Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero

2.7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/63127

⸱

5 de noviembre de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Texas Biomedical Research Institute

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la dinámica de las infecciones virales utilizando luciferasa y fluorescencia recombinante (r)SARS-CoV-2 y un sistema de imágenes in vivo (IVIS) en ratones transgénicos K18 hACE2 para superar la necesidad de enfoques secundarios necesarios para estudiar las infecciones por SARS-CoV-2 in vivo.

Resumen

La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha sido causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2). Hasta la fecha, el SARS-CoV-2 ha sido responsable de más de 242 millones de infecciones y más de 4,9 millones de muertes en todo el mundo. Al igual que otros virus, el estudio del SARS-CoV-2 requiere el uso de métodos experimentales para detectar la presencia del virus en células infectadas y/o en modelos animales. Para superar esta limitación, generamos proteínas recombinantes (r)SARS-CoV-2 recombinantes (r) competentes para la replicación que expresan proteínas bioluminiscentes (nanoluciferasa, Nluc) o fluorescentes (Venus). Estos rSARS-CoV-2 que expresan reporteros permiten rastrear infecciones virales in vitro e in vivo en función de la expresión de los genes reporteros Nluc y Venus. Aquí el estudio describe el uso de rSARS-CoV-2 / Nluc y rSARS-CoV-2 / Venus para detectar y rastrear la infección por SARS-CoV-2 en el modelo de infección de ratón transgénico K18 de enzima convertidora de angiotensina humana K18 (hACE2) previamente descrito utilizando sistemas de imágenes in vivo (IVIS). Este rSARS-CoV-2/Nluc y rSARS-CoV-2/Venus muestran patogenicidad similar a rSARS-CoV-2/WT y replicación viral in vivo. Es importante destacar que la expresión de Nluc y Venus nos permite rastrear directamente las infecciones virales in vivo y ex vivo, en ratones infectados. Estos rSARS-CoV-2/Nluc y rSARS-CoV-2/Venus representan una excelente opción para estudiar la biología del SARS-CoV-2 in vivo, comprender la infección viral y la enfermedad COVID-19 asociada, e identificar tratamientos profilácticos y/o terapéuticos efectivos para combatir la infección por SARS-CoV-2.

Introducción

El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) es un virus de ARN monocatenario envuelto, de sentido positivo y que pertenece al linaje Betacoronavirus de la familia Coronaviridae 1. Esta familia viral se divide en Alfa-, Beta-, Gamma-, y Delta-coronavirus1. Los alfa y betacoronavirus infectan principalmente a los mamíferos, mientras que los gamma y deltacoronavirus infectan casi exclusivamente a las aves2. Hasta la fecha, siete coronavirus (CoV) han cruzado las barreras de las especies y han surgido como coronavirus humanos (HCoV): dos alfa-CoV (HCoV-229E y HCoV-NL63) y cinco beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio [MERS-CoV] y SARS-CoV-2)3,4,5,6. El SARS-CoV, el MERS-CoV y el SARS-CoV-2 son altamente patógenos y causan una infección grave del tracto respiratorio inferior7. Antes de la aparición del SARS-CoV-2, hubo dos brotes epidémicos causados por coV: SARS-CoV en Guangdong Providence, China, de 2002 a 2003, con una tasa de letalidad (CFR) de alrededor del 9,7%; y el MERS-CoV en Oriente Medio desde 2012 hasta la actualidad, con un MCR de alrededor del 34%7,8. El SARS-CoV-2 tiene un CFR general entre el 3,4% y el 49%, y las condiciones subyacentes contribuyen a un CFRmás alto de 8,9. Desde su descubrimiento en diciembre de 2019, en Wuhan, China, el SARS-CoV-2 ha sido responsable de más de 242 millones de infecciones humanas y más de 4,9 millones de muertes humanas en todo el mundo 7,10,11,12. En particular, desde finales de 2020, las nuevas variantes de preocupación (VoC) y las variantes de interés (VoI) del SARS-CoV-2 han afectado las características del virus, incluida la transmisión y la antigenicidad 9,13, y la dirección general de la pandemia de COVID-19. Para el tratamiento de las infecciones por SARS-CoV-2, actualmente solo hay un Estados Unidos (EE. UU.) Antiviral terapéutico (remdesivir) de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y un medicamento de Autorización de Uso de Emergencia (EUA) (baricitinib, que se administrará en combinación con remdesivir)14. También hay 6 anticuerpos monoclonales EUA aprobados: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, administrados juntos), sotrovimab, tocilizumab y bamlanivimab y etesevimab administrados juntos 15,16,17,18,19. Actualmente solo hay una vacuna profiláctica aprobada por la FDA, Pfizer-BioNTech, y otras dos vacunas profilácticas (Moderna y Janssen) han sido aprobadas por la EUA 20,21,22,23,24. Sin embargo, con la tasa de infección no controlada y la aparición de VoC y VoI, el SARS-CoV-2 todavía representa una amenaza para la salud humana. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos enfoques para identificar profilácticos y terapias eficientes para controlar la infección por SARS-CoV-2 y la pandemia de COVID-19 aún en curso.

