El protocolo describe la preparación de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) con fragmentos de membrana celular inmovilizados que contienen proteínas funcionales del receptor B de tropomiosina quinasa transmembrana. También se explica el uso de columnas de CMAC en la identificación de metabolitos vegetales especializados que interactúan con estos receptores y están presentes en mezclas naturales complejas.
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Artículo de método
Columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular para identificar metabolitos especializados de plantas que interactúan con el receptor B inmovilizado de tropomiosina quinasa
En este artículo
Resumen
Resumen
Los productos químicos sintetizados por plantas, hongos, bacterias e invertebrados marinos han sido una rica fuente de nuevos golpes y plomos de drogas. Medicamentos como las estatinas, la penicilina, el paclitaxel, la rapamicina o la artemisinina, comúnmente utilizados en la práctica médica, se han identificado y aislado por primera vez de productos naturales. Sin embargo, la identificación y el aislamiento de metabolitos especializados biológicamente activos de fuentes naturales es un proceso desafiante y lento. Tradicionalmente, los metabolitos individuales se aíslan y purifican a partir de mezclas complejas, después de la extracción de biomasa. Posteriormente, las moléculas aisladas se prueban en ensayos funcionales para verificar su actividad biológica. Aquí presentamos el uso de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) para identificar compuestos biológicamente activos directamente a partir de mezclas complejas. Las columnas CMAC permiten la identificación de compuestos que interactúan con proteínas transmembrana funcionales inmovilizadas (TMP) incrustadas en su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos. Este es un enfoque dirigido, que requiere conocer el TMP cuya actividad se pretende modular con el candidato a fármaco de molécula pequeña recientemente identificado. En este protocolo, presentamos un enfoque para preparar columnas de CMAC con el receptor de tropomiosina quinasa B (TrkB) inmovilizado, que se ha convertido en un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para ensamblar la columna CMAC con receptores TrkB inmovilizados utilizando líneas celulares de neuroblastoma que sobreexpresan los receptores TrkB. Además, presentamos el enfoque para investigar la funcionalidad de la columna y su uso en la identificación de metabolitos especializados de plantas que interactúan con los receptores TrkB.
Introducción
Las mezclas botánicas son ricas en compuestos farmacológicamente activos1, sirviendo como una buena fuente para la identificación de nuevos fármacos golpea y conduce 2,3,4,5. El descubrimiento de nuevos medicamentos a partir de productos naturales ha sido un enfoque fructífero y muchos medicamentos actualmente aprobados se originaron a partir de compuestos identificados por primera vez en la naturaleza. La diversidad química de los compuestos naturales es difícil de igualar por las bibliotecas artificiales de molécula....
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Protocolo
1. Cultivo celular de células de neuroblastoma SH-SY5Y (líneas celulares TrkB y TrkB-NULL (parentales))
NOTA: Las líneas celulares (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) y SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 fueron compradas a Kerafast. Las células cultivadas se utilizan como fuente de los receptores transmembrana a inmovilizar para la preparación de columnas CMAC. Los siguientes pasos describen cómo obtener fragmentos de membrana celular y ensamblar columnas CMAC funcionales.
- Cultive las células en un medio de cultivo celular preparado mezclando 450 ml d....
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Resultados
Siguiendo el protocolo, se ensamblaron dos columnas cromatográficas CMAC: una con los fragmentos de membrana celular de neuroblastoma SH-SY5Y inmovilizados con TrkB sobreexpresado y otra con fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. La columna CMAC correctamente ensamblada se presenta en la Figura 1 y los pasos involucrados en la inmovilización de fragmentos de membrana celular se presentan en la Figura 2.
Desde la inmovilizac.......
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Discusión
La identificación de compuestos activos presentes en mezclas complejas de metabolitos especializados es una tarea muy desafiante23. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan y su actividad se prueba en diferentes ensayos. Este enfoque requiere mucho tiempo y es costoso y a menudo conduce al aislamiento y la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados23. Los ensayos de cribado de alto rendimiento utilizados actualmente dependen en gran.......
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Divulgaciones
Lukasz Ciesla colabora con Regis Technologies, el proveedor del IAM. PC. Partículas DD2.
Agradecimientos
Z.C.A. fue apoyado por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK) 2219- Programa Internacional de Becas de Investigación Postdoctoral. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Centro Nacional de Medicina Complementaria e Integrativa de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio 1R41AT011716-01. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por la American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, regis Technologies grant to L.C. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 7-8 Hidrato de dihidroxiflavona | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥ 98% (HPLC) |
| Adenosina 5'-trifosfato (ATP) sal disódica hidrato | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| Acetato de amonio | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| Anticuerpo BDNF | Invitrogen | PA5-15198-400 μ L | Anticuerpo primario; 2 mg/mL de concentración |
| Clorhidrato de benzamidina | hidrato Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) humano | Sigma-Aldrich | B3795-10 μ g | Recombinante, expresado en E. coli, polvo liofilizado, apto para cultivo celular |
| Cloruro de calcio | VWR Analítica | BDH9224-1 kg | |
| Ácido cólico sal sódica | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| Homogeneizador de onzas | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (longitud total), 32 x 140 mm (diámetro exterior x alto) |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| Suero fetal bovino | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | estéril filtrado, apto para cultivo celular |
| G418 solución salina de disulfato | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL en H2O, 0,1 μ m filtrado, apto para cultivo celular |
| Glicerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| Membrana artificial inmovilizada (IAM. PC. DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | VWR Analítica | BDH9244-500 mL | |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon C2 DUVb | Microscopio de barrido láser confocal | Nikon | |
| Suero de cabra normal (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| Cloruro de potasio | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Grado proteómico, que contiene 50 mM AEBSF, 30 y micro; M aprotonina, 1 mM bestatina, 1 mM E-64 y 1 mM leupeptina |
| RPMI-1640 | medio Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | con L-glutamina y bicarbonato de sodio, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular |
| Anticuerpo secundario cabra anti-conejo IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Líneas celulares de neuroblastoma que expresan Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Línea celular Trk-NULL | Kerafast | ECP005 | |
| Tubo de diálisis de piel de serpiente | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, diámetro interno seco de 35 mm. |
| Azida sódica | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Cloruro sódico | BDH VWR Analítica | BDH9286-2,5 kg | |
| Tricornio 5/20 columna | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| Solución de tripsina-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0,25%, filtrado estéril, apto para cultivo celular, 2,5 g de tripsina porcina y 0,2 g EDTA |
Referencias
- Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578(2018).
- Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M.
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Reimpresiones y permisos
