Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

Summary

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Abstract

Las mitocondrias son importantes en la fisiopatología de muchas enfermedades neurodegenerativas. Los cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de membrana mitocondrial (MMP), la producción mitocondrial de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el número de copias del ADN mitocondrial (ADNmt) son a menudo características de estos procesos. Este informe detalla un nuevo enfoque basado en la citometría de flujo para medir múltiples parámetros mitocondriales en diferentes tipos de células, incluidas las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) y las células neurales y gliales derivadas de iPSC. Esta estrategia basada en el flujo utiliza células vivas para medir el volumen mitocondrial, MMP y niveles de ROS, así como células fijas para estimar los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial (MRC) y las proteínas asociadas al ADNmt, como el factor de transcripción mitocondrial A (TFAM).

Al co-teñir con reporteros fluorescentes, incluyendo MitoTracker Green (MTG), tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) y MitoSox Red, los cambios en el volumen mitocondrial, MMP y ROS mitocondrial pueden cuantificarse y relacionarse con el contenido mitocondrial. La doble tinción con anticuerpos contra subunidades del complejo MRC y translocasa de la membrana mitocondrial externa 20 (TOMM20) permite la evaluación de la expresión de la subunidad MRC. Como la cantidad de TFAM es proporcional al número de copias de ADNmt, la medición de TFAM por TOMM20 da una medición indirecta de ADNmt por volumen mitocondrial. Todo el protocolo se puede llevar a cabo en 2-3 h. Es importante destacar que estos protocolos permiten la medición de parámetros mitocondriales, tanto a nivel total como a nivel específico por volumen mitocondrial, utilizando citometría de flujo.

Introduction

Las mitocondrias son orgánulos esenciales presentes en casi todas las células eucariotas. Las mitocondrias son responsables del suministro de energía mediante la producción de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa y actúan como intermediarios metabólicos para la biosíntesis y el metabolismo. Las mitocondrias están profundamente involucradas en muchos otros procesos celulares importantes, como la generación de ROS, la muerte celular y la regulación intracelular de Ca²⁺. La disfunción mitocondrial se ha asociado con diversas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (....

Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales y la Tabla suplementaria S1 para obtener recetas de todos los medios y soluciones utilizados en este protocolo.

1. Diferenciación de iPSCs humanas en NCSs, neuronas dopaminérgicas (DA) y astrocitos

1. Prepare placas recubiertas de matriz.
   1. Descongele un vial de 5 ml de matriz en hielo durante la noche. Diluir 1 mL de matriz con 99 mL de Cold Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% de concentración final). Hacer 1 ml de alícuotas y almacenarlas a -20 °C.
   2. Descongele la solución de matriz a 4 °C ....

Results

En la Figura 3 se muestra una descripción esquemática del método de diferenciación y las estrategias de citometría de flujo. Las iPSC humanas se diferencian en rosetas neuronales y luego se elevan a la cultura de suspensión para su diferenciación en esferas neuronales. Las esferas neuronales se diferencian aún más y maduran en neuronas DA. Las esferas neuronales se disocian en células individuales para generar astrocitos gliales, se recolocan en monocapas como NSC y luego se diferencian en a.......

