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Procesamiento de muestras de proteómica de escopeta automatizado por un robot de laboratorio de código abierto

DOI:

10.3791/63092

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October 28th, 2021

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1Department of Medicine-Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Biochemistry & Molecular Genetics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Consortium for Fibrosis Research & Translation, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se proporciona un protocolo detallado y tres scripts de Python para operar un sistema robótico de manejo de líquidos de código abierto para realizar la preparación semiautomatizada de muestras de proteínas para experimentos de espectrometría de masas, que cubren la eliminación de detergentes, la digestión de proteínas y los pasos de desalinización de péptidos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los experimentos de proteómica de escopeta basados en espectrometría de masas requieren múltiples pasos de preparación de muestras, incluida la digestión enzimática de proteínas y la limpieza, que pueden ocupar horas-persona significativas de trabajo de banco y presentar una fuente de variabilidad de lote a lote. La automatización de laboratorio con robots pipeteadores puede reducir el trabajo manual, maximizar el rendimiento y aumentar la reproducibilidad de la investigación. Aún así, los altos precios iniciales de las estaciones de automatización estándar las hacen inasequibles para muchos laboratorios académicos. Este artículo describe un flujo de trabajo de preparación de muestras de proteómica utilizando un sistema de automatización de código abierto asequible (The Opentrons OT-2), que incluye instrucciones para configurar pasos semiautomatizados de reducción de proteínas, alquilación, digestión y limpieza; así como acompañar scripts Python de código abierto para programar el sistema OT-2 a través de su interfaz de programación de aplicaciones.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas es una herramienta poderosa para medir la abundancia de muchas proteínas en muestras biológicas simultáneamente. Los experimentos de proteómica con análisis bioinformático se emplean rutinariamente para identificar biomarcadores y descubrir complejos biológicos asociados y vías que sustentan los mecanismos patológicos. Con su alta especificidad de analito y su potencial precisión cuantitativa, la proteómica de escopeta también tiene un excelente potencial para ser adoptada por instalaciones de investigación y laboratorios de diagnóstico para el análisis de muestras clínicas sin la necesidad de depender de anticuerpos1,2.

Para preparar muestras de proteínas para el análisis proteómico de escopeta, las proteínas extraídas de muestras biológicas (por ejemplo, células y tejidos) generalmente primero deben procesarse utilizando protocolos largos, incluida la medición de la concentración de proteínas de la muestra, la reducción y alquilación de proteínas, y la digestión enzimática en péptidos. Además, las proteínas extraídas en tampones de lisis comunes que contienen detergentes a menudo requieren pasos adicionales de intercambio de tampón o eliminación de detergente antes del análisis porque el detergente puede interferir con la digestión de tripsina y degradar significativamente el rendimiento del análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) aguas abajo3. Los péptidos generalmente se desalan, se secan y reconstituyen en disolventes compatibles con LC-MS / MS después de la digestión enzimática. Estos procedimientos de bioquímica de proteínas pueden ser laboriosos y llevar mucho tiempo. Por lo tanto, continúan limitando el rendimiento de los flujos de trabajo de proteómica y contribuyen a la variabilidad de los datos adquiridos4,5. Los errores y sesgos humanos han sido reconocidos como factores cruciales que afectan la varianza y reproducibilidad de los datos6,7. Para minimizar los errores humanos en los flujos de trabajo de preparación de muestras de espectrometría de masas, se han utilizado sistemas robóticos de pipeteo automatizados para mejorar el rendimiento y la reproducibilidad de la identificación y cuantificación de proteínas a partir de la proteómica de escopeta y el análisis de espectrometría de masas dirigida, donde tales avances han sido aclamados como instrumentales para continuar el impulso de la adopción generalizada de tecnologías proteómicas en entornos clínicos y de investigación críticos8, 9,10,11,12,13. Sin embargo, la mayoría de los protocolos existentes utilizan plataformas robóticas de manejo de líquidos que requieren una inversión y capacitación sustanciales, lo que limita su utilidad en muchos laboratorios en el entorno académico o con un presupuesto limitado.

