Aislamiento de células primarias del músculo liso aórtico específicas del paciente y mediciones semicuantitativas de contracción en tiempo real in vitro

Resumen

Este artículo describe un método basado en el cultivo de explantes para el aislamiento y cultivo de células primarias del músculo liso aórtico humano específico del paciente y fibroblastos dérmicos. Además, se presenta un nuevo método para medir la contracción celular y el análisis posterior, que se puede utilizar para estudiar las diferencias específicas del paciente en estas células.

Resumen

Las células del músculo liso (SMC) son el tipo de célula predominante en los medios aórticos. Su maquinaria contráctil es importante para la transmisión de la fuerza en la aorta y regula la vasoconstricción y la vasodilatación. Las mutaciones en los genes que codifican para las proteínas del aparato contráctil SMC están asociadas con enfermedades aórticas, como los aneurismas de la aorta torácica. Medir la contracción de SMC in vitro es un desafío, especialmente de una manera de alto rendimiento, que es esencial para la detección de material del paciente. Los métodos actualmente disponibles no son adecuados para este propósito. Este artículo presenta un nuevo método basado en la detección de impedancia célula-sustrato eléctrico (ECIS). En primer lugar, se describe un protocolo de explante para aislar las SMC primarias humanas específicas del paciente a partir de biopsias aórticas y fibroblastos dérmicos primarios humanos específicos del paciente para el estudio de los aneurismas aórticos. A continuación, se da una descripción detallada de un nuevo método de contracción para medir la respuesta contráctil de estas células, incluido el análisis posterior y la sugerencia para comparar diferentes grupos. Este método se puede utilizar para estudiar la contracción de las células adherentes en el contexto de estudios traslacionales (cardiovasculares) y estudios de detección de pacientes y fármacos.

Introducción

Las células del músculo liso (SMC) son el tipo de célula predominante en la capa medial aórtica, la capa más gruesa de la aorta. Dentro de la pared, están orientados radialmente y están implicados, entre otras funciones, en la vasoconstricción y vasodilatación¹. La maquinaria contráctil SMC está implicada en la transmisión de la fuerza en la aorta a través del enlace funcional con la matriz extracelular². Las mutaciones en genes que codifican para las proteínas del aparato contráctil SMC, como la cadena pesada de miosina del músculo liso (MYH11) y la actina del músculo liso (ACTA2), se han relacionado con casos de aneurismas aórticos torácicos familiares, lo que subraya la relevancia de la contracción SMC en el mantenimiento de la integridad estructural y funcional de la aorta ^1,2 . Además, las mutaciones en la vía de señalización TGFβ también se asocian con aneurismas aórticos, y sus efectos en la fisiopatología del aneurisma aórtico también se pueden estudiar en fibroblastos cutáneos³.

La medición de alto rendimiento de la contracción de SMC in vitro es un desafío. Como la contractilidad de SMC no se puede medir in vivo en humanos, los ensayos in vitro en células humanas presentan una alternativa factible. Además, el desarrollo del aneurisma aórtico abdominal (AAA) en modelos animales es inducido químicamente por, por ejemplo, la perfusión de elastasa o causado por una mutación específica. Por lo tanto, los datos en animales no son comparables al desarrollo de AAA en humanos, que en su mayoría tiene una causa multifactorial, como fumar, la edad y / o la aterosclerosis. In vitro Hasta ahora, la contractilidad de SMC se ha medido principalmente mediante microscopía de fuerza de tracción ^4,5, cuantificación de flujos de calcio intracelulares de fluorescencia Fura-2⁶ y ensayos de arrugas de colágeno⁷. Si bien la microscopía de fuerza de tracción proporciona una visión numérica invaluable de las fuerzas generadas por una sola célula, no es adecuada para la detección de alto rendimiento debido al complejo procesamiento matemático de datos y el análisis de una célula a la vez, lo que significa que lleva mucho tiempo medir un número representativo de células por donante. Los ensayos de colorante Fura-2 y arrugas de colágeno permiten la determinación superficial de la contracción y no dan una salida numérica precisa, lo que los hace menos adecuados para discriminar las diferencias específicas del paciente. La alteración de la contracción de SMC en células derivadas de la aorta de pacientes con aneurisma aórtico abdominal se demostró por primera vez mediante la optimización de un nuevo método para medir la contracción de SMC in vitro⁸. Esto se hizo reutilizando el método de detección de impedancia célula-sustrato eléctrico (ECIS). ECIS es un ensayo en tiempo real de rendimiento medio para la cuantificación del comportamiento y la contracción de las células adherentes ^9,10,11, como el crecimiento y el comportamiento de SMC en ensayos de cicatrización de heridas y migración 12,13,14. El método exacto se describe en la sección de protocolo. De esta manera optimizada, el ECIS también se puede utilizar para estudiar la contracción de los fibroblastos debido a su tamaño y morfología similares.