El estudio del SARS-CoV-2 requiere técnicas laboriosas y enfoques secundarios para identificar la presencia del virus en células infectadas y/o modelos animales validados de infección. El uso de la genética inversa ha permitido la generación de virus recombinantes para responder a preguntas importantes en la biología de las infecciones virales. Por ejemplo, las técnicas de genética inversa han proporcionado medios para descubrir y comprender los mecanismos de la infección viral, la patogénesis y la enfermedad. Del mismo modo, los enfoques de genética inversa han allanado el camino para diseñar virus recombinantes que carecen de proteínas virales para comprender su contribución en la patogénesis viral. Además, se han utilizado técnicas de genética inversa para generar virus recombinantes que expresan genes reporteros para aplicaciones in vitro e in vivo, incluida la identificación de enfoques profilácticos y/o terapéuticos para el tratamiento de infecciones virales. Las proteínas fluorescentes y bioluminiscentes son los genes reporteros más utilizados debido a su sensibilidad, estabilidad y fácil detección basada en la mejora de las nuevas tecnologías25,26. In vitro, se ha demostrado que las proteínas fluorescentes sirven como una mejor opción para la localización de virus en células infectadas, mientras que las luciferasas son más convenientes para estudios de cuantificación 27,28,29. In vivo, las luciferasas son preferidas sobre las proteínas fluorescentes para imágenes de animales enteros, mientras que las proteínas fluorescentes son preferidas para la identificación de células infectadas o imágenes ex vivo 30,31,32. El uso de virus recombinantes que expresan reporteros ha servido como una poderosa herramienta para el estudio de virus en muchas familias, incluyendo, entre otros, flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus y virus de la influenza 28,33,34,35,36.

Para superar la necesidad de enfoques secundarios para estudiar el SARS-CoV-2 y caracterizar la infección por SARS-CoV-2 en tiempo real in vivo, hemos generado proteínas recombinantes (r)SARS-CoV-2 competentes para la replicación que expresan proteínas bioluminiscentes (nanoluferasa, Nluc) o fluorescentes (Venus) utilizando nuestra genética inversa basada en cromosomas artificiales bacterianos (BAC) previamente descrita, que se mantiene como una sola copia en E. coli coli con el fin de minimizar la toxicidad de las secuencias de virus durante su propagación en bacterias37,38. En particular, rSARS-CoV-2 / Nluc y rSARS-CoV-2 / Venus mostraron patogenicidad similar a rSARS-CoV-2 / WT in vivo. El alto nivel de expresión de Venus a partir de rSARS-CoV-2/Venus permitió detectar infección viral en los pulmones de ratones transgénicos K18 hACE2 infectados utilizando un sistema de imágenes in vivo (IVIS)39. Los niveles de expresión de Venus se correlacionaron bien con los títulos virales detectados en los pulmones, lo que demuestra la viabilidad de usar la expresión de Venus como un sustituto válido de la infección por SARS-CoV-2. Usando rSARS-CoV-2/Nluc, pudimos rastrear la dinámica de la infección viral en tiempo real y evaluar longitudinalmente la infección por SARS-CoV-2 in vivo utilizando el mismo enfoque IVIS en ratones transgénicos K18 hACE2.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Los protocolos que involucran ratones transgénicos K18 hACE2 fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) del Instituto de Investigación Biomédica de Texas (TBRI) y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Todos los experimentos siguen las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigaciones40. Se requiere el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando se trabaja con ratones.

