de callos, las células periósticas también se diferencian en osteoblastos que depositan hueso tejido en el callo puente. Finalmente, los osteoclastos remodelan el hueso recién formado para volver a su forma original y estructura lamelar 7,8,9,10,11. Muchos grupos desarrollaron modelos de ratón de reparación de fracturas. Uno de los modelos de fractura más tempranos y más utilizados en ratones es el enfoque Einhorn, donde se deja caer un peso sobre la pierna desde una altura específica¹². La falta de control sobre el ángulo y la fuerza aplicada para inducir la fractura crea mucha variabilidad en la ubicación y el tamaño de la discontinuidad ósea. Posteriormente, da lugar a variaciones en la respuesta específica de curación de fracturas observada. Otros enfoques populares son la intervención quirúrgica para producir un defecto monocortical tibial o fracturas por estrés, procedimientos que inducen respuestas de curación comparativamente más leves^10,13. La variabilidad en estos modelos se debe principalmente a la persona que realiza el procedimiento¹⁴.

Aquí, un modelo detallado de lesión de fémur de ratón permite el control sobre la rotura para proporcionar una lesión reproducible y permitir una evaluación cuantitativa y cualitativa de la reparación de la fractura de fémur. Específicamente, se introduce un avance completo en los fémures de ratones adultos y estabiliza los extremos de la fractura para dar cuenta del papel que desempeña la carga física en la curación ósea. También se proporcionan en detalle los métodos para recolectar tejidos e imágenes de los diferentes pasos del proceso de curación utilizando histología y tomografía microinformática (microCT).

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Área Médica de Harvard. En este protocolo se utilizaron ratones C57BL/6J de 12 semanas de edad (machos y hembras). Los ratones machos y hembras C57BL/6J alcanzan la masa ósea máxima alrededor de las 12 semanas de edad con fémures lo suficientemente anchos como para caber en un pasador estabilizador, lo que los convierte en una cepa apropiada para usar en este protocolo¹⁵.

1. Preparación para la cirugía

1. Autoclave el equipo quirúrgico, incluidas las tijeras quirúrgicas, las pinzas rectas, las pinzas curvas, las abrazaderas quirúrgicas y la rueda de corte de diamante (consulte la Tabla de materiales) para minimizar el riesgo de infección.
2. Coloque una jaula limpia para ratones en una almohadilla térmica para facilitar la recuperación postquirúrgica. Ajuste la almohadilla térmica para que alcance una temperatura entre 37-45 ° C.
3. Coloque el ratón bajo anestesia utilizando una cámara de isoflurano. Establezca el flujo de oxígeno de inducción en 2 L / min, la inducción de isoflurano en 2-4%, el oxígeno del cono de nariz de mantenimiento en 2 L / min y el isoflurano de mantenimiento es 1.4%.
4. Confirme que la respiración del ratón es estable y que no responde a un pellizco en el dedo del pie. Aplique una capa delgada de ungüento oftálmico en cada ojo para evitar el rascado corneal. Transfiera el ratón a una almohadilla estéril y mantenga la anestesia utilizando un cono nasal para administrar isoflurano continuamente a la misma velocidad que en el paso 1.3.
   NOTA: Se recomienda el uso de ratones de 12 semanas de edad o mayores, ya que los fémures de ratones más jóvenes pueden ser demasiado delgados para acomodar un alfiler estabilizador.
5. Inyecte al ratón por vía subcutánea 0,05 mg/kg de buprenorfina de liberación lenta (ver Tabla de materiales).
6. Usando un recortador eléctrico, afeite un cuadrado de 2 x 2 cm en ambos muslos correspondiente a la ubicación del fémur.
7. Desinfecte el área afeitada con gasas estériles o hisopos para extender una capa de yodo seguido de un enjuague con etanol al 70% (Figura 1A).