Este artículo describe un protocolo que utiliza un sistema robótico de manejo de líquidos de bajo costo y código abierto, el OT-2, para semiautomatizar un flujo de trabajo típico de preparación de muestras de proteómica de escopeta. El OT-2 tiene un costo más bajo que muchos otros sistemas robóticos de manejo de líquidos, y en el momento de escribir este artículo, cuesta aproximadamente $ 5,000 dólares estadounidenses. Al tener en cuenta los precios de diferentes módulos y artículos de laboratorio, el costo total para establecer experimentos en este protocolo en el momento de escribir este artículo es de alrededor de $ 10,000, lo que lo hace más asequible para un conjunto considerablemente más amplio de laboratorios sobre opciones más caras. El OT-2 es compatible con la programación de código abierto a través de scripts Python y ofrece grandes flexibilidades en el diseño de protocolos de bricolaje definidos por el usuario. Utilizando tres scripts desarrollados internamente, los protocolos a continuación cubren la ejecución de un flujo de trabajo típico de preparación de muestras de proteómica de escopeta en la estación OT-2 con un estándar de proteína arquetípico (albúmina sérica bovina; BSA) y una muestra de proteína compleja de un lisado normal del corazón humano (Figura 1). Los procedimientos para procesar (1) una muestra de BSA y (2) una muestra de lisado cardíaco complejo se detallan en las secciones 1, 2, 5, 6 y 3, 4, 5, 6 del Protocolo, respectivamente. Las perlas magnéticas modificadas con carboxilato Sera-Mag se utilizan en la preparación de muestras mejoradas en fase sólida (SP3) de una sola olla para eliminar detergentes y sales en las muestras de proteínas y péptidos. Los resúmenes trípticos de la albúmina sérica bovina y las proteínas del corazón humano se limpian aún más con perlas SP3 y se envían para el análisis LC-MS / MS. Los espectros de masas se analizan utilizando el software MaxQuant para la identificación de péptidos y proteínas. Los resultados representativos realizados por nosotros muestran que el protocolo logra excelentes coeficientes técnicos de variación (CV) al tiempo que ahorra tiempo de banco y no es inferior al digesto manual.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los scripts de Python desarrollados se han depositado en GitHub en: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Una copia de los scripts se proporciona en el Archivo Suplementario 1. Consulte el repositorio de GitHub para obtener las últimas versiones.

1. Preparativos experimentales

  1. Compruebe el hardware necesario antes de iniciar el protocolo.
    NOTA: Se requieren los siguientes componentes de hardware: pipetas OT-2, puntas de pipeta, juego de bastidores de tubos 4 en 1, conjunto de bloques de aluminio, módulo magnético, módulo de temperatura, placas de pozos de 96 pocillos y 2 ml de profundidad (consulte la Tabla de materiales).