El objetivo de este artículo es proporcionar una descripción gradual del método para medir la contracción de SMC in vitro utilizando ECIS⁸ y comparar la contracción entre los SMC de control y pacientes. En primer lugar, se explica el aislamiento y el cultivo de los SMC primarios a partir de biopsias de control y aórticas de pacientes, que pueden utilizarse para la medición de la contracción. En segundo lugar, se describen las mediciones y el análisis de la contracción, junto con la verificación de la expresión del marcador SMC. Además, en este trabajo se describe el método para el aislamiento de fibroblastos dérmicos específicos del paciente cuya contracción puede medirse utilizando la misma metodología. Estas células pueden ser utilizadas para estudios específicos del paciente centrados en el aneurisma aórtico u otras patologías cardiovasculares¹⁵ o estudios pronósticos utilizando un protocolo de transdiferenciación que permite la medición de la contracción antes de la cirugía de aneurisma¹⁶.

Protocolo

NOTA: Las biopsias aórticas se obtuvieron durante la reparación de aneurismas abiertos en los Centros Médicos de la Universidad de Ámsterdam, el Centro Médico de la Universidad VU, Ámsterdam, zaans Medisch Centrum, el hospital Zaandam y Dijklander, Hoorn, Países Bajos. El tejido aórtico de control se obtuvo a partir de la pieza de la aorta unida a la arteria renal cosechada para trasplantes renales. Solo se incluyeron pacientes mayores de 18 años, y todos los pacientes dieron su consentimiento informado para participar en el estudio. Todo el material fue recolectado de acuerdo con las regulaciones de la Declaración de Helsinki de la AMM y las pautas institucionales del Comité de Ética Médica del Centro Médico VU. Todos los experimentos y protocolos experimentales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética Médica del Centro Médico VU. Para obtener información completa sobre el control y las líneas celulares de pacientes utilizadas, consulte ⁸.

1. Aislar los SMC humanos primarios de biopsias aórticas

NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril. Use guantes y use técnicas asépticas estándar cuando manipule muestras de sangre humana y tejido humano. Los SMC se cultivan en 231 medios basales de células del músculo liso vascular humano suplementados con penicilina de 100 U / ml, estreptomicina de 100 μg / ml y suplemento de crecimiento muscular liso conocido como medio SMC.