1. Uso de ratones transgénicos K18 hACE2

  1. Comprar y mantener ratones hembra de 4-6 semanas de edad B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J (ratones transgénicos K18 hACE2) en un centro de cuidado animal de nivel de bioseguridad (BSL)-2 en condiciones específicas libres de patógenos.
    1. Después de su llegada a las instalaciones de BSL2, permita que los animales se aclimaten durante 7 días y transfiéralos a la instalación de animales BSL-3 para infecciones y otros procedimientos experimentales.
    2. Siguiendo los protocolos de la IACUC, coloque 4 ratones por jaula. Para asegurarse de que el animal ha fallecido, después de la infección de ratones con rSARS-CoV-2 y las imágenes in vivo , eutanasiar a los animales con una dosis letal de Fatal-Plus (>100 mg / kg).

2. Bioseguridad

NOTA: En este manuscrito, rSARS-CoV-2 se genera utilizando los sistemas genéticos inversos basados en BAC para la cepa SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, como se describió anteriormente37. Todos los procedimientos in vivo que involucran infecciones por rSARS-CoV-2 / Nluc o rSARS-CoV-2 / Venus deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica bajo condiciones BSL-3.

  1. Limpie el gabinete de bioseguridad con 2% de Wexicide y 70% de desinfectante de etanol secuencialmente antes y después de realizar todos los procedimientos experimentales descritos en este artículo.
  2. Esterilizar todo el material de disección (tijeras, pinzas de disección, etc.) y el homogeneizador antes y después de cada uso.
  3. Limpie la cámara de aislamiento y desinfecte con tabletas MB10 antes y después de cada uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Deseche todo el material biológico producido durante los procedimientos siguiendo las directrices de IBC e IACUC.