2. Preparación de muestras de espectrometría de masas (EM) con una sola proteína de albúmina sérica bovina (BSA)

  1. Abra el script NoSP3_digestion.py en un editor de texto y especifique las variables específicas del experimento según sea necesario en la sección PERSONALIZAR SOLO AQUÍ.
    NOTA: Las variables específicas del experimento incluyen el número de muestras y replicación; la concentración de la muestra; el volumen de reactivos ditiotreitol - TDT, yodoacetamida - IAA y tripsina; el tiempo de incubación de TDT e IAA, y la punta de partida para la pipeta P20/P50 y P300).
    1. Abra la aplicación Opentrons y cargue el script en la pestaña PROTOCOLO en la aplicación Opentrons.
      NOTA: La aplicación Opentrons se puede descargar desde Reference14 a un equipo local. En el momento de escribir este artículo, la pipeta electrónica Opentrons P50 no está disponible para su compra en la tienda Opentrons. Se ha sustituido por la pipeta electrónica monocanal P20 compatible con los volúmenes especificados en el protocolo. Se han hecho notas e instrucciones en el script para reemplazar la pipeta P50 con la pipeta P20. Es posible que los usuarios deban probar y verificar la compatibilidad de la pipeta en particular con este protocolo siguiendo las instrucciones de la API de Opentrons.
  2. Abra la pestaña ROBOT y realice la calibración de la plataforma del robot Calibrar la plataforma en la pestaña ROBOT siguiendo las instrucciones paso a paso en pantalla en la aplicación Opentrons.
    NOTA: Este paso es necesario solo si no se ha implementado previamente o si el robot se ha translocado recientemente.
  3. Haga clic en el botón ADMINISTRAR PIPETAS para realizar la calibración de la longitud de la punta, seguido de la calibración del desplazamiento de la pipeta para calibrar la posición predeterminada de la combinación de punta y pipeta.
    NOTA: Este paso es necesario si se utiliza una pipeta por primera vez.
  4. Coloque el material de laboratorio y las pipetas necesarios en la ubicación correspondiente en la plataforma OT-2 especificada en el script de Python (Figura 2).
    NOTA: Asegúrese de que el módulo de temperatura esté conectado y encendido, y que el bloque de aluminio se coloque en la parte superior del módulo de temperatura.
  5. Abra la pestaña CALIBRAR y realice la calibración para la combinación de material de laboratorio y pipetas requeridas en este script de Python.
    NOTA: La aplicación Opentrons registrará los parámetros de calibración, lo que no es necesario para futuras aplicaciones con el mismo material de laboratorio y pipetas.
  6. Preparar 5 ml de solución de bicarbonato de amonio (ABC) (pH ~ 8.0) de 100 ml disolviendo 39,53 mg de ABC en agua de grado espectrométrico de masas a un volumen total de 5 ml en un tubo cónico de 15 ml. Coloque el tampón de bicarbonato de amonio en el pozo A1 del bastidor de tubos 4 en 1 con la tapa del soporte del tubo de 15 ml + 50 ml.
  7. Preparar 1 ml de proteína de albúmina sérica bovina (BSA) en un tubo de baja unión de proteína de 2,0 ml (ver Tabla de materiales). Coloque la muestra en el pozo A1 del bastidor de tubos 4 en 1 con soporte de tubo de 2 ml.
  8. Coloque manualmente tubos de baja unión de proteína de 2.0 ml en los pocillos de A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, etc. en el bloque de aluminio en la parte superior del módulo de temperatura.
    NOTA: La pipeta robótica dispensará muestras en el orden vertical a partir de A1 (primera muestra) hasta la última muestra por defecto. Se puede especificar la dispensación horizontal. Consulte 15 para obtener más información. El número total de tubos que deben prepararse debe ser igual al número total de muestras (es decir, el número de muestras biológicas multiplicado por el número de réplicas técnicas por muestra).
  9. Preparar 1 mL de TDT de 60 mM disolviendo 9,26 mg de sólidos de TDT en agua de grado de espectrometría de masas a un volumen total de 1 mL. Coloque la TDT en el pozo A6 del bastidor de tubos 4 en 1 con la tapa del soporte de tubo de 2 ml.
    PRECAUCIÓN: La TDT es perjudicial para los ojos humanos, la piel y el sistema respiratorio. Use EPP y manipule debajo de una capucha química. Consulte la hoja de datos de seguridad del fabricante para conocer los procedimientos adecuados.
  10. Observe mientras el robot transfiere un volumen apropiado de búfer ABC a los tubos de muestra en el bloque de aluminio.