2. Cirugía

1. Con un bisturí estéril, haga una incisión de 5 mm en la región afeitada y desinfectada y despegue la piel para exponer la fascia subyacente.
2. Use pinzas rectas y tijeras finas para agarrar y cortar delicadamente la fascia que cubre directamente el fémur para exponer el músculo. Un corte de 5 mm de la fascia es suficiente para acceder al músculo subyacente.
3. Usando un par de fórceps rectos, separe suavemente el músculo del fémur con un daño tisular mínimo.
4. Una vez que el fémur sea visible, deslice las pinzas curvas debajo del fémur entre el músculo y el hueso separados. Deje que las pinzas se abran lentamente para mantener la separación muscular y asegure el fémur para facilitar un corte limpio.
   NOTA: El fémur debe permanecer expuesto y separado del músculo y la piel cuando los fórceps no se sostienen, como se muestra en la Figura 1B.
5. Haga un corte transversal en el centro del eje del fémur con una sierra de mano en el ajuste de baja potencia (consulte la Tabla de materiales para la cuchilla y el kit de herramientas rotativas utilizados).
   NOTA: Una vez que el fémur está completamente cortado, se crean dos extremos de fractura: la sección proximal (unida al hueso de la cadera) y la sección distal (unida a la rodilla, también conocida como articulación sofocante). Evite cortar el fémur en un solo movimiento. En su lugar, haga 3-5 pasadas hasta que el fémur esté completamente cortado. Esto es fundamental para evitar el sobrecalentamiento del tejido circundante y la generación de desechos óseos significativos, lo que afecta negativamente la curación.
6. Inserte una aguja guía (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (consulte la Tabla de materiales) en la cavidad de la médula de la sección distal. Use los dedos para torcer suavemente la aguja mientras empuja para enhebrar a través de la articulación de la rodilla (Figura 1C).
   1. Retire la aguja guía del extremo distal y repita en el extremo proximal, utilizando el mismo movimiento de torsión suave para empujar la aguja guía a través de la articulación de la cadera. Deje la aguja guía en el extremo proximal, con su punta emergida de la piel (Figura 1D).
      NOTA: Para estabilizar los extremos de la fractura, primero se utilizó una aguja guía para crear una vía a través de los extremos de la fractura, y luego se enhebró un pasador estabilizador a través de esta vía para asegurar los extremos de la fractura¹⁴.
7. Inserte el pasador estabilizador (aguja, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (consulte la Tabla de materiales) en la punta de la aguja guía (Figura 1E). Empuje suavemente para que el pasador estabilizador entre a medida que la aguja guía sale de la cavidad de la médula del extremo proximal.
   1. Deseche la aguja guía. Use pinzas para sostener y alinear el extremo distal con el extremo proximal y continúe enhebrando el pasador estabilizador a través de la cavidad de la médula distal hasta que salga de la articulación de la rodilla utilizando la vía hecha en 2.6 (Figura 1F).
      NOTA: El pasador estabilizador ahora debe sobresalir de la cadera y las articulaciones de la rodilla.
8. Usando la pinza quirúrgica, tire de la punta del pasador para acercar las secciones proximal y distal, de modo que apenas se toquen. Realinee los extremos de la fractura con fórceps si es necesario y doble los extremos del pasador estabilizador hacia el sitio de la fractura utilizando la pinza quirúrgica (consulte la Tabla de materiales).
   1. Retire el plástico de la base de la aguja con cortadores de alambre. Con la abrazadera, gire ambos extremos del pasador hasta que estén romos para evitar daños en los tejidos internos.
      NOTA: Los extremos de la fractura ahora están bloqueados en su lugar para que el ratón pueda poner peso sobre la pierna lesionada. El pasador se asegura si los extremos de la fractura no pueden separarse. También se puede usar un cortador de alambre para embotar los extremos. El pasador estabilizador debe permanecer en su lugar durante toda la duración del estudio hasta que el ratón sea sacrificado. Es probable que los intentos de desalojar el alfiler desestabilicen la respuesta a la fractura y causen daño al animal. El pasador se puede quitar en la disección.
9. Use fórceps rectos para reposicionar el músculo en el fémur. Usando pinzas curvas, pellizque los extremos de la piel juntos y cierre la abertura con clips de herida.
   NOTA: No cierre la piel demasiado fuerte con los clips o el ratón evitará poner peso sobre esta pierna. Limitar la carga física durante la recuperación podría retrasar el proceso de curación.
10. Repita los pasos 2.2 a 2.4 en la otra pierna y cierre la herida sin realizar la fractura de fémur.
    NOTA: Este fémur operado simuladamente sirve como control contralateral.
11. Retire la exposición al isoflurano, coloque al ratón en la jaula calentada y asegúrese de que recupere la conciencia en 10-15 minutos.
12. Controle la actividad del ratón y el sitio de la incisión diariamente durante 5 días después de la cirugía para detectar signos de angustia o infección.
    NOTA: Si el animal muestra signos de dolor, no está comiendo y/o duda en caminar sobre sus extremidades posteriores, consulte con el personal veterinario y administre analgésicos adicionales.
13. Retire los clips de la herida 10 días después de la cirugía.
    NOTA: Si la herida no parece haberse cerrado después de 10 días, consulte al personal veterinario y al IACUC antes de retirar los clips.