3. Caracterización in vivo de rSARS-CoV-2

  1. Infecciones de ratón
    1. Coloque ratones transgénicos K18 hACE2 hembra de 4 a 6 semanas de edad en jaulas etiquetadas, identifique a los ratones en cada jaula usando un código de punción en el oído y coloque 4 ratones por jaula. Use un grupo de ratones para el peso corporal y la supervivencia y otro grupo de animales para la titulación viral y las imágenes.
    2. Antes de la infección, afeite el pecho de los ratones en el lado ventral desde el pezón pectoral hasta el área del pezón inguinal para facilitar la señal de bioluminiscencia.
    3. Preparar el inóculo rSARS-CoV-2 con 105 unidades formadoras de placa (PFU)/ratón en condiciones estériles en un volumen total de 50 μL utilizando solución salina tampón de fosfato estéril 1x (PBS).
      NOTA: Calcule la cantidad de rSARS-CoV-2 que se utilizará en la dilución viral con la fórmula: virus necesario = (105 PFU por ratón / 50 μL) x volumen final) / título viral de stock.
    4. Mantenga el inóculo del virus frío sobre hielo.
    5. Utilice los ratones infectados con simulacros (1x PBS) y rSARS-CoV-2 / WT como controles internos. Coloque a los ratones infectados con simulacros en una jaula separada de los ratones infectados con rSARS-CoV-2.
    6. Anestesiar a los ratones utilizando sedación gaseosa de isoflurano al 5% en una cámara de anestesia y mantener con isoflurano al 3%.
    7. Una vez confirmada la reacción postural y el reflejo de enderezamiento, coloque al ratón en la posición de recostado dorsal.
    8. Desalibre el cuello del ratón entre el dedo índice y el pulgar y sostenga la cola contra la palma de la mano con el dedo meñique para sostener al animal en una posición dorsal.
    9. Coloque la punta de la pipeta que contiene 50 μL del inóculo del virus en la fosa nasal y expulse lentamente la solución. Asegúrese de que el inóculo del virus se inhala y no hay reflujo observando la caída del inóculo desapareciendo.
  2. Monitorización de bioluminiscencia de ratones transgénicos K18 hACE2 infectados con rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 1 y Figura 2)
    Nota : este experimento sigue la representación esquemática y utiliza los virus que se muestran en la figura 1. Se requiere una fijación de anestesia isoflurano para el sistema de imágenes in vivo (IVIS). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los instrumentos y sistemas requeridos.
    1. Inicie el software de imágenes y configure los parámetros, haga clic en modo de imagen en Bioluminiscencia, abra el filtro y establezca el tiempo de exposición en automático.
    2. Al inicializar la máquina IVIS, coloque los ratones en la cámara de aislamiento mientras aún están dentro del gabinete de bioseguridad. Inducir ratones con isoflurano a una concentración del 5%. Una vez confirmada la pérdida de la reacción postural y el reflejo corrector, mantener con isoflurano al 3%.
    3. Una vez anestesiados los ratones, sacarlos de la cámara de aislamiento y administrar retro-orbitalmente el sustrato de luciferasa diluido 1:10 en 1x PBS (volumen final 100 μL/ratón) con una aguja de 25 G.
    4. Después de la administración de sustrato de luciferasa, coloque a los ratones de nuevo en la cámara de aislamiento con el pecho hacia arriba y la cavidad nasal dentro del cono del colector para mantener al animal anestesiado durante el procedimiento de imagen.
    5. Transfiera la cámara de aislamiento a la máquina IVIS e instantáneamente después de cerrar la puerta del generador de imágenes IVIS, seleccione Adquirir en el programa de software que desea inicializar (Figura 2A).
    6. Para analizar las imágenes de bioluminiscencia adquiridas, utilice la herramienta ROI (región de interés) en el software para designar la señal precisa y medir el flujo (Figura 2B).
    7. Haga clic en Medir y permita que el sistema comience a evaluar la bioluminiscencia en fotones para proporcionar la emisión absoluta de fotones comparable a las mediciones de salida proporcionadas por los diversos parámetros.
    8. Imagen de ratones a los 1, 2, 4 y 6 días después de la infección.
    9. Después de la toma de imágenes, coloque a los ratones de nuevo en la jaula.
  3. Análisis de fluorescencia en ratones transgénicos K18 hACE2 infectados con rSARS-CoV-2/Venus (Figura 3 y Figura 4)