    NOTA: El volumen total de ABC y mezcla de proteínas en cada tubo es de 100 μL, y el volumen del tampón ABC se calcula en la escritura (V = 100 μL menos el volumen de 100 μg de muestra de proteína).
  11. Asegúrese de que el robot transfiera 100 μg de proteína BSA a cada tubo con tampón ABC.
    NOTA: Un experimento típico puede utilizar hasta 100 μg de proteínas para la digestión de proteínas, es decir, 50 μL de 2,0 μg/μL para esta muestra de BSA.
  12. Verifique manualmente que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Asegúrese de que la TDT se haya cargado en A6 del bastidor de tubos de 2 ml ubicado en la ranura 4 antes de reanudar el protocolo. Asegúrese de colocar un tubo de TDT en el pozo A6 y abra su tapa. Haga clic en el botón Reanudar en la aplicación Opentrons para continuar. Asegúrese de que el robot transfiera 10 μL de solución de TDT a cada pozo de muestra, seguido de cinco rondas de mezcla.
  13. Verifique que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Asegúrese de cerrar las tapas de los tubos de muestra. Cierre manualmente las tapas de los tubos y haga clic en Reanudar para continuar. Espere hasta que el módulo de temperatura del robot comience a calentar el bloque de aluminio hasta que la temperatura alcance los 55 ° C, seguido de una incubación de 5 minutos para permitir que las muestras lleguen a 55 ° C.
    NOTA: El robot mantendrá la temperatura a 55 °C durante 30 min para permitir la reducción de proteínas por TDT durante la incubación.
  14. Durante los 30 min de incubación de TDT, prepare 1 ml de 187,5 mM de yodoacetamida (IAA) disolviendo 34,68 mg de IAA en el tampón ABC a un volumen total de 1 ml. Envuelva manualmente la solución IAA con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
    PRECAUCIÓN: La IAA puede causar irritación ocular y respiratoria grave. Manipularlo bajo una capucha química usando el EPP adecuado.
  15. Asegúrese de que el módulo de temperatura del robot se enfríe al completar la etapa de incubación de TDT de 30 minutos.
    NOTA: Después de que la temperatura del módulo alcanza los 22 °C, el módulo mantiene la temperatura durante 5 minutos para permitir que las muestras se enfríen por completo.
  16. Destapar los tubos de muestra cuando el programa del robot esté en pausa y mostrar el mensaje de advertencia: Asegúrese de abrir las tapas de los tubos de muestra. Haga clic en Reanudar para continuar.
  17. Verifique manualmente que el programa del robot esté en pausa con un mensaje de advertencia: Asegúrese de que IAA se haya cargado en B6 del bastidor de tubos de 2 ml ubicado en la ranura 4 antes de reanudar el protocolo. Confirme la ubicación del bastidor del tubo IAA y abra la tapa del tubo. Haga clic en Reanudar para continuar. Asegúrese de que el robot transfiera 10 μL de IAA a cada tubo de muestra seguido de cinco rondas de mezcla.
  18. Tapa los tubos de muestra cuando el programa del robot esté en pausa y muestra el mensaje: Cierre las tapas de los tubos de muestra y cubra los tubos de muestra con papel de aluminio. Cubra todo el bloque de aluminio con un trozo limpio de papel de aluminio. Haga clic en Reanudar para continuar. Espere hasta que las muestras se incuben a 22 °C durante 30 min. Asegúrese de que el módulo de temperatura del robot se desactive al finalizar la incubación de IAA.
  19. Preparar una mezcla de solución de tripsina durante la incubación de IAA (paso 2.19) a la concentración final de 0.2 μg/μL: disolver 20 μg de tripsina de grado de espectrometría de masas/secuenciación en 100 μL de agua de grado MS.
  20. Coloque la solución de tripsina en el pozo C6 del bastidor de tubos de 2 ml con la tapa del tubo abierta cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje de advertencia: Asegúrese de que la tripsina se haya cargado en C6 del bastidor de tubos de 2 ml ubicado en la ranura 4 antes de reanudar el protocolo. Haga clic en Reanudar para continuar.
  21. Compruebe que el programa del robot está en pausa y muestra el mensaje de advertencia: Abra las tapas de los tubos de muestra en el módulo de temperatura. Desmarque los tubos de muestra y haga clic en Reanudar para continuar. Espere mientras el robot transfiere 10 μL de tripsina a cada tubo de muestra seguido de cinco rondas de mezcla.
  22. Envuelva las tapas del tubo de muestra con una película de parafina, transfiera todas las muestras a un mezclador con temperatura controlada e incube a 37 °C durante 16-20 h con agitación a 600 rpm.
    NOTA: La digestión de tripsina también se puede realizar directamente en el módulo de temperatura a 37 °C.