3. Cosecha de tejidos

1. Eutanasiar a los ratones a través de la inhalación de CO₂ seguido de dislocación cervical.
   NOTA: Este procedimiento es consistente con el Panel de Eutanasia de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria.
2. Usando tijeras y fórceps, retire la piel de ambas patas de ratón, disloque la cabeza femoral del hueso de la cadera y corte el músculo adyacente para liberar la pierna.
   NOTA: Evite eliminar demasiado músculo alrededor del fémur, ya que el callo podría desprenderse o dañarse.
3. Evitando el pasador estabilizador, corte a través de la articulación de la rodilla para separar el fémur de la tibia.
4. Diseccionar alrededor de las partes distales y proximales del fémur para exponer los extremos del pasador estabilizador.
5. Con un cortador de alambre duro, corte los extremos romos doblados del pasador para que solo quede la parte recta del pasador. Use fórceps para deslizar lenta y suavemente el pasador estabilizador fuera del fémur.
   NOTA: Si el pasador no se desliza fácilmente, no aplique fuerza, ya que esto podría desalojar el callo y dañar la muestra. En su lugar, intente girar el pasador y retírelo delicadamente. La extracción del pasador también puede ser más fácil después de la fijación.

4. Histología - Azul Alciano / Eosina / Naranja G tinción

NOTA: La tinción de Azul /Naranja Alciano G/Eosina se usa rutinariamente para visualizar el cartílago (azul) y el hueso (rosa). El área del cartílago se puede cuantificar como una proporción del área total del callo (Figura 2A, B).

1. Fije los fémures en formalina tamponada neutra al 10% durante la noche a 4 °C.
2. Lave las muestras fijas en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Coloque las muestras en 0.5M EDTA, pH 8.0 en un agitador de rotación lenta durante 2 semanas. Cambie la solución EDTA cada dos días para garantizar una descalcificación eficiente.
   NOTA: No se requieren rpm específicas para el agitador; asegúrese de que el líquido fluya en el recipiente para cubrir todas las muestras. La descalcificación completa se puede probar mediante rayos X de los fémures.
4. Para procesar las muestras para incrustar parafina incubarlas en las siguientes soluciones (1 h cada una): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xileno, Xileno, Parafina, Parafina.
5. Incruste las muestras en parafina para el seccionamiento.
6. Cortar secciones longitudinales de 5-7 μm de espesor de los fémures fracturados usando un microtomo.
7. Desparafinar las secciones incubándolas en 2 baños de xileno (5 min cada uno).
8. Rehidratar las secciones incubando en el siguiente gradiente de etanol (2 min cada uno): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
9. Coloque los toboganes en el agua del grifo durante 1 minuto.
10. Haga las soluciones de azul alciano, alcohol ácido, agua de amonio y Eosina / Naranja G para histología como se menciona en el Archivo Complementario 1.
    NOTA: Los volúmenes sugeridos de cada solución deben ser suficientes para sumergir completamente las diapositivas para la tinción.
11. Coloque los portaobjetos en alcohol ácido durante 30 s e incube en azul alciano durante 40 min.
12. Lavar suavemente debajo del grifo hasta que el agua esté clara durante aproximadamente 2 minutos.
13. Sumerja los portaobjetos rápidamente en alcohol ácido durante 1 s.
14. Enjuague como se describe en el paso 4.9.
15. Incubar en agua de amonio durante 15 s.
16. Enjuague como se describe en el paso 4.9.
17. Colocar en 95% EtOH durante 1 min e incubar en Eosin/Orange G durante 90 s.
18. Deshidrata los portaobjetos rápidamente con una sola inmersión en 70% EtOH, 80% EtOH y 100% EtOH.
19. Coloque las diapositivas en xileno durante 1 minuto para despejar las diapositivas.
20. Aplique medios de montaje y una cubierta para la obtención de imágenes.
    NOTA: Para el análisis molecular, el ARN y la proteína se pueden aislar del callo. Diseccione cuidadosamente el músculo bajo un endoscopio de disección y separe el callo del hueso subyacente con un bisturí.

5. MicroCT

NOTA: En las últimas etapas de la curación, se puede realizar microCT para obtener imágenes y cuantificar la mineralización en el callo duro y la brecha de fractura. En ratones C57BL/6J, el callo suele estar mineralizado y es detectable por microCT después de 10 días después de la fractura (dpf) (Figura 2C).

1. Fije los fémures en formalina tamponada neutra al 10% durante la noche a 4 °C.
   NOTA: MicroCT se puede realizar en los mismos fémures utilizados para la histología siempre que se realice antes de la descalcificación por EDTA (paso 4.3). Cuando utilice los mismos fémures para ambas técnicas, realice microCT, recupere las muestras y vaya al paso 4.3.
2. Lave las muestras fijas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y guárdelas en etOH al 70%.
3. Realizar microCT con un tamaño de vóxel isotrópico de 7 μm a un nivel de energía de 55 kVP y una intensidad de 145 μA (ver Tabla de Materiales).
4. Contornee las rodajas de microCT para incluir el callo y excluir el hueso cortical.
   NOTA: A medida que el callo se mineraliza más con el tiempo, el umbral se puede ajustar para visualizar y medir el volumen del callo en diferentes etapas.
5. Obtener el volumen óseo contenido en los contornos del callo como medida del volumen del callo.
   NOTA: El espacio de fractura se puede medir directamente en las rodajas microCT como la distancia ocupada por la rotura.