1. Esteriliza dos pares de pinzas quirúrgicas y un bisturí sumergiéndolas en etanol al 70% y posteriormente secándolas.
2. Pipeta 2 mL de medio SMC en una placa de Petri en la que se realizará la disección tisular.
3. Pipete 2,5 mL de medio SMC en dos matraces T25. Gire los matraces alrededor para que el pequeño volumen de medio cubra toda la superficie.
4. Transportar la biopsia de la pared aórtica humana recolectada desde el quirófano hasta el laboratorio en hielo en un tubo de plástico estéril con solución de transferencia de tejido frío y estéril (consulte la Tabla de materiales) o NaCl al 0,9%.
5. Abra el tubo con el tejido dentro de la campana de cultivo de tejidos. Saque la biopsia del tubo con los fórceps esterilizados y colóquela en la placa de Petri (Figura 1A).
6. Inspeccione visualmente la biopsia para identificar las tres capas aórticas, la túnica íntima (interna), media (media) y adventicia (capa externa). Busque la presencia de placas ateroscleróticas en el lado íntimo y tejido conectivo viscoso en el lado adventicio (Figura 1B) para distinguir las capas.
7. Para aislar las SMC de los medios, quite las otras dos capas. Coloque primero el tejido con el lado de la placa íntima hacia arriba (Figura 1B). Retire la placa sólida alejándola del tejido con fórceps mientras empuja el tejido hacia abajo con el otro par de fórceps. Retire las capas posteriores de placa hasta que la capa medial rosada y uniforme sea visible.
8. Voltee el tejido (Figura 1C). Repita el mismo procedimiento, como en el paso 1.7, sacando la capa adventitial (Figura 1D). Asegúrese de eliminar todas las partes visibles en tantos intentos como sea necesario, ya que esta capa no se separará fácilmente de los medios.
   NOTA: Es esencial que las capas íntimas y adventicias se eliminen adecuadamente para obtener una población SMC lo más limpia posible.
9. Una vez aislada la capa medial, cortar el tejido en cubos de aproximadamente 1 mm x 1 mm x 1 mm. Presione los medios hacia abajo con fórceps y corte el tejido en una dirección con el bisturí. No corte hacia adelante y hacia atrás; hacer cortes limpios y unidireccionales para minimizar el daño. Trate de hacer tantos cubos como sea posible, dado el tamaño de la biopsia (Figura 1E).
10. Coloque las piezas de tejido en el cuarto superior del matraz T25 usando las pinzas. Coloque 10-20 cubos por matraz si la cantidad de material lo permite (Figura 1F).
    NOTA: Use fórceps lisos para minimizar la adhesión del tejido a las costillas de los fórceps y separe fácilmente el tejido en el matraz.
11. Incubar los cubos de tejido en los matraces T25 durante aproximadamente 10 días al 5% de CO₂ a 37 °C en una incubadora.
    NOTA: Se espera el primer crecimiento celular alrededor de ese momento. Las células que migran inicialmente pueden parecer más pequeñas que las SMC normales.
12. Una vez que se observe el crecimiento celular, agregue 2.5 ml de medio al matraz, asegurándose de no pipetearlo sobre las piezas de tejido para evitar que se desprendan.
13. Después de aproximadamente 5 días más, cuando se observan grupos de células alrededor de las piezas de tejido, cambie el medio de cultivo. Si las piezas de tejido se desprenden, retírelas ya que no se volverán a unir.
14. Una vez que las células sean 80-90% confluentes, transfiéralas a un matraz T75 y continúe cultivando en este formato.
    NOTA: Se recomienda una relación de división de 1:2 o 1:3. Congele una copia de seguridad de las células en un pasaje temprano. Las células generalmente mantienen sus propiedades hasta el paso 10; los pasajes posteriores no deben usarse para experimentos.

2. Aislar fibroblastos dérmicos primarios de biopsias de piel

NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril. Use guantes y use técnicas asépticas estándar cuando manipule muestras de sangre humana y tejido humano. Los fibroblastos se cultivan en medio basal suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina, conocida como medio de fibroblastos.