3. Limpieza de péptidos usando perlas paramagnéticas SP3

  1. Al día siguiente, después de la digestión nocturna de tripsina, gire brevemente las muestras con una microcentrífuga de sobremesa (≤2,000 x g) (consulte la Tabla de materiales) y coloque las muestras en un estante de tubos magnéticos. Deje reposar las muestras durante 2 min.
    1. Transfiera el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta a un nuevo conjunto de tubos de microcentrífuga de baja unión de proteínas. Mantenga las muestras en un refrigerador y continúe con los pasos 3.2-3.9.
      NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, guarde las muestras a -80 °C.
  2. Abra el script SP3_peptide_cleanup.py Python en un editor de texto y especifique según sea necesario en la sección PERSONALIZAR SOLO AQUÍ.
    NOTA: Las variables específicas del experimento incluyen el número de muestras y réplicas, el volumen de péptidos a transferir, el volumen de reactivos (perlas, acetonitrilo, DMSO), la punta de partida para pipetas P20 / P50 y P300, y el pozo de inicio en la placa de pozo profundo en el módulo magnético. Cada muestra de digesto de BSA contiene aproximadamente 120 μL de volumen de digestión, que se alicitará en dos réplicas técnicas con 55 μL en cada réplica. Para limpiar solo la mitad del resumen, cambie la variable de número de réplica a 1.
  3. Cargue el script en la pestaña PROTOCOLO de la aplicación Opentrons .
  4. Coloque el material de laboratorio y las pipetas necesarios en la ubicación correspondiente en la plataforma OT-2 especificada en el script de Python (Figura 3). Asegúrese de que el módulo magnético esté encendido y conectado al robot. Coloque una nueva placa de pozo de 2 ml y 96 pocillos de profundidad (consulte la Tabla de materiales) en la parte superior del módulo magnético.
  5. Abra la pestaña CALIBRAR y realice la calibración para la combinación de material de laboratorio y pipetas requeridas en este script de Python.
    NOTA: La calibración para las mismas combinaciones de material de laboratorio y pipeta solo debe realizarse una vez, y la aplicación Opentrons registrará los parámetros de calibración.
  6. Coloque las muestras digeridas (sobrenadante recolectado en el paso 3.1) en el bastidor de tubos de 2.0 ml en el orden vertical en los pozos A1, B1....
  7. Prepare 15 ml de acetonitrilo compatible con LC-MS/MS en un tubo cónico de 50 ml y coloque el tubo en el pozo A3 en el bastidor de tubos 4 en 1 con la tapa del soporte del tubo de 15 ml + 50 ml.
  8. Prepare 5 ml de DMSO al 2% agregando 100 μL de DMSO con agua de grado de espectrometría de masas de 4.9 ml en un tubo cónico de 15 ml. Coloque el tubo en el pozo A1 en el bastidor de tubos de 15 ml + 50 ml.
  9. Etiquete un tubo cónico vacío de 50 ml como Residuo y colóquelo en el pozo B3 en el bastidor de tubos de 15 ml + 50 ml.
  10. Prepare las cuentas de SP3 después de Reference16.
    1. Prepare una cantidad adecuada de perlas mezcladas en un tubo de microcentrífuga de 2.0 ml.
      NOTA: Cada reacción de limpieza de péptidos requiere 10 μL de perlas mixtas. Por ejemplo, prepare un mínimo de 40 μL de perlas mixtas para cuatro reacciones de limpieza.
    2. Deje que la mezcla de cuentas repose en el soporte magnético durante 2 minutos. Retire el sobrenadante con cuidado con una pipeta y mida el volumen del sobrenadante con una pipeta.
    3. Calcule el volumen restante de perlas y agregue 5-10 veces el agua de grado de espectrometría de masas (por ejemplo, 100-200 μL de agua para 20 μL de perlas) y el vórtice (velocidad 10) durante 10 s. Coloque las cuentas en el soporte magnético durante 2 minutos.
    4. Repita los pasos de lavado con agua para un total de tres lavados.
    5. Vuelva a suspender las perlas finales en agua de grado MS a una concentración final de 50 μg/μL. Coloque las perlas magnéticas lavadas en el pozo A6 en el bastidor de tubos de 2,0 ml.
      NOTA: Se recomienda que las perlas se resuspendan a una concentración de 10 μg/μL16. En el esfuerzo de optimización actual, la concentración final se modificó a 50 μg / μL para minimizar el volumen total de la mezcla de perlas-péptido-acetonitrilo.
  11. Asegúrese de que el robot transfiera 55 μL de las muestras digeridas a los pozos en las placas de pozo profundo en el módulo magnético.