En ratones C57BL / 6J, una cirugía exitosa completa los pasos de curación mencionados anteriormente con poca o ninguna respuesta inflamatoria local o afectación perióstica en el fémur contralateral operado simuladamente. Un hematoma se forma unas horas después de la cirugía, y el periostio se activa para reclutar progenitores esqueléticos para la condrogénesis. Varias poblaciones celulares, como los progenitores mesenquimales Prx1+ , se pueden rastrear durante el proceso de reparación utilizando modelos de ratón reportero fluorescente disponibles comercialmente (Figura 3). A los 5 días después de la fractura (dpf), la tinción azul alciano se puede utilizar para visualizar el callo blando y posteriormente cuantificar el área del cartílago (Figura 2A, B). La mineralización es detectable por microCT a 28 dpf (Figura 2C). El volumen del callo mineralizado, la distancia de la brecha de fractura y la resistencia ósea medida por pruebas mecánicas se utilizan comúnmente como resultados cuantificables de la reparación de la fractura. La modificación genética o la intervención farmacológica pueden cambiar el curso de la recuperación, por lo que se recomienda realizar un estudio de tiempo para caracterizar las fracturas en diferentes etapas de reparación. Todo el callo se puede diseccionar para el análisis molecular y el eje óseo contralateral se puede utilizar como control.  Si los extremos de la fractura no están alineados o asegurados adecuadamente con el pasador, las imágenes resultantes mostrarán una falta de formación de callos en todo o un lado del sitio de la fractura (Figura 4).

Figura 1: Fractura e inserción del pasador estabilizador. (A) Se afeita un cuadrado en la pierna derecha de un ratón C57BL/6J. (B) Después de hacer una incisión en la piel y la fascia, se aseguran fórceps curvos debajo del fémur para separar el músculo, la piel y el hueso. (C) Después de realizar el corte, se crean dos extremos de fractura: la sección proximal del fémur unida al hueso de la cadera y la sección distal unida a la rodilla. La aguja guía (verde) se inserta en la sección distal y se empuja a través de la articulación de la rodilla. (D) La aguja guía se retira de la sección distal, se inserta en la sección proximal y se empuja a través de la articulación de la cadera. (E) El pasador estabilizador (aguja gris) se inserta en la aguja guía que sobresale de la articulación de la cadera. (F) El pasador estabilizador se empuja a través de la sección proximal, en la sección distal y a través de la articulación de la rodilla utilizando el camino hecho por la aguja guía en C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Histología y microCT de la fractura de fémur. (A) Las secciones de parafina fijada con formalina de las fracturas de fémur se recogieron a 5, 10 y 28 dpf y se tiñeron con azul alciano / Eosina / naranja G. Barra de escala = 500 μm. (B) El área del cartílago se cuantificó utilizando el software ImageJ a 5, 10 y 28 dpf. (C) A 28 dpf, se observó mineralización, y el volumen del callo y la brecha de fractura se pudieron medir mediante microCT. Barra de escala = 1.000 μm. Datos mostrados como Media ± SEM. El volumen de callo mineralizado se midió contorneando alrededor del hueso cortical en el sitio de la fractura. El área gris oscuro delinea el callo mineralizado en la imagen, mientras que el hueso cortical (gris claro) no se incluye en la medición. Datos mostrados como Media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Modelo reportero fluorescente utilizado para visualizar la expansión de las células periósticas Prx1+ después de la fractura. Prx1CreER; Los ratones Rosa26tdTomato fueron inyectados diariamente durante cinco días con 80 mg/kg de peso corporal de tamoxifeno para inducir la expresión de tdTomato. Tres días después de la inyección final, se inició la fractura de fémur y se sacrificaron ratones a 7 o 14 dpf para rastrear dónde se encuentran las células que expresan Prx1 y su progenie (Prx1 +) dentro del callo de fractura y el periostio expandido. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ejemplo de curación irregular debido a problemas quirúrgicos. Los extremos de la fractura no estaban alineados correctamente y el pasador estabilizador atravesaba la sección proximal del fémur en este ejemplo. Estos errores resultaron en la formación de callos donde se perforó el fémur (caja amarilla) en lugar de en el sitio de corte. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Expediente Complementario 1: Composición de las soluciones requeridas para la histología. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.