Se proporciona un protocolo detallado y tres scripts de Python para operar un sistema robótico de manejo de líquidos de código abierto para realizar la preparación semiautomatizada de muestras de proteínas para experimentos de espectrometría de masas, que cubren la eliminación de detergentes, la digestión de proteínas y los pasos de desalinización de péptidos.
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Artículo de método
Procesamiento de muestras de proteómica de escopeta automatizado por un robot de laboratorio de código abierto
En este artículo
Resumen
Resumen
Los experimentos de proteómica de escopeta basados en espectrometría de masas requieren múltiples pasos de preparación de muestras, incluida la digestión enzimática de proteínas y la limpieza, que pueden ocupar horas-persona significativas de trabajo de banco y presentar una fuente de variabilidad de lote a lote. La automatización de laboratorio con robots pipeteadores puede reducir el trabajo manual, maximizar el rendimiento y aumentar la reproducibilidad de la investigación. Aún así, los altos precios iniciales de las estaciones de automatización estándar las hacen inasequibles para muchos laboratorios académicos. Este artículo describe un flujo de trabajo de preparación de muestras de proteómica utilizando un sistema de automatización de código abierto asequible (The Opentrons OT-2), que incluye instrucciones para configurar pasos semiautomatizados de reducción de proteínas, alquilación, digestión y limpieza; así como acompañar scripts Python de código abierto para programar el sistema OT-2 a través de su interfaz de programación de aplicaciones.
Introducción
La proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas es una herramienta poderosa para medir la abundancia de muchas proteínas en muestras biológicas simultáneamente. Los experimentos de proteómica con análisis bioinformático se emplean rutinariamente para identificar biomarcadores y descubrir complejos biológicos asociados y vías que sustentan los mecanismos patológicos. Con su alta especificidad de analito y su potencial precisión cuantitativa, la proteómica de escopeta también tiene un excelente potencial para ser adoptada por instalaciones de investigación y laboratorios de diagnóstico para el análisis de muestras clínicas sin la necesidad de depender de
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Protocolo
Los scripts de Python desarrollados se han depositado en GitHub en: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Una copia de los scripts se proporciona en el Archivo Suplementario 1. Consulte el repositorio de GitHub para obtener las últimas versiones.
1. Preparativos experimentales
- Compruebe el hardware necesario antes de iniciar el protocolo.
NOTA: Se requieren los siguientes componentes de hardware: pipetas OT-2, puntas de pipeta, juego de bastidores de tubos 4 en 1, conjunto de bloques de aluminio, módulo magnético, módulo de temperatura, placas de pozos de 96 pocillos y 2....
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Resultados
Aquí se proporcionan tres scripts de Python que son compatibles con el robot OT-2, y que realizan la preparación de muestras para la proteómica de espectrometría de masas con una albúmina sérica bovina estándar de una sola proteína (réplicas técnicas n = 5 digestiones) y una muestra de lisado cardíaco humano que contiene detergente (n = 5 digestiones). Cada producto de digestión se divide en dos reacciones de limpieza de péptidos. El número de coincidencias de espectro peptídico (PSM), péptidos y proteínas identificadas .......
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Discusión
Pasos críticos dentro del protocolo
Para obtener el mejor rendimiento, se deben utilizar utensilios de laboratorio, módulos y consumibles verificados por Opentrons compatibles con OT-2. Se puede crear material de laboratorio personalizado siguiendo las instrucciones de Opentrons en Reference14. Asegúrese de calibrar la cubierta OT-2, las pipetas y el material de laboratorio cuando se use por primera vez. También es fundamental seguir las pautas del fabricante de perlas SP3 para.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por los premios nih F32-HL149191 a YH; R00-HL144829 a EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 a MPL. La Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 se crean con la ayuda de una herramienta de ilustración científica basada en la web, BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 300 y micro; Puntas de pipeta en L | Juego de gradillas para tubos Opentrons | ||
| base y 4 tapas de soporte para tubos de 1,5 ml, 2 ml, 15 ml + 50 ml, 15 ml y 50 ml. En este estudio utilizamos tapas de 2 mL y 15 mL + 50 mL. | |||
| Acclaim PepMap 100 C18 Columna HPLC | Thermo Scientific | #164568 | 3 μ partícula m; 100 y Aring; poro; 75 y mu; m x 150 mm |
| Acetonitrilo LC-MS grado | VWR | ||
| Juego de bloques | de aluminio Opentrons | bloques incluye 3 tapas que son compatibles con tubos de 96 pocillos, 2,0 mL y una tira de PCR para usar con el módulo de temperatura OT-2. Utilizamos el soporte de tubo de 2,0 ml en este manuscrito. | |
| Bicarbonato de amonio | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Albúmina sérica bovina estándar, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) Grado LC-MS | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray Columnas de HPLC | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| A prueba de etanol 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Ácido fórmico Grado LC-MS | Thermo Scientific | #85178 | |
| Lisado de corazón humano | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Yodoacetamida | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Bastidor | de tubos magnéticosThermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| Minicentrífuga mySPIN 6 Minicentrífuga | Thermo Scientific | #75004061 | para centrifugado rápido |
| NEST 2 mL Placa de pocillo profundo de 96 pocillos, fondo en V | Módulo magnético Opentrons | ||
| OT-2 | Opentrons | GEN1 | |
| Pipeta monocanal OT-2 P300 | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 pipeta monocanal | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipeteador | Opentrons | OT-2 OT-2 | |
| módulo de temperatura | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Ensayo cuantitativo de péptidos colorimétricos | Thermo Scientific | #23275 | |
| Tubos LoBind de proteínas 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Base de datos de secuencias de proteínas | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20revisado:sí Partículas magnéticas modificadas con | |
| carboxilato Sera-Mag SpeedBead, | Cytiva | hidrofóbica#65152105050250 | |
| Partículas magnéticas modificadas con carboxilato Sera-Mag SpeedBead, Hidrofílico | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Evaporador de vacío | |
| Thermo Q Exactive HF Espectrómetro | de masas Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Tripsina MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Agua Grado LC-MS | VWR | #BDH83645.400 |
Referencias
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942(2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue anal....
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Reimpresiones y permisos