1. Esterilizar dos pares de pinzas quirúrgicas y un bisturí sumergiéndolas en etanol al 70 % y posteriormente secándolas.
2. Pipeta 2 mL de medio fibroblástico en una placa de Petri en la que se realizará la disección tisular.
3. Pipetear 2,5 ml de medio fibroblasto en dos matraces T25. Gire los matraces alrededor para que el pequeño volumen de medio cubra toda la superficie.
4. Transportar la biopsia de piel recolectada desde el quirófano hasta el laboratorio sobre hielo en solución de transferencia de tejido estéril y fría (consulte la Tabla de materiales) o NaCl al 0,9% en un tubo de plástico estéril.
5. Abra el tubo con el tejido dentro de la campana de cultivo de tejidos. Saque la biopsia del tubo con los fórceps esterilizados y colóquela en la placa de Petri (Figura 2A).
6. Inspeccione visualmente la biopsia para identificar las tres capas de la piel, la epidermis, la dermis y la grasa subcutánea. Busque una superficie de piel reconocible, a veces con vello visible, para identificar la epidermis. En el lado opuesto, busque la grasa subcutánea, que a menudo es amarilla y viscosa. Identificar la capa entre la epidermis y la grasa subcutánea como la dermis, la fuente de fibroblastos viables (Figura 2B).
7. Para aislar los fibroblastos de la dermis, retire las otras dos capas y coloque el tejido de lado para que las tres capas sean visibles.
   NOTA: A diferencia del tejido aórtico, las capas de la piel no se pueden separar entre sí; por lo tanto, deben cortarse. El tejido también es más gomoso, lo que hace que sea más difícil de cortar. Use un bisturí afilado.
8. Sostenga el tejido con fórceps. Corte en paralelo al borde entre la epidermis y la dermis. Cortar toda la epidermis. Trate de cortar en una línea limpia y no se mueva hacia adelante y hacia atrás para evitar daños en los tejidos.
9. Voltee el tejido. Repita el mismo procedimiento que en el paso 2.8; esta vez, cortado dentro de la dermis paralela al borde con la grasa subcutánea.
10. Una vez aislada la dermis, cortar el tejido en cubos de aproximadamente 1 x 1 x 1 mm³. Presione el tejido hacia abajo con fórceps y corte el tejido en una dirección con el bisturí. No corte hacia adelante y hacia atrás; hacer cortes limpios y unidireccionales para minimizar el daño. Trate de hacer tantos cubos como sea posible, dado el tamaño de la biopsia (Figura 2C).
11. Coloque las piezas de tejido en el cuarto superior del matraz T25 usando las pinzas. Coloque 10-20 cubos por matraz si la cantidad de material lo permite (Figura 2D).
    NOTA: Use fórceps lisos para minimizar la adhesión del tejido a las costillas de los fórceps y separe fácilmente el tejido en el matraz.
12. Incubar los cubos de tejido en los matraces T25 durante aproximadamente 10 días al 5% de CO₂ a 37 °C en una incubadora.
    NOTA: Se espera el primer crecimiento celular alrededor de entonces. Las células que migran inicialmente pueden parecer más pequeñas que los fibroblastos normales.
13. Una vez que se observe el crecimiento celular, agregue 2.5 ml de medio al matraz, asegurándose de no pipetearlo sobre las piezas de tejido para evitar que se desprendan.
14. Después de aproximadamente 5 días más, cuando se puedan observar grupos de células alrededor de las piezas de tejido, cambie el medio de cultivo. Si las piezas de tejido se desprenden, retírelas ya que no se volverán a unir.
15. Una vez que las células sean 80-90% confluentes, transfiéralas a un matraz T75 y continúe cultivando en este formato.
    NOTA: Se recomienda una relación de división de 1:2 o 1:3. Congele una copia de seguridad de las células en un pasaje temprano. Las células generalmente mantienen sus propiedades hasta el paso 10; los pasajes posteriores no deben usarse para experimentos.