    NOTA: Este experimento sigue la representación esquemática y rSARS-CoV-2 que se muestra en la Figura 3. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los instrumentos y sistemas requeridos.
    1. Inicie el software de imágenes y configure los parámetros, configure los filtros de excitación (500 nm) y emisión (530 nm), haga clic en el modo de imagen en Fluorescencia y establezca el tiempo de exposición en automático.
    2. Practicar la eutanasia intraperitoneal a los ratones utilizando una dosis letal de Fatal-Plus (>100 mg/kg). Después de la eutanasia, desinfecte el sitio de la incisión con etanol al 70%.
    3. Usando pinzas, tire de la piel, haga una incisión desde el esternón hasta el abdomen y corte la incisión desde los lados con tijeras. Corte la vena hepática para minimizar la cantidad de sangre en los pulmones y evitar señales de fondo altas durante las imágenes.
    4. Usando tijeras, corte el esternón y abra la caja torácica. A continuación, corte el extremo de la tráquea con tijeras y retire los pulmones con pinzas.
    5. Coloque los pulmones extirpados en una placa de 6 pocillos que contenga 2 ml de 1x PBS y enjuague para eliminar el exceso de sangre. Minimizar la posibilidad de contaminación entre muestras desinfectando y limpiando las herramientas quirúrgicas entre muestras utilizando etanol al 70%.
    6. Después de inicializar la máquina IVIS, coloque los pulmones en una bandeja negra y separe los tejidos entre sí.
    7. Coloque la bandeja dentro de la cámara de aislamiento dentro del gabinete de bioseguridad y luego transfiera la cámara de aislamiento al IVIS. Cierre la puerta y haga clic en Adquirir para iniciar el sistema de imágenes (Figura 4A).
    8. Para analizar la fluorescencia, utilice la herramienta de ROI y dibuje ROI alrededor de cada uno de los pulmones individuales. Mida cada ROI manualmente y luego use los valores de eficiencia radiante promedio dados y reste los de los ratones infectados simulados (Figura 4B).
    9. Una vez que se completen las imágenes, coloque los tejidos en hielo para el análisis el mismo día o en un criotubo para la congelación de hielo seco para almacenarlos a -80 ° C para su posterior procesamiento.
  4. Imágenes de campo brillante pulmonar y puntuación de patología de ratones transgénicos K18 hACE2 infectados con rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2A-C) y rSARS-CoV-2/Venus (Figura 4A-C)
    1. Después de obtener imágenes de bioluminiscencia de ratones infectados con rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT y simulados infectados, devuelva a los ratones a sus jaulas. Proceda con la eutanasia y la imagen de campo brillante ex vivo de los pulmones de los ratones (Figura 2A).
    2. Después de obtener imágenes de la fluorescencia ex vivo de los pulmones de ratones infectados, tome imágenes de campo brillante de los pulmones (Figura 4A).
    3. Analizar las lesiones macroscópicas en la superficie del pulmón utilizando ImageJ (Figuras 2C y 4C).
    4. Abra la imagen pulmonar que se analizará en ImageJ.
    5. Calcule la relación entre píxeles y cm, utilice la herramienta Recto y mida la longitud real de la imagen.
    6. Después de seleccionar, haga clic en Analizar > medir para calcular la longitud de los píxeles para la longitud.
    7. Haga clic en Análisis > Establecer escala e ingrese los números calculados a partir del paso anterior.
    8. Utilice la herramienta Selecciones a mano alzada y seleccione toda la superficie pulmonar. Haga clic en Analizar > Medir para medir el área pulmonar total.
    9. Haga clic en Editar > Selección > Hacer inverso para seleccionar el resto del área pulmonar, luego presione eliminar o retroceso para eliminar el fondo.
    10. Elimine el área seleccionada y, a continuación, haga clic en imagen > Ajustar > umbral de color.
    11. Para seleccionar el área patológica de la lesión, ajuste el brillo a un mínimo (entre 1 a 50) y un máximo (entre 50 a 200), dependiendo de los niveles de congestión y hemorragias presentes.
    12. Una vez seleccionadas las lesiones patológicas, haga clic en Seleccionar en la parte inferior del panel de color del umbral, luego haga clic en Analizar > Medir para medir las áreas patológicas.
    13. Calcular el porcentaje de lesiones macroscópicas con la fórmula: % de área patológica = (medición del área patológica/superficie pulmonar total) x 100.