  12. Verifique que el protocolo del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Asegúrese de que las cuentas preparadas se hayan cargado en A6 del bastidor de tubos de 2 ml ubicado en la ranura 4 antes de reanudar el protocolo. Vórtice las cuentas y luego gire brevemente hacia abajo durante 5 s en una mini centrífuga de sobremesa y coloque las cuentas en el pozo A6 del bastidor de tubos de 2 ml con la tapa abierta. Espera mientras el robot mezcla las cuentas 10 veces durante cinco rondas mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: El robot transfiere 10 μL de perlas a cada muestra digerida en las placas de pozo profundo seguidas de cinco veces de mezcla.
  13. Asegúrese de que el robot transfiera 1.292 μL de acetonitrilo a cada pocillo e inmediatamente mezcle 10 veces mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo para facilitar la unión de péptidos y perlas.
    NOTA: Cada transferencia se completa en varias rondas porque la pipeta P300 solo puede transferir hasta 300 μL a la vez.
  14. Asegúrese de que el robot mezcle todas las muestras cinco veces mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo en la placa de pozo profundo.
  15. Espere hasta que el módulo magnético esté activado y las muestras se incuben en el módulo durante 2 minutos.
  16. Espere mientras las velocidades de aspiración y dispensación del pipeteo se ajustan a 25 μL / s desde el valor predeterminado de 150 μL / s.
    NOTA: El robot retira lentamente el sobrenadante de cada pozo y lo desecha en el tubo de desecho mientras el módulo magnético está activado.
  17. Espere hasta que la aspiración de pipeteo y las velocidades de dispensación vuelvan a la configuración predeterminada. Observe que el módulo magnético se desconecta.
  18. Verifique que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Asegúrese de que la tapa del tubo ACN esté apagada. Destapar manualmente el tubo de acetonitrilo y colocarlo de nuevo en el bastidor del tubo. Haga clic en Reanudar para continuar. Asegúrese de que el robot transfiera 1 ml de acetonitrilo para lavar cada muestra y mezcle inmediatamente 10 veces.
  19. Asegúrese de que el robot mezcle todas las muestras 10 veces para lavar las muestras.
  20. Espera mientras el módulo magnético se activa e incuba las muestras durante 2 min.
  21. Espere hasta que el robot cambie la velocidad de aspiración del pipeteo a lenta y retire lentamente el sobrenadante y lo dispense en el tubo de desecho.
  22. Observe mientras el robot incuba las muestras en el módulo magnético durante 60 s para permitir que el acetonitrilo residual se evapore, luego cambia las velocidades de aspiración del pipeteo a la predeterminada. Observe que el módulo magnético se desconecta.
  23. Verifique que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Vortex DMSO nuevamente y abra las mayúsculas. Vórtice manualmente el DMSO al 2% durante 10 s y colóquelo de nuevo en el pozo A1 en el rack de tubos de 15 mL-50 mL. Haga clic en Reanudar para continuar.
  24. Asegúrese de que el robot transfiera 80 μL de DMSO al 2% a cada pozo y mezcle inmediatamente 10 veces.
  25. Asegúrese de que el robot mezcle todas las muestras 10 veces durante cinco rondas adicionales.
  26. Espera mientras el módulo magnético se activa e incuba las muestras durante 2 min.
  27. Observe mientras el robot cambia la velocidad de aspiración de la pipeta a lenta (25 μL / s) y transfiere lentamente el sobrenadante a pozos vacíos en la placa de pozo profundo.
  28. Espere hasta que el robot incube muestras en el módulo magnético durante 2 minutos para eliminar las perlas residuales en las muestras.
  29. Verifique que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Coloque nuevos tubos de 2 ml en el bastidor de tubos de 2 ml y asegúrese de que el número de tubos coincida con el número total de muestras.
  30. Coloque el primer tubo de microcentrífuga de 2 ml en el pozo directamente después de la muestra final de digestión de BSA. Haga clic en Reanudar para continuar.
    NOTA: Por ejemplo, las seis muestras de resumen de BSA analizadas en este protocolo se encuentran en los pozos A1, B1, C1, D1, A2 y B2. Por ello, el nuevo conjunto de tubos de 2,0 mL se coloca en los pozos B3, C3, D3, ... y así sucesivamente.
  31. Observe mientras el robot transfiere 88 μL de muestras de los pozos en la placa del pozo profundo al nuevo conjunto de tubos de 2.0 mL.
    NOTA: El volumen transferido (1,1 x 80 μL) en el protocolo está optimizado para garantizar que todo el volumen de la muestra se aspire en puntas de pipeta.
  32. Espere mientras el robot cambia la velocidad de aspiración de la pipeta a la predeterminada y desconecta el módulo magnético.
  33. Seque manualmente los péptidos limpiados en un evaporador al vacío (consulte la Tabla de materiales) y proceda a la sección 5 o almacene las muestras secas a -20 °C.