3. Medición de la contracción (ejemplos de SMC)

1. Prepare una matriz ECIS 96w10e (consulte la Figura 3A para obtener una imagen representativa de la matriz con electrodos y celdas ampliadas sembrados en los electrodos).
   NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril.
   1. Cubra una matriz estéril 96w10e con 200 μL de L-cisteína de 10 mM por pozo durante 30 min a temperatura ambiente.
   2. Lave el plato dos veces con agua estéril. Deje que la placa se seque durante la noche en la campana de cultivo de tejidos con la tapa ligeramente abierta.
      NOTA: El recubrimiento de la placa con L-cisteína solo es necesario cuando se usa la placa por primera vez.
   3. Al día siguiente, esterilizar uv la placa y la tapa durante 30 min. Gire la tapa hacia arriba para que el interior esté esterilizado. Una vez esterilizada la placa, no la abra fuera de la campana de flujo.
2. Células de siembra en la matriz ECIS
   1. Precalentar la solución de gelatina estéril al 1% en el baño de agua durante 30 min.
      NOTA: La solución se almacena en el refrigerador y puede solidificarse, lo que dificulta la pipeta.
   2. Posteriormente, cubra los pocillos con 100 μL de la solución de gelatina al 1 % por pocillo e incube la placa a 37 °C durante al menos 1 h.
   3. Aspirar la gelatina de los pozos.
   4. Cuente las células utilizando un contador celular automatizado y sembra los SMC por triplicado a una densidad de siembra de 30,000 células / pozo en 200 μL de medio SMC.
   5. Coloque la placa con los SMC en el soporte de 96 pocillos ECIS en la incubadora de cultivo celular. Haga doble clic en el software ECIS Applied Biophysics para abrir el programa y pulse el botón Configuración .
   6. Compruebe si todos los electrodos tienen contacto con el soporte (verde; rojo si no hay conexión) en el panel inferior izquierdo etiquetado como Configuración de pozo. Si los electrodos no están conectados correctamente, ajuste la placa en el soporte antes de comenzar la medición.
   7. Seleccione el tipo de placa (matriz de 96 pocillos) en el mismo panel haciendo clic en Tipo de matriz.
   8. En el panel superior derecho Configuración de recopilación de datos, haga clic en frecuencia única y cambie el valor de impedancia a 4000 Hz y el intervalo a 8 s.
   9. Haga clic en el botón Inicio para iniciar las mediciones. Espere a que se abra un nuevo panel, donde se puede guardar el archivo ECIS.
   10. Permita que las células se adhieran y establezca una monocapa durante 48 h.
       NOTA: La fijación y propagación de celdas en los electrodos generan un valor de resistencia de referencia (Figura 3B).
3. Estimulación de las células para inducir la contracción
   1. Inducir la contracción de SMC estimulando las células con 10 μg/mL del ionóforo de calcio, ionomicina.
      NOTA: La ionomicina inducirá la afluencia de Ca²⁺ extracelular, activando la cascada contráctil; ver Figura 4A para imágenes representativas de células contraídas no estimuladas y estimuladas.
   2. Diluir 1 mg de ionomicina en polvo en 100 μL de dimetilsulfóxido para hacer una solución madre de 10 mg/ml, y almacenar 10 μL de alícuotas a -20 °C. Antes de usar, diluya la solución de ionomicina 1:10 en medio SMC para preparar la solución de trabajo que se agregará a las células.
   3. Realice la estimulación celular mientras la matriz todavía está en el soporte de la matriz dentro de la incubadora de cultivo celular y los electrodos están conectados al sistema.
      1. Para estimular las células, retire la tapa y colóquela sobre una superficie estéril dentro de la incubadora. Preparar dos pipetas, fijadas a 2 μL y 150 μL.
      2. Antes de iniciar la estimulación, presione Marcar en el software y coloque un comentario.
         NOTA: Esto hará que sea más fácil encontrar el momento exacto de la estimulación al analizar los datos.
      3. Pipetear 2 μL de la solución de trabajo de ionomicina en cada pozo lo más rápido posible. Una vez que todas las células hayan sido estimuladas, mezcle el medio en los pocillos usando la segunda pipeta.
         NOTA: Debido a los efectos rápidos, no es necesario cambiar las puntas entre diferentes líneas celulares y condiciones. Trabaja rápidamente mientras estimulas y mezclas porque la ionomicina tiene un efecto agudo. Al estimular una placa llena, estimule un máximo de 3 columnas a la vez. Después de cada estimulación, espere al menos 30 minutos hasta la siguiente estimulación para permitir que las células se recuperen de la temperatura y el cambio de CO₂ causado por la apertura de la puerta de la incubadora.
      4. Inmediatamente después de que se realice la estimulación, presione Marcar nuevamente para agregar un comentario de que la estimulación está hecha.
   4. Finalizando el experimento de estimulación
      1. Registre los valores de impedancia durante aproximadamente 5 minutos después de la estimulación con ionomicina. Finalice la grabación presionando Finalizar.
      2. Reutilice las matrices ECIS hasta tres veces: lave los pozos dos veces con agua estéril e incube la placa a 37 °C durante 2-3 h con tripsina o un reactivo similar. Repita los pasos 3.1.2 y 3.1.3.
4. Exportación de los datos
   1. Para exportar los datos, haga clic en archivo | Exportar datos | A Excel (seleccionado). Seleccione una carpeta para guardar el archivo.
   2. Haga clic en Separar cuando el programa le pida combinar o separar hojas.
5. Análisis de la salida contráctil
   1. Para calcular la respuesta contráctil, utilice la siguiente ecuación (1), donde C indica contracción (expresada en % de cambio en comparación con el valor basal), la prestimulación (PrS) indica el valor de resistencia (expresado en Ω) justo antes de la estimulación con ionomicina y la postestimulación (PoS) indica la resistencia (expresada en Ω) 2 min después de finalizar la estimulación.
      (1)
      NOTA: Como se muestra en la ecuación (1), el valor de impedancia de un medio de cultivo bien lleno de células sin ninguna celda adjunta (valor de 290 Ω) se resta de todos los resultados en el cálculo final. Se recomienda medir las respuestas contráctiles por triplicado en cada experimento y realizar tres experimentos independientes con la misma línea celular para tener en cuenta cualquier variación inter e intraexperimental.
   2. Una vez realizados los tres experimentos independientes, agrupe los datos calculando el promedio de las tres mediciones, incluida la desviación estándar (DE).
6. Comparación de diferentes grupos
   1. Para definir el rango de contracción normal e investigar preguntas de investigación específicas posteriores, use el grupo de control para definir la "contracción normal" y compararla con la respuesta contráctil de los pacientes o grupos de tratamiento.
   2. Calcule la media y la SD de todo el grupo de control, es decir, de los valores finales para todas las líneas celulares, como se describe en el paso 3.5.2.
   3. Utilice el rango de la media ± 2SD para identificar las células del otro grupo que se encuentran fuera de este rango, lo que indica que tienen una respuesta contráctil alterada.
      NOTA: El mecanismo detrás de la respuesta contráctil alterada está sujeto a preguntas de investigación específicas y depende de las células y la condición y no se discutirá en este protocolo.