  5. Valoraciones virales (Figura 2D y Figura 4D)
    1. Tras la toma de imágenes, complete la eutanasia de los ratones y recoja los pulmones, el cerebro y la mucosa nasal.
    2. Coloque los pulmones, el cerebro y la mucosa nasal en homogeneizadores de tejido estéril separados y agregue 1 ml de PBS frío 1x.
    3. Homogeneizar las muestras centrifugando a 21.500 x g durante 10 min a los restos celulares de pellets. Recoger y transferir los sobrenadantes a un nuevo tubo estéril y desechar el pellet.
    4. Si las valoraciones virales se realizan el mismo día, guarde los sobrenadantes a 4 °C. Alternativamente, congele el sobrenadante de las muestras homogeneizadas a -80 °C hasta que se evalúe más tarde.
    5. Utilizando los sobrenadantes obtenidos de los homogeneizados tisulares se realizan diluciones seriadas 10 veces e infectan monocapas confluentes de células Vero E6 con 1 mL de cada dilución del sobrenadante (formato de placa de 6 pocillos, 1,2 × 106 células/pozo, triplicatos).
    6. Deje que el virus se adsorba durante 1 h a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 .
    7. Después de la adsorción viral, lave las células con 1 ml de 1x PBS e incube en 2 ml de medios post-infección que contengan 1% de agar en la incubadora humidificada de 5% de CO2 a 37 °C durante 72 h.
    8. Después de la incubación, inactivar las placas en formalina tamponada neutra al 10% durante 24 h a 4 °C, asegúrese de que toda la placa esté sumergida.
    9. Saque las placas de BSL3 y lave las células tres veces con 1 ml de 1x PBS y permeabilice con 1 ml de Tritón X-100 al 0,5% durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
    10. Bloquear las células con 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 2,5% en 1x PBS durante 1 h a 37 °C, seguida de incubación en 1 mL de 1 μg/mL del anticuerpo monoclonal de reactiva cruzada de la proteína nucleocápside (N) del SARS-CoV (1C7C7), diluido en BSA al 2,5% durante 1 h a 37 °C.
    11. Lave las células tres veces con 1 ml de 1x PBS y desarrolle las placas utilizando el kit ABC y el kit de sustrato DAB peroxidasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    12. Calcule los títulos virales como PFU/mL.
      NOTA: Calcule con la fórmula PFU/mL = factor de dilución x número de placas x (1 mL/volumen inóculo).
  6. Actividad de Nluc en tejidos de ratones transgénicos K18 hACE2 infectados con rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2E)
    1. Cuantificar la presencia de Nluc en los homogeneizados de órganos de ratones transgénicos RSARS-CoV-2/WT y rSARS-CoV-2/Nluc infectados con K18 hACE2 utilizando un ensayo de luciferasa siguiendo las instrucciones de los fabricantes.
  7. Evaluación de la morbilidad y mortalidad (Figura 2F, G y Figura 4E, F)
    1. Infectar por vía intranasal a ratones transgénicos K18 hACE2 hembra de 4-6 semanas de edad con 105 PFU de rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc, o simulados infectados como se describe en la sección 3.1.
    2. Monitoree y pese a los ratones durante 12 días al mismo tiempo para minimizar la variación de peso debido a la ingestión de alimentos. Sacrificar a los ratones que pierden el 25% de su peso corporal inicial ya que han alcanzado un punto final humanitario y señalar que estos ratones sucumben a la infección viral.
    3. Después de 12 días, sacrificar a los ratones que sobreviven a la infección viral y calcular el % de cambio de peso corporal y supervivencia.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Infección por rSARS-CoV-2/Nluc en ratones transgénicos K18 hACE2 (Figuras 1 y 2)
La Figura 1A muestra una representación esquemática de rSARS-CoV-2/WT (arriba) y rSARS-CoV-2/Nluc (abajo) utilizada para evaluar infecciones in vivo. La Figura 1B muestra el diagrama de flujo esquemático aplicado para evaluar la dinámica de la infección por rSARS-CoV-2/Nluc en ratones transgénicos K18 hACE2....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Este protocolo demuestra la viabilidad de utilizar estos genes reporteros que expresan rSARS-CoV-2 para monitorear infecciones virales in vivo. Ambos virus recombinantes que expresan reporteros proporcionan una excelente herramienta para estudiar las infecciones por SARS-CoV-2 in vivo. Los sistemas de imágenes ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) descritos representan una excelente opción para comprender la dinámica de la infección por SARS-CoV-2, la patogénesis vir...