4. Preparación de muestras de EM con lisado proteico del corazón humano (5 mg/ml) con perlas paramagnéticas SP3

  1. Abra el script de Python SP3_digestion.py y especifique los valores de las variables en la sección PERSONALIZAR SOLO AQUÍ.
    NOTA: Las variables incluyen el número de muestras y replicación, la concentración de la muestra, el volumen de reactivos (TDT, IAA, tripsina, perlas, 100% y 80% etanol), el tiempo de incubación de TDT e IAA, la punta de partida para las pipetas P20 / P50 y P300, y el inicio bien en la placa de pozo profundo en el módulo magnético.
  2. Siga los pasos 2.2-2.23 de la sección 2 para la preparación de muestras de EM con una sola proteína de albúmina sérica bovina para la incubación de TDT e IAA. Consulte la Figura 1 para la configuración de la cubierta del robot en esos pasos.
  3. Prepare una mezcla fresca de perlas SP3 (perlas de 20 μL por reacción de limpieza) para la limpieza de proteínas (como se especifica en el paso 3.10) durante las etapas de incubación de TDT e IAA (pasos 2.15 y 2.19). Coloque las perlas en el pozo D6 en el bastidor de tubos de 2 ml.
  4. Verifique que el programa del robot esté en pausa con el mensaje: Abrir tapas de tubo. Desmarque manualmente los tubos de muestra en el bloque de aluminio en la parte superior del módulo de temperatura y haga clic en Reanudar para continuar.
  5. Asegúrese de que el robot transfiera todas las muestras de los tubos de 2,0 ml a una nueva placa de pozo profundo en la parte superior del módulo magnético.
  6. Compruebe que el programa del robot está en pausa y muestra el mensaje: Asegúrese de que las perlas preparadas se hayan cargado en D6 del bastidor de tubos de 2 ml ubicado en la ranura 4 antes de reanudar el protocolo. Abra la tapa del tubo de cuentas y haga clic en Reanudar para continuar.
  7. Observe mientras el robot transfiere 20 μL de cuentas a cada pozo en la placa del pozo profundo con cinco rondas de mezcla de las cuentas y cinco rondas de mezcla de la mezcla de muestras y cuentas.
  8. Verifique que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Asegúrese de que se haya cargado 100 por ciento de etanol en A3 del bastidor de tubos de 15 mL-50 mL ubicado en la ranura 5 antes de reanudar el protocolo. Prepare 10-20 ml de etanol al 100% (es decir, etanol a prueba de 200, consulte la Tabla de materiales) en un tubo cónico de 50 ml y colóquelo en el pozo A3 del bastidor. Haga clic en Reanudar para continuar.
  9. Espere mientras el robot transfiere 140 μL de etanol 100% a cada pozo en la placa inmediatamente seguido de 10 rondas de mezcla para facilitar la unión de los péptidos a las perlas.
  10. Asegúrese de que el robot mezcle cada muestra mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces cada ronda para un total de cinco rondas de mezcla.
  11. Espere mientras el módulo magnético está activado e incuba las muestras en el módulo durante 2 minutos.
  12. Observe mientras el robot cambia la velocidad de pipeteo a lenta (25 μL / s) y aspira el sobrenadante de cada pozo y lo dispensa en el tubo de desecho.
  13. Espere hasta que el robot cambie la velocidad de pipeteo a la predeterminada y desconecte el módulo magnético.
  14. Verifique que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Asegúrese de que se haya cargado el 80 por ciento de etanol en A4 del bastidor de tubos de 15 mL-50 mL ubicado en la ranura 5 antes de reanudar el protocolo. Prepare manualmente 20 ml de etanol al 80% mezclando 4 ml de agua de grado MS con 16 ml de etanol al 100% (es decir, prueba de 200). Coloque el etanol al 80% en el pozo A4 en el bastidor de tubos. Haga clic en Reanudar para continuar. Asegúrese de que el robot transfiera 1 ml de etanol al 80% a cada pozo y mezcle inmediatamente 10 veces.
  15. Observe mientras el robot cambia la velocidad de pipeteo a lenta (25 μL / s), aspira el sobrenadante de cada pozo y dispensa en el tubo de desecho. Espere hasta que el robot cambie la velocidad de pipeteo a la predeterminada y desconecte el módulo magnético.
  16. Abra la tapa de la solución ABC cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Abrir tapa en el tubo ABC. Haga clic en Reanudar para continuar. Espere mientras el robot desconecta el módulo magnético, transfiere 250 μL de ABC a cada pozo e inmediatamente mezcla 10 veces.
    NOTA: Este paso consiste en lavar las muestras con ABC.
  17. Asegúrese de que el robot enganche el módulo magnético e incube muestras en el módulo durante 2 minutos.
  18. Observe mientras el robot cambia la velocidad de pipeteo a lenta (25 μL / s) y transfiere el sobrenadante de cada pozo al tubo de desecho. Espere hasta que el robot transfiera 100 μL de búfer ABC a cada pozo e inmediatamente mezcle 10 veces.
  19. Verifique que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Asegúrese de que se hayan colocado nuevos tubos de recolección en un bloque de aluminio de 2.0 ml antes de reanudar el protocolo. Coloque un nuevo conjunto de tubos de microcentrífuga de baja retención de proteínas en el bloque de aluminio inmediatamente después del último tubo de muestra inicialmente en el bloque. Haga clic en Reanudar para continuar. Espere mientras el robot transfiere cada muestra en búfer ABC a los nuevos tubos de 2,0 ml.
    NOTA: Examine los pozos y transfiera manualmente cualquier muestra residual a los tubos si es necesario.
  20. Prepare una cantidad adecuada de tripsina de grado MS (10 μL por muestra) disolviendo 20 μg de tripsina de grado MS en agua de grado MS a una concentración final de 0.2 μg / μL cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje: Asegúrese de que la tripsina (0.2 μg / μL) se haya cargado en C6 del tubo de rack de 2 mL ubicado en la ranura 4 antes de reanudar el protocolo. Asegúrese de que el robot transfiera 10 μL de tripsina a cada tubo de muestra, seguido de cinco rondas de mezcla.
  21. Envuelva las tapas del tubo de muestra con una película de parafina, transfiera todas las muestras a un mezclador con temperatura controlada e incube a 37 °C durante 16-20 h con agitación a 1.000 rpm.
    NOTA: Se recomienda realizar la digestión con agitación a 1.000 rpm para minimizar la precipitación de las perlas durante la incubación nocturna.

