Este protocolo describe la dinámica de las infecciones virales utilizando luciferasa y fluorescencia recombinante (r)SARS-CoV-2 y un sistema de imágenes in vivo (IVIS) en ratones transgénicos K18 hACE2 para superar la necesidad de enfoques secundarios necesarios para estudiar las infecciones por SARS-CoV-2 in vivo.
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Artículo de método
Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero
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Resumen
Resumen
La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha sido causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2). Hasta la fecha, el SARS-CoV-2 ha sido responsable de más de 242 millones de infecciones y más de 4,9 millones de muertes en todo el mundo. Al igual que otros virus, el estudio del SARS-CoV-2 requiere el uso de métodos experimentales para detectar la presencia del virus en células infectadas y/o en modelos animales. Para superar esta limitación, generamos proteínas recombinantes (r)SARS-CoV-2 recombinantes (r) competentes para la replicación que expresan proteínas bioluminiscentes (nanoluciferasa, Nluc) o fluorescentes (Venus). Estos rSARS-CoV-2 que expresan reporteros permiten rastrear infecciones virales in vitro e in vivo en función de la expresión de los genes reporteros Nluc y Venus. Aquí el estudio describe el uso de rSARS-CoV-2 / Nluc y rSARS-CoV-2 / Venus para detectar y rastrear la infección por SARS-CoV-2 en el modelo de infección de ratón transgénico K18 de enzima convertidora de angiotensina humana K18 (hACE2) previamente descrito utilizando sistemas de imágenes in vivo (IVIS). Este rSARS-CoV-2/Nluc y rSARS-CoV-2/Venus muestran patogenicidad similar a rSARS-CoV-2/WT y replicación viral in vivo. Es importante destacar que la expresión de Nluc y Venus nos permite rastrear directamente las infecciones virales in vivo y ex vivo, en ratones infectados. Estos rSARS-CoV-2/Nluc y rSARS-CoV-2/Venus representan una excelente opción para estudiar la biología del SARS-CoV-2 in vivo, comprender la infección viral y la enfermedad COVID-19 asociada, e identificar tratamientos profilácticos y/o terapéuticos efectivos para combatir la infección por SARS-CoV-2.
Introducción
El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) es un virus de ARN monocatenario envuelto, de sentido positivo y que pertenece al linaje Betacoronavirus de la familia Coronaviridae 1. Esta familia viral se divide en Alfa-, Beta-, Gamma-, y Delta-coronavirus1. Los alfa y betacoronavirus infectan principalmente a los mamíferos, mientras que los gamma y deltacoronavirus infectan casi exclusivamente a las aves2. Hasta la fecha, siete coronavirus (CoV) han cruzado las barreras de las especies y han surgido como coronavirus humanos (HCoV): dos alfa-CoV (HCoV-229E y HCoV-NL6....
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Protocolo
Los protocolos que involucran ratones transgénicos K18 hACE2 fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) del Instituto de Investigación Biomédica de Texas (TBRI) y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Todos los experimentos siguen las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigaciones40. Se requiere el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando se trabaja con ratones.
1. Uso de ratones transgénicos K18 hACE2
- Comprar y mantener ratones hembra de 4-6 semanas de edad B6.Cg-....
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Resultados
Infección por rSARS-CoV-2/Nluc en ratones transgénicos K18 hACE2 (Figuras 1 y 2)
La Figura 1A muestra una representación esquemática de rSARS-CoV-2/WT (arriba) y rSARS-CoV-2/Nluc (abajo) utilizada para evaluar infecciones in vivo. La Figura 1B muestra el diagrama de flujo esquemático aplicado para evaluar la dinámica de la infección por rSARS-CoV-2/Nluc en ratones transgénicos K18 hACE2........
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Discusión
Este protocolo demuestra la viabilidad de utilizar estos genes reporteros que expresan rSARS-CoV-2 para monitorear infecciones virales in vivo. Ambos virus recombinantes que expresan reporteros proporcionan una excelente herramienta para estudiar las infecciones por SARS-CoV-2 in vivo. Los sistemas de imágenes ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) descritos representan una excelente opción para comprender la dinámica de la infección por SARS-CoV-2, la patogénesis vir.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier conflicto de intereses comercial, financiero y no financiero, o personal en relación con el trabajo descrito.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los miembros de nuestro instituto (Instituto de Investigación Biomédica de Texas) por sus esfuerzos para mantener nuestras instalaciones completamente operativas y seguras durante la pandemia de COVID-19. También nos gustaría agradecer a nuestro Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) y hechizo (IACUC) por revisar nuestros protocolos de una manera eficiente en el tiempo. Agradecemos al Dr. Thomas Moran de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai por proporcionar el anticuerpo monoclonal de la proteína 1C7C7 (N) de reactiva cruzada del SARS-CoV. La investigación del SARS-CoV-2 en el laboratorio de Martínez-Sobrido cuenta actualmente con e....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Almacenamiento a temperatura ambiente (RT) |
| 1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10% Solución de formalina, tamponada neutra | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| Placa de cultivo celular de 24 pocillos | Greiner Bio-one | 662160 | |
| Bicarbonato de sodio al 5% | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| Placa de cultivo celular de 6 pocillos | Greiner Bio-one | 657160 | |
| Placa de cultivo celular de 96 pocillos | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Células epiteliales de riñón de mono verde africano (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Software de imagen 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Software de análisis de imágenes | |
| Albúmina sérica bovina (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Tienda en 4 ° C |
| Agua de grado de cultivo celular | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Tienda a 4 ° C |
| Máquina de gas de anestesia | Sistemas de anestesia veterinaria, Inc. | VAS 2001R | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Tienda en -20 ° C |
| Ratones transgénicos hembra K18-hACE2 de cuatro a seis semanas de edad | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Prisma Graphpad Versión 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isoflurano | Baxter | 1001936040 | Tienda en RT |
| MARS Software de análisis de datos | BMG LABTECH | ||
| MB10 tabletas | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Tienda en RT |
| Reactivo de ensayo de luciferasa Nano-Glo | Promega | N1110 | Este reactivo se utiliza para medir la actividad de Nluc. Almacenar a -20 ° C |
| Nunc MicroWell MicroWell de 96 pocillos Microplacas ThermoFisher | Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell MicroPlacas de 96 pocillos | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Almacene a -20 & grados; C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Homogeneizador Evolution | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Homogeneizador de tejidos blandos CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A T75 | |
| EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidasa | Kit | PK-4002 ABC de | y kit de sustrato de peroxidasa DAB |
Referencias
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome cor....
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Reimpresiones y permisos