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier conflicto de intereses comercial, financiero y no financiero, o personal en relación con el trabajo descrito.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a los miembros de nuestro instituto (Instituto de Investigación Biomédica de Texas) por sus esfuerzos para mantener nuestras instalaciones completamente operativas y seguras durante la pandemia de COVID-19. También nos gustaría agradecer a nuestro Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) y hechizo (IACUC) por revisar nuestros protocolos de una manera eficiente en el tiempo. Agradecemos al Dr. Thomas Moran de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai por proporcionar el anticuerpo monoclonal de la proteína 1C7C7 (N) de reactiva cruzada del SARS-CoV. La investigación del SARS-CoV-2 en el laboratorio de Martínez-Sobrido cuenta actualmente con el apoyo de las subvenciones del NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 y R43AI165089-01; el Departamento de Defensa (DoD) otorga W81XWH2110095 y W81XWH2110103; la Asociación de San Antonio para La Terapéutica de Precisión; el Foro del Instituto de Investigación Biomédica de Texas; el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio; la Fundación Médica San Antonio; y por el Centro de Investigación sobre Patogénesis y Transmisión de la Influenza (CRIPT), un Centro de Excelencia para la Investigación y Respuesta a la Influenza financiado por el NIAID (CEIRR, contrato # 75N93021C00014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.5% Triton X-100J.T.BakerX198-07Almacenamiento a temperatura ambiente (RT)
1% DEAE-DextranMP Biomedicals195133
10% Solución de formalina, tamponada neutraSigma-AldrichHT501128
AgarOxoidLP0028
Placa de cultivo celular de 24 pocillosGreiner Bio-one662160
Bicarbonato de sodio al 5%Sigma AldrichS-5761
Placa de cultivo celular de 6 pocillosGreiner Bio-one657160
Placa de cultivo celular de 96 pocillosGreiner Bio-one655-180
Células epiteliales de riñón de mono verde africano (Vero E6)ATCCCRL-1586
Ami HTSpectral Instruments Imaging
Aura Software de imagen 3.2.0Spectral Instruments ImagingSoftware de análisis de imágenes
Albúmina sérica bovina (BSA), 35%Sigma-AldrichA9647Tienda en 4 ° C
Agua de grado de cultivo celularCorning25-055-CV
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVTienda a 4 ° C
Máquina de gas de anestesiaSistemas de anestesia veterinaria, Inc.VAS 2001R
Suero Fetal Bovino (FBS)Seradigm1500-050Tienda en -20 ° C
Ratones transgénicos hembra K18-hACE2 de cuatro a seis semanas de edadThe Jackson Laboratory34860
Prisma Graphpad Versión 9.1.0GraphPad
IsofluranoBaxter1001936040Tienda en RT
MARS Software de análisis de datosBMG LABTECH
MB10 tabletasQUIP LaboratoriesMBTAB1.5Tienda en RT
Reactivo de ensayo de luciferasa Nano-GloPromegaN1110Este reactivo se utiliza para medir la actividad de Nluc. Almacenar a -20 ° C
Nunc MicroWell MicroWell de 96 pocillos Microplacas ThermoFisherScientific269620
Nunc MicroWell MicroPlacas de 96 pocillosThermoFisher Scientific269620
Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) 100xCorning30-009-CIAlmacene a -20 & grados; C
PHERAstar FSXBMG LABTECHPHERAstar FSX
Precelleys Homogeneizador EvolutionBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
Homogeneizador de tejidos blandos CK14 – 7 mLBertin InstrumentsP000940-LYSK0-A T75
EasYFlaskThermoFisher Scientific156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, PeroxidasaKitPK-4002 ABC dey kit de sustrato de peroxidasa DAB
Vector Laboratories

Referencias

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423(2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309(2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611(2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280(2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12(2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168(2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Infecci n por SARS CoV 2ratones K18 hACE2SARS CoV 2 reporteroimagen por bioluminiscenciaimagen por fluorescenciacuantificaci n viralseguimiento viralimagen in vivoreplicaci n viral
Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.