Artículo de método

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

DOI:

10.3791/63077

⸱

25 de febrero de 2022

 , 
1School of Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Resumen

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Estudiar las propiedades fisiológicas de sinapsis específicas en el cerebro y cómo sufren cambios plásticos es un desafío clave en la neurociencia moderna. Las técnicas electrofisiológicas in vitro tradicionales utilizan la estimulación eléctrica para evocar la transmisión sináptica. Un inconveniente importante de este método es su naturaleza inespecífica; Todos los axones en la región del electrodo estimulante se activarán, lo que dificulta atribuir un efecto a una conexión aferente particular. Este problema se puede superar reemplazando la estimulación eléctrica con estimulación basada en la optogenética. Describimos un método para combinar la optogenética con registros in vitro de patch-clamp. Esta es una herramienta poderosa para el estudio tanto de la transmisión sináptica basal como de la plasticidad sináptica de conexiones sinápticas precisas definidas anatómicamente y es aplicable a casi cualquier vía en el cerebro. Aquí, describimos la preparación y el manejo de un vector viral que codifica la proteína canalrodopsina para la inyección quirúrgica en una región presináptica de interés (corteza prefrontal medial) en el cerebro de roedores y la fabricación de cortes agudos de regiones diana aguas abajo (corteza entorrinal lateral). También se presenta un procedimiento detallado para combinar las grabaciones de patch-clamp con la activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica a corto y largo plazo. Discutimos ejemplos de experimentos que logran la especificidad de la vía y la célula combinando optogenética y etiquetado celular dependiente de Cre. Finalmente, se describe la confirmación histológica de la región presináptica de interés junto con el etiquetado de biocitina de la célula postsináptica, para permitir una mayor identificación de la ubicación precisa y el tipo de célula.

Introducción

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Comprender la fisiología de las sinapsis y cómo sufren cambios plásticos es fundamental para comprender cómo funcionan las redes cerebrales en el cerebro sano1 y cómo funcionan mal en los trastornos cerebrales. El uso de cortes cerebrales agudos ex vivo permite el registro de la actividad eléctrica de las sinapsis de neuronas individuales con una alta relación señal-ruido utilizando grabaciones de pinza de parche de células enteras. El control del potencial de membrana y la manipulación farmacológica directa permiten el aislamiento de los subtipos de receptores. Estos registros pueden realizarse con exquisita especificidad para identif....

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Protocolo

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Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido (1986) y las directrices asociadas, así como las directrices institucionales locales.

1. Inyección viral estereotáxica

NOTA: El protocolo actual requiere especificidad anatómica, pero no de tipo celular postsináptico.

  1. Elige el animal apropiado. En este protocolo se utilizaron ratas con capucha Lister macho de tipo salvaje (300-350 g, aproximadamente 3 meses de edad).
  2. Elija la construcción viral adecuada. Hay varios factores a considerar (ver ....

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Resultados

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En este protocolo, describimos cómo estudiar la fisiología sináptica de largo alcance y la plasticidad utilizando la administración viral de construcciones optogenéticas. El protocolo se puede adaptar muy fácilmente para estudiar casi cualquier conexión de largo alcance en el cerebro. Como ejemplo, describimos la inyección de AAV que codifican una opsina en mPFC de rata, la preparación de cortes agudos de LEC, registros de patch-clamp de neuronas piramidales LEC de capa 5 y activación evocada por luz de terminales mPFC e.......