4. Detección de la presencia de marcadores específicos de SMC

1. Aislamiento de ARN
   1. Sembrar las mismas líneas celulares específicas del paciente utilizadas para las mediciones de contracción en placas de 6 pocillos, un pocillo por línea celular. Cuente las células utilizando un contador celular automatizado y siembre las células a una densidad de siembra de 200,000 células / pozo en medio SMC y permita que se adhieran durante la noche.
   2. Lave las células una vez con PBS estéril.
   3. Lisa las células y aíslalas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Síntesis de ADNc
   1. Realizar la síntesis de ADNc en 20 μL de una mezcla de reacción de transcripción inversa. Diluya las concentraciones de ARN aislado total de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
3. qPCR
   1. Medir la expresión génica de los genes marcadores SMC, por ejemplo, ACTA2, CNN1, SMTN y TAGLN para confirmar que las células aisladas son realmente SMC y detectar marcadores SMC. Compruebe la correlación de los resultados con la salida contráctil.
   2. Use al menos dos genes de limpieza para normalizar los datos, por ejemplo, YWHAZ y TBP.
      NOTA: La ejecución y el análisis de qPCR se pueden realizar utilizando diferentes máquinas de PCR y software compatible, dependiendo de lo que esté disponible y optimizado en el laboratorio. Consulte la Tabla suplementaria S1 para ver las secuencias de imprimación.

Resultados

Para probar la reproducibilidad de este método, el método se validó primero utilizando SMC de control solamente. Para determinar la reproducibilidad de la medición interexperimental, se trazaron dos mediciones independientes de todas las líneas celulares de control y pacientes incluidas como una gráfica de Bland-Altman (Figura 3B). La gráfica demostró que este método no muestra variabilidad fuera del intervalo de confianza, a excepción de una línea celular atípica. Además, estos resultados d...

Discusión

Este artículo presenta un método para medir la contracción de SMC in vitro, basado en los cambios en la impedancia y la ocupación de la superficie. Primero, se describe el aislamiento, el cultivo y la expansión de los SMC humanos primarios específicos del paciente y los fibroblastos de la piel, seguidos de cómo usarlos para las mediciones de contracción.

Una limitación del estudio está relacionada con la obtención de las células a través de un protocolo de explante. Las células que p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Array de 96 pocillos	Applied Biophysics	96W10idf PET	Array utilizado para medir la contracción en la configuración ECIS
Custodiol	Dr. Franz Hö hler Chemie GmbH	RVG 12801	Solución utilizada para transferir tejido desde el quirófano hasta el laboratorio
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	472301	Solución utilizada para diluir ionomicina
Suero fetal bovino	Gibco	26140079	Adición al medio de cultivo celular
Mezcla de nutrientes F-10 de Ham's	Gibco	11550043	Medio utilizado para cultivar fibroblastos de piel
Medio basal de células musculares lisas vasculares humanas (anteriormente ''Medium 231'')	Gibco	M231500	Medio utilizado para cultivar células musculares lisas
Invitrogen countess II	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	Contador celular automatizado
Ionomicina sal cálcica de Streptomyces conglobatus	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	Compuesto utilizado para la estimulación de la contracción
NaCl 0.9%	Fresenius Kabi B230561		Solución utilizada para transferir tejido desde el quirófano hasta el laboratorio
Penicilina-estreptomicina	Gibco		15140122 Antibióticos utilizados para el medio de cultivo celular
Solución salina tamponada con fosfato	Gibco	10010023	Se utiliza para lavar células
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055	Kit utilizado para el aislamiento de ARN
Suplemento de crecimiento de músculo liso (SMGS)	Gibco	S00725	Suplemento que se agrega al medio de cultivo de células de músculo liso
SuperScript VILO Kit de síntesis de ADNc	Thermo Fisher Scientific	11754250	Kit utilizado para la síntesis de ADNc
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reactivo para qPCR
Tripsina-EDTA	Gibco	15400-054	Se utiliza para tripsinizar células
ZTheta	Biofísica Aplicada	ZTheta	ECIS instrumento utilizado para mediciones de contracción