Discussion

Aquí hay protocolos para generar neuronas y astrocitos derivados de iPSC y evaluar múltiples aspectos de la función mitocondrial utilizando citometría de flujo. Estos protocolos permiten la conversión eficiente de iPSCs humanas tanto en neuronas como en astrocitos gliales y la caracterización detallada de la función mitocondrial, principalmente en células vivas. Los protocolos también proporcionan una estrategia basada en citometría de flujo de tinción conjunta para adquirir y analizar múltiples funciones mitocondriales,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	Anticuerpo primario; uso como 1:100, 10 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-conejo IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticuerpo secundario.
anti-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	Anticuerpo primario; úselo como 1:100, 10 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar Alexa Fluor ® 594 IgG anti-ratón de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11005) como anticuerpo secundario.
anti-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	Anticuerpo primario; uso como 1:100, 10 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-conejo IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticuerpo secundario.
anti-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	Anticuerpo primario; uso como 1:100, 10 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-conejo IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticuerpo secundario.
anti-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	Anticuerpo primario; uso como 1:50, 20 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar Alexa Fluor ® 594 IgG anti-ratón de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11005) como anticuerpo secundario.
anti-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	Anticuerpo primario; uso como 1:100, 10 μ L en 1000 μ Solución de tinción L;   usar Alexa Fluor ® 594 IgG anti-pollo de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11042) como anticuerpo secundario.
anti-S100 y beta;   conjugado con Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	Anticuerpo primario; úselo como 1:400, 2.5 μ L en 1000 μ Solución de tinción L;
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Anticuerpo primario; uso como 1:100, 10 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-conejo IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticuerpo secundario.
anti-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	Anticuerpo primario; uso como 1:1000, 1 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar Alexa Fluor ® 594 IgG anti-ratón de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11005) como anticuerpo secundario.
anti-Sinaptofisina	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	Anticuerpo primario; úselo como 1:100, 10 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-conejo IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticuerpo secundario.
anti-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	Anticuerpo primario; úselo como 1:100, 10 μ L en 1000 μ Solución de tinción L;   usar Alexa Fluor ® 594 IgG anti-pollo de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11042) como anticuerpo secundario.
anti-TFAM conjugado con Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Anticuerpo primario; uso como 1:400, 2.5 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; utilizar IgG2b  monoclonal de ratón; Alexa Fluor® 488 como control de isotipo.
anti-TOMM20 conjugado con Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Anticuerpo primario; uso como 1:400, 2.5 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar IgG2a monoclonal de ratón  Alexa Fluor® 488 como control de isotipo.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Anticuerpo primario; uso como 1:1000, 1 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; usar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-conejo IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticuerpo secundario; utilizar IgG monoclonal de conejo como control de isotipo.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Anticuerpo primario; uso como 1:1000, 1 μ L en 1000 μ Solución de tinción L;   usar Alexa Fluor ® 488 cabra anti-conejo IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticuerpo secundario; utilizar IgG monoclonal de conejo como control de isotipo.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Anticuerpo primario; uso como 1:1000, 1 μ L en 1000 μ Solución de tinción L; uso  Alexa Fluor ® 488 cabra anti-ratón IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11001) como anticuerpo secundario; utilizar IgG monoclonal de ratón como control de isotipo.
Activina A	PeproTech	120-14E Medio de	diferenciación de astrocitos Ingrediente
ABM Medio basal	Lonza	CC-3187	basal para cultivo de astrocitos
AGM SingleQuots Pack de suplementos	Lonza	CC-4123	Suplemento para el cultivo de astrocitos
Antibiótico-Antimicótico	Thermo Fisher Scientific	15240062	CDM ingrediente
Avanzado DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	Medio basal para diluir Geltrex
Albúmina sérica bovina	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Agente bloqueante para evitar la unión inespecífica de anticuerpos en ensayos de inmunotinción y CDM ingrediente
BDNF	PeproTech	450-02	DA neuronas medio ingrediente
B-27 Suplemento	Thermo Fisher Scientific	17504044	Ingrediente del medio de diferenciación de astrocitos
BD Accuri C6 Plus Citómetro de flujo	BD Biosciences, EE. UU.
Concentrado de lípidos químicamente definido	Thermo Fisher Scientific	11905031	Ingrediente CDM
Colagenasa IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reactivo para la disociación suave de iPSC humanas
Cámara de microscopio CCD Leica DFC3000 G	Leica Microsistemas, Alemania
Placas de cultivo no tratadas	de Corning CLS430589 Sigma-Aldrich		Cultivo en suspensión
DPBS	Thermo Fisher Scientific		14190250 Se utiliza para una variedad de lavado de cultivos celulares
DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10565018	Diferenciación de astrocitos Medio basal
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reactivo para la disociación suave de iPSCs humanas
Medio basal Essential 8 Thermo	Fisher Scientific A1516901		Medio basal para cultivo de iPSC
Suplemento Essential 8 (50X)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Suplemento para cultivo de iPSC
EGF Proteína humana recombinante	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	Suplemento para cultivo NSC
FGF-básico (AA 10– 155) Proteína humana recombinante	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Suplemento para el cultivo de NSC
Suero fetal bovino	Sigma-Aldrich	12103C	Ingrediente medio
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Ingrediente del medio de diferenciación de astrocitos
FCCP	Abcam	ab120081	Elimina el potencial de membrana mitocondrial y la tinción de TMRE
Sistema de aspiración de fluidos BVC control	Vacuubrand, Alemania
Formaldehído (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Fijación
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Se utiliza para la fijación y el mantenimiento de iPSCs humanas
Suplemento GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Suplemento para el cultivo de
NSC GDNF	Peprotech	450-10	DA neuronas medio
ingrediente Glicina	Sigma-Aldrich	G8898	Se utiliza para bloquear el tampón
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31765027	Medio basal para CDM
Heregulina beta-1 humano	Sigma-Aldrich	SRP3055	Ingrediente del medio de diferenciación de astrocitos
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Tiñe los núcleos para obtener una imagen confocal
Incubadoras de CO2 Heracell 150i	Fisher Scientific, EE. UU.
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Medio basal para la
insulina	Ingrediente de		1376497 CDM
en solución InSolution Inhibidor de AMPK	Sigma-Aldrich 171261		Ingrediente del medio de inducción neural
Factor de crecimiento similar a la insulina-I humano	Sigma-Aldrich	I3769	Medio de diferenciación de astrocitos
Ingrediente Medio KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Medio basal para cultivo de NSC
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Promueve la unión y el crecimiento de células neuronales in vitro
Microscopio confocal Leica TCS SP8 STED	Leica Microsystems, Alemania
Monotioglicerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingrediente
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	Utilizado para el indicador de volumen mitocondrial
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	Utilizado para el indicador de ROS mitocondrial
N-acetil-L-cisteína	Sigma-Aldrich	A7250	Neural ingrediente del medio de inducción
N-2 Supplement	Thermo Fisher Scientific		17502048 Ingrediente del medio de diferenciación de astrocitos
Suero normal de cabra	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Se utiliza para bloquear el tampón
Agitadores orbitales - SSM1	Stuart Equipment, Reino Unido
Solución de poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich	P4957	Promueve la unión y el crecimiento de las células neuronales in vitro
Hidrobromuro de poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P7405	Promueve la unión y el crecimiento de las células neuronales in vitro
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promueve la diferenciación de las neuronas DA
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Montaje del cubreobjetos para imagen
confocalPBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Se utiliza para una variedad de lavados
Recombinante Humano/Ratón FGF-8b Proteína	R& D Systems	423-F8-025/CF	Promueve la diferenciación de las neuronas DA
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP Ingrediente del	medio de inducción neuronal
StemPro StemPro Neural Supplement Thermo	Fisher Scientific	A10508-01	Suplemento para el cultivo de NSCs
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific	12604013	Reactivo de disociación celular
Transferrin	Ingrediente	de Roche 652202 MDL
TRITON: X-100	VWR International	9002-93-1	Se utiliza para la permeabilización de células en ensayos de inmunotinción
TMRE	Abcam	ab113852	Se utiliza para la tinción de potencial de membrana mitocondrial
Baño de agua Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant	Instruments Grant Instruments, EE. UU.