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Discusión

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El protocolo presentado aquí describe un método para explorar proyecciones sinápticas de largo alcance altamente específicas utilizando una combinación de cirugía estereotáxica para administrar AAV que codifican construcciones optogenéticas y electrofisiología en cortes cerebrales agudos (Figura 1). Juntas, estas técnicas ofrecen herramientas para caracterizar la fisiología y la plasticidad de los circuitos cerebrales con alta precisión en vías de largo alcance y anatómicamente difusas que a.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la subvención Wellcome 206401/Z/17/Z. Nos gustaría agradecer a Zafar Bashir por su tutoría experta y al Dr. Clair Booth por su asistencia técnica y comentarios sobre el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
tubo de 0,2 mLFisher Scientific Ltd12134102
10 µ Pipeta LGilsonFD10001
placa de 24 pocillosSARSTEDT83.3922
válvula luer de 3 víasCole-ParmerWZ-30600-02
3,3′-Sustrato de diaminobenzidina (DAB)Vector LaboratoriesSK-4105
Objetivo 40xOlympusLUMPLFLN40XW
4-aminopiridinaHola BioHB1073
Objetivo 4xOlympusPLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherryAddgene35512Título viral: 3.3x1013 GC/ml
Lente acromáticaEdmund Optics49363Enfoca el espectro visual y el infrarrojo
cercano Microcentrífuga de sobremesaBenchmark ScientificC1005*
BiocytinSigma-AldrichB4261
Capilar de vidrio de borosilicatoWarner InstrumentsG150F-6
BurrFine science tools19008-07
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Cámara - Qimaging Retiga ElectroPhotometrics01-ELECTRO-M-14-C
CarbacholTocris2810
Exfoliante quirúrgico de clorhexidinaVetaseptXHG008
CortaúñasAndis22445AGC Super 2 velocidades Cuchilla desmontable Clipper
Lente de condensador de colimaciónThorLabsACL2520-A
CubreobjetosFisher Scientific Ltd10011913
CriostatoLeicaCM3050 S
CsMeSO4Sigma-AldrichC1426
Pegamento de cianoacrilatoRapid Electronics Ltd84-4557
Dispositivo de adquisición de datosNational InstrumentsUSB-6341 BNC
D-glucosaSigma-AldrichG8270
Espejo dicroico 500 nm paso largoEdmund Optics69899
Espejo dicroico de paso largo de 600 nmEdmund Optics69901
Cubo de espejo dicroicoThorLabsCM1-DCH/M
EGTAMillpore 324626
Portaelectrodos con puerto lateralHEKA895150
Filtro de emisiónChroma59022m
Filtro de excitaciónChromaET570/20x
Gel para ojosDechraLubrithal
Pincel finoSuministros de laboratorio científicoBRU2052
GuillotinaWorld Precision InstrumentsDCAP
HEPESSigma-AldrichH3375
Solución de peróxido de hidrógenoSigma-AldrichH100930% (p/p)
IsofluranoHenry Schein988-3245
IsopentanoSigma-AldrichM32631
KClSigma-AldrichP3911
k-gluconatoSigma-AldrichG4500
Cubo de filtro de fluorescencia cinemáticaThorLabsDFM1T1
Controlador LEDThorLabsLEDD1B
Pomada de lidocaínaTeva80007150
MgATPSigma-AldrichA9187
MgClSigma-AldrichM2670
MgSO4Sigma-AldrichM7506
MicrotaladroHarvard Apparatus75-1887
Extractor de microelectrodosSutter instrumentsP-87
Jeringa de microinyecciónHamilton7634-01/00
Aguja de jeringa de microinyecciónHamilton7803-05Especificación personalizada: calibre 33, longitud 15 mm, estilo de punta 4 - 12°
bomba de jeringa de microinyecciónWorld Precision InstrumentsUMP3T-1
LED azul montadoThorLabsM470L5
LED verde montadoThorLabsM565L3
Na2HPO4.7H2OSigma-AldrichS9390
NaClSigma-AldrichS9888
NaGTPSigma-AldrichG8877
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
NaH2PO4.H2OSigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
NIR LEDOSRAMSFH4550Se utiliza para la obtención de imágenes IR refractadas de cortes, la óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC) es otro método comúnmente utilizado
OCTVWR InternationalRAYLLAMB/OCTMedio de temperatura de corte óptima
ParaformaldehídoSigma-Aldrich158127
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148
Amplificador de pinza de parcheMolecular Devices700A
Bomba peristálticaWorld Precision InstrumentsPortaobjetos
de microscopio recubiertos de poli-L-lisinaFisher Scientific Ltd23-769-310
Cámara de grabaciónWarner InstrumentsRC-26G
Hoja de bisturí SwannMorton#24
Ancla de corteWarner Instruments SHD-26-GH/15
Montura estereotáxicaKopfModelo 902
Soporte estereotáxico para micro taladroHarvard Apparatus75-1874
SacarosaSigma-AldrichS0389
Microscopio quirúrgicoCarl ZeissOPMI 1 FR pro
SutureEthiconW577H
Filtro de jeringa para registro intracelular soluciónThermo Scientific Nalgene171-0020
Citrato de tetrodotoxinaHello BioHB1035
Pipetas de transferenciaFisher Scientific Ltd10458842
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Microscopio de fluorescencia verticalLeicaDM6 B
VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración con DAPIVector LaboratoriesH-1200-10
Kit VECTASTAIN ABC-HRPVector LaboratoriesPK-4000
VibratomeCampden Instruments7000smz-2
WinLTPhttps://www.winltp.com/Versión 2.32Software de adquisición de datos
Solution
aCSF
de corte con sacarosa
PFA
Intracellular?
Medio solución

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nico....

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