5. Limpieza de péptidos usando perlas paramagnéticas SP3

  1. Siga las instrucciones paso a paso en el paso 2, Limpieza de péptidos con perlas paramagnéticas SP3.

6. Cromatografía líquida y espectrometría de masas

  1. Resusped los péptidos BSA (pasos 2-3) y lisado cardíaco (paso 4) en ácido fórmico al 0,1% agregando 1 ml de ácido fórmico LC-MS grado 99% en agua para EM a un volumen total de 1 L.
    PRECAUCIÓN: El ácido fórmico es un ácido fuerte. Es altamente corrosivo para los ojos, la piel y el sistema respiratorio. Manipule con cuidado debajo de una capucha química usando EPP.
  2. Cuantificar la concentración de péptidos post-digest utilizando un kit de ensayo cuantitativo de péptidos17 e inyectar 0,5 μg de BSA digest y 1,5 μg de digestión cardíaca para el análisis LC-MS/MS.
  3. Configure el programa de cromatografía líquida para el análisis LC-MS/MS.
    NOTA: En una configuración típica, los resúmenes de péptidos pueden cargarse en una columna C18 de fase inversa (partícula de 3 μm; poro de 100 Å; 75 μm x 150 mm; consulte la Tabla de materiales) utilizando los parámetros proporcionados en el Archivo complementario 2.
  4. Adquirir datos de proteómica de escopeta utilizando un espectrómetro de masas (ver Tabla de Materiales) utilizando los parámetros proporcionados en el Archivo Complementario 3.
  5. Busque en la base de datos de proteínas para la identificación de proteínas.
    1. Descargue e instale el software requerido, MaxQuant.
      NOTA: El software MaxQuant (v.1.6.10.43) se utilizó aquí para los siguientes pasos (consulte la Tabla de materiales).
    2. Descargue la base de datos de proteoma humano curada de una base de datos de secuencias de proteínas de alta calidad (UniProt/SwissProt) (consulte la Tabla de materiales). Haga clic en el botón Descargar y elija FASTA (canónico).
      NOTA: Opcionalmente, descargue FASTA (no canónico) para incluir isoformas de proteínas de cada gen en la base de datos, si lo desea.
    3. En la interfaz del software MaxQuant, especifique el archivo FASTA que se utilizará como base de datos de proteínas navegando al panel Parámetros globales y haga clic en la pestaña Secuencias ; luego, haga clic en el botón Agregar para especificar la ruta del archivo al archivo FASTA.
    4. En la interfaz del software MaxQuant, especifique los archivos de espectro de masa sin procesar adquiridos que se analizarán yendo al panel Datos sin procesar y haciendo clic en el botón Cargar y seleccionando los archivos sin procesar.
    5. Configure los parámetros de búsqueda como se muestra en la Tabla 1. Habilite la cuantificación sin etiquetas (LFQ) si es necesario.
    6. Espere a que se complete la búsqueda y localice el número de coincidencias de espectro peptídico (PSM) que superan los umbrales FDR del 1% en el archivo msms.txt en la carpeta /combined/txt.
      NOTA: En las comparaciones realizadas aquí para la sección de resultados representativos, se filtraron los PSM asignados a múltiples proteínas, y los PSM mapeados a una proteína única se retuvieron para contar el número de PSM, péptidos y proteínas (Figura 4 y Figura 5).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se proporcionan tres scripts de Python que son compatibles con el robot OT-2, y que realizan la preparación de muestras para la proteómica de espectrometría de masas con una albúmina sérica bovina estándar de una sola proteína (réplicas técnicas n = 5 digestiones) y una muestra de lisado cardíaco humano que contiene detergente (n = 5 digestiones). Cada producto de digestión se divide en dos reacciones de limpieza de péptidos. El número de coincidencias de espectro peptídico (PSM), péptidos y proteínas identificadas ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pasos críticos dentro del protocolo
Para obtener el mejor rendimiento, se deben utilizar utensilios de laboratorio, módulos y consumibles verificados por Opentrons compatibles con OT-2. Se puede crear material de laboratorio personalizado siguiendo las instrucciones de Opentrons en Reference14. Asegúrese de calibrar la cubierta OT-2, las pipetas y el material de laboratorio cuando se use por primera vez. También es fundamental seguir las pautas del fabricante de perlas SP3 para...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado en parte por los premios nih F32-HL149191 a YH; R00-HL144829 a EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 a MPL. La Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 se crean con la ayuda de una herramienta de ilustración científica basada en la web, BioRender.com.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
300 y micro; Puntas de pipeta en LJuego de gradillas para tubos Opentrons
base y 4 tapas de soporte para tubos de 1,5 ml, 2 ml, 15 ml + 50 ml, 15 ml y 50 ml. En este estudio utilizamos tapas de 2 mL y 15 mL + 50 mL.
Acclaim PepMap 100 C18 Columna HPLCThermo Scientific#1645683 μ partícula m; 100 y Aring; poro; 75 y mu; m x 150 mm
Acetonitrilo LC-MS gradoVWR
Juego de bloquesde aluminio Opentronsbloques incluye 3 tapas que son compatibles con tubos de 96 pocillos, 2,0 mL y una tira de PCR para usar con el módulo de temperatura OT-2. Utilizamos el soporte de tubo de 2,0 ml en este manuscrito.
Bicarbonato de amonioSigma-Aldrich# A6141
Albúmina sérica bovina estándar, 2 mg/mLThermo Scientific#23210
Dimetilsulfóxido (DMSO) Grado LC-MSThermo Scientific#85190
DithiothreitolSigma-Aldrich#D5545
EASY-Spray Columnas de HPLCThermo Scientific#ES800A
EasynLC 1200 Nano LCThermo Scientific#LC140
A prueba de etanol 195-200Fisher#04-355-720
Ácido fórmico Grado LC-MSThermo Scientific#85178
Lisado de corazón humanoNovus BiologicalsNB820-59217
YodoacetamidaSigma-Aldrich#I1149
Bastidorde tubos magnéticosThermo Scientific#MR02
MAXQuant v.1.6.10.43Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)
Minicentrífuga mySPIN 6 MinicentrífugaThermo Scientific#75004061para centrifugado rápido
NEST 2 mL Placa de pocillo profundo de 96 pocillos, fondo en VMódulo magnético Opentrons
OT-2OpentronsGEN1
Pipeta monocanal OT-2 P300OpentronsGEN1
OT-2 P50 pipeta monocanalOpentronsGEN1
OT-2 robot pipeteadorOpentronsOT-2 OT-2
módulo de temperaturaOpentronsGEN1
Pierce Ensayo cuantitativo de péptidos colorimétricosThermo Scientific#23275
Tubos LoBind de proteínas 2.0 mLEppendorf#022431102
Base de datos de secuencias de proteínasUniProt/SwissProthttps://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640%
20revisado:sí Partículas magnéticas modificadas con
carboxilato Sera-Mag SpeedBead,Cytivahidrofóbica#65152105050250
Partículas magnéticas modificadas con carboxilato Sera-Mag SpeedBead, HidrofílicoCytiva#45152105050250
SpeedVacThermo ScientificEvaporador de vacío
Thermo Q Exactive HF Espectrómetrode masas Thermo Scientific#IQLAAEGAAPFALGMBFZ
Tripsina MS GradeThermo Scientific#90057
Agua Grado LC-MSVWR#BDH83645.400
4 en 1 Opentrons Cada juego incluye 2 soportes de #JT9829 Este juego de de sobremesa